Trong phần 2 này chúng ta sẽ đến với các bài báo như sau: 1. GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI: CUỘC CÁCH MẠNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC 2. CẬP NHẬT KHẢ NĂNG CÁC XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIÊM GAN SIÊU VI MẠN TÍNH
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Tổng Quan GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI: CUỘC CÁCH MẠNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC NEXT GENERATION SEQUENCING: THE REVOLUTION IN DIAGNOSIS AND BIO-MEDICAL RESEARCH Phạm Hùng Vân*, Nguyễn Đỗ Phúc** TỪ GIẢI TRÌNH TỰ SANGER Giải trình tự tìm thứ tự xếp Hình 1: Hai giai đoạn giải trình tự Sanger đoạn gene (DNA) với giai đoạn đầu giai đoạn phản ứng giải trình tự giai đoạn kế giai đoạn điện di giải trình tự (P.H.Vân vẽ 2012) loại nucleotide A, T, C G đoạn DNA Kỹ thuật giải trình tự Sanger gồm hai giai đoạn: (1) Giai đoạn đầu gọi giai đoạn phản ứng giải trình tự dùng enzyme polymerase để nhân đoạn DNA muốn giải Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh ** Viện Vệ sinh – Y tế Công cộng thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ts.Bs.Phạm Hùng Vân ĐT: 0903698920 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 trình tự thành đoạn cách biệt có nucleotide tận đầu 3’ nucleotide tận nhận diện nhờ kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang nucleotide tận hay đánh dấu huỳnh quang mồi; (2) Giai đoạn kế gọi giai đoạn điện di giải trình tự dùng điện di độ phân giải cao (điện di gel polyacrylamide hay diện di mao quản) để xếp đoạn trình tự dài ngắn khác theo kích thước (ngắn trước, dài sau dù cách có nucleotide) nhờ thứ tự mà biết thứ tự xếp nucleotide trình tự đoạn DNA giải trình tự (hình 1) Kể từ phát minh F Sanger vào năm 1977 đến nay(11,12,10), kỹ thuật giải trình tự Sanger có bước tiến vượt bậc hóa chất cho phản ứng giải trình tự thiết bị cho điện di giải trình tự mà kỹ thuật giải trình tự triển khai dễ dàng phịng thí nghiệm, kể phịng thí nghiệm lâm sàng(5) Khơng vậy, ứng dụng giải trình tự khơng nghiên cứu mà chẩn đoán Xin kể số công dụng giải trình tự(5): (1) Giải trình tự để biết trình tự nucleotide đoạn DNA sở để nhà khoa học giải trình tự gene hay gen cho nghiên cứu có liên quan; (2) Giải trình tự để phát thay đổi trình tự nucleotide đoạn DNA sở để phát đột biến gene (liên quan đến ung thư, đến kháng thuốc), SNP (trong cá nhân hóa liệu pháp điều trị), kiểu gene (genotype virus gây bệnh)…; (3) Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa giải trình tự DNA gene qui định RNA ribosome (16S vi khuẩn 28S vi nấm) đặc biệt tác nhân khó định danh hay thất bại ni cấy từ mẫu thử; (4) Ngồi cơng nghệ điện di độ phân giải cao đặc biệt công nghệ điện di mao quản tự động sử dụng giải trình tự cịn áp dụng phân tích đoạn (fragment analysis) tức phân tích để phân biệt đoạn DNA có kích thước khác biệt vài nucleotide áp dụng sử dụng xét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA finger printing) để nhận dạng cá nhân mối quan hệ cá nhân (pháp y), chẩn đoán tiền sanh, phát đa dạng lồi… ĐẾN PYROSEQUENCING Khác với giải trình tự Sanger kỹ thuật giải trình tự phải có hai giai đoạn giai đoạn giải trình tự thực sau phản ứng giải trình tự; Trong pyrosequencing, giải trình tự thực giai đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khn giải trình tự, nghĩa tổng hợp sợi DNA bổ sung đến đâu giải trình tự đến mà khơng phải chờ sau tổng hợp sợi bổ sung đem điện di để giải trình tự Pyrosequencing Pål Nyrén Mostafa Ronaghi Viện Kỹ Thuật Hoàng Gia Thuỵ Điển phát minh năm 1996(4,8,7) Nguyên tắc kỹ thuật giải trình tự pyrorequencing ghi nhận tín hiệu phát quang từ giếng phản ứng sợi bổ sung dựa sợi khuôn kéo dài nucleotide Để làm điều này, Hình 2: Nguyên tắc kỹ thuật pyrosequencing (Hình từ Internet) Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 dung dịch chứa loại nucleotide A, hay T, hay C, hay G lập trình vào giếng phản ứng (có chứa đoạn DNA muốn giải trình tự, mồi giải trình tự, thành phần cho phản ứng tổng hợp sợi khuôn); dung dịch nucleotide cho vào với nucleotide bắt cặp vào sợi khn để tổng hợp sợi bổ sung pyrophosphate (PPi) phóng thích để enzyme sulfurylase tạo ATP, ATP giúp hệ thống phát quang luciferin-luciferase (cũng cho vào lúc) phát ánh sáng men luciferase oxide hóa luciferin thành oxyluciferin phát ánh sáng (hình 2) Với ghi nhận tín hiệu phát quang từ ống phản ứng theo trình tự bổ sung dung dịch loại nucleotide, thiết bị pyrosequencing dịch trình tự nucleotide đoạn DNA giải trình tự Do ATP sử dụng để làm hệ thống luciferin-luciferase phát quang nên dung dịch dNTP cho vào giếng phản ứng, dATP-S sử dụng để thay dATP dATP-S khơng có hoạt tính ATP Ngồi ra, để huỷ ATP nucleotide tự cịn thừa Bình thường: GCT GGT GGC G Đột biến: GCT GG/AT GGC G Kết phát hiện: G (50%), A (50% Tổng Quan sau lần bổ sung nucleotide, men apyrase cho vào giếng phản ứng sau tín hiệu phát quang ghi nhận Pyrosequencing bước ngoặc kỹ thuật giải trình tự, cho phép giải trình tự trình tổng hợp sợi bổ sung cho đoạn DNA giải trình tự, pyrosequencing cơng nghệ khởi đầu cho kỹ thuật giải trình tự tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS), tảng kỹ thuật giải trình tự gene hay gọi kỹ thuật giải trình tự hệ (next generation sequencing) sau Với ưu thời gian giải trình tự nhanh, trình tự giải xác, cường độ phát quang định lượng nên dù trình tự giải đuợc khơng dài (khơng q 100 bases) pyrosequencing có nhiều ứng dụng có ưu kỹ thuật giải trình tự Sanger, đặc biệt phát định lượng đột biến áp dụng quan trọng chẩn đoán, tiên đoán dự hậu định điều trị đích phân tử ung thư(1,6) Bình thường: GCT GGT GGC G Đột biến: GCT GG/AT GGC G Kết phát hiện: G (67%), A (33% Hình : Kết phát định lượng đột biến KRAS với hình bên trái tỷ lệ đột biến codon 12 (GGT thành GAT) 50% cường độ phát quang G gấp 150% so với cường độ phát quang bình thường cịn cường độ phát quang A đạt 50% bình thường hình bên phải tỷ lệ đột biến 33% cường độ phát quang G gấp 167% so với cường độ phát quang bình thường cịn cường độ phát quang A đạt 33% bình thường (Hình từ Internet) Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Hình ví dụ cho thấy pyrosequencing phát tỷ lệ đột biến KRAS mà kỹ thuật giải trình tự Sanger khơng thể làm cường độ huỳnh quang ghi nhận Sanger khơng định lượng Hiện có nhiều thuốc thử chấp nhận IVD (In-Vitro Diagnosis) phát đột biến gene ung thư liên quan đến định theo dõi điều trị đích, định lượng CpG với C bị gắn methyl (Cytosine methylation) để tiên đoán ung thư, phát đột biến gene chẩn đoán sàng lọc bệnh di truyền, đặc biệt vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn Ngoài ra, kỹ thuật pyrosequencing kỹ thuật mở cho phép nhà nghiên cứu thiết kế qui trình pyrosequencing cho mục đích khác tùy theo đề án Chính vừa kỹ thuật mở, vừa có sẵn thuốc thử thương mại, pyrosequencing kỹ thuật khơng thể thiếu phịng thí nghiệm sinh học phân tử vừa sử dụng cho dịch vụ chẩn đoán lâm sàng, vừa làm công cụ cho nghiên cứu Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tổng Quan Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Tách rời tóm bắt mảnh DNA giải trình tự lên giá bám Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone Thực giải trình tự tổng hợp (SBS) Hình 4: Ba giai đoạn giải trình tự hệ (1) Tách rời tóm bắt mảnh DNA giải trình tự lên giá bám; (2) Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone; (iii) Thực giải trình tự tổng hợp (P.H Vân vẽ 2012) Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Giải trình tự hệ – bước tiến nhảy vọt công nghệ Đây cách mạng cơng nghệ giải trình giải trình tự Sanger cho phép giải trình tự khơng q 1500bps, hay pyrosequencing khơng q 100bps, giải trình tự hệ cho phép giải từ 8Gbases đến 600Gbases, có nghĩa cho phép giải trình tự ngun gene Do giải trình tự hệ cịn gọi giải trình tự gene (whole genome sequencing) Về nguyên tắc hoạt động, kỹ thuật giải trình tự hệ giải trình tự tổng hợp (SBS) bao gồm giai đoạn sau (hình 4): (1) Tách rời tóm bắt mảnh DNA giải trình tự lên giá bám: Trước hết DNA gene bẻ gãy thành mảnh DNA ngắn nhờ siêu âm hay nhờ khí dung, sau mảnh DNA ngắn gắn vào hai đầu đoạn trình tự ngắn gọi adapter (có hai loại: có trình tự nhận biết đoạn dò gắn giá bám, nhận biết trình tự mồi PCR) Các mảnh DNA tóm bắt giá bám hạt nano (Roche hay ABI) hay vi (Illumina) nhờ đoạn dò đặc hiệu adapter gắn sẵn giá bám Phải pha loãng mảnh DNA gắn adapter nồng độ thích hợp để giá bám vi hạt đa số có mảnh DNA tóm bắt hay giá bám vi mảnh DNA bị tóm bắt phải cách xa (2) Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone: Nếu giá bám vi thuốc thử PCR bơm trải lên vi thực PCR có clone sản phẩm khuếch đại tóm bắt vị trí tách rời vi bản; giá bám vi hạt phải nhủ hoá thuốc thử PCR để đa số giọt nhủ chứa vi hạt nhờ mà thực PCR vi hạt có clone sản phẩm khuếch đại bám lên Sau giải bỏ dạng nhủ dịch, vi hạt bơm vào chip có chứa hàng chục ngàn Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tổng Quan đến hàng trăm ngàn giếng kích thước nano gọi nano-well kích thước cho phép nano-well chứa vi hạt mà (3) Thực giải trình tự tổng hợp: Nguyên tắc giai đoạn thực giải trình tự gần giống nguyên tắc pyrosequencing, nhiên có số điểm khác biệt, là: (i) Thay phải huỷ bỏ thành phần A T, C, G thuốc thử cho vào giếng phản ứng trước cho thuốc thử vào pyrosequencing giải trình tự hệ mới, thuốc thử giải trình tự thổi chảy vào chip nano-well hay vi theo chương trình sau ghi nhận tín hiệu thuốc thử cũ thổi chảy để thuốc thử lại bơm vào (ii) Tín hiệu tổng hợp ghi nhận sau lần bơm thuốc thử vào tín hiệu phát quang dựa hệ thống luciferinluciferase (454 Roche)(3,13), tín hiệu điện thay đổi pH (Ion-Tolent hay Ion-Proton ABI)(9), tín hiệu huỳnh quang đánh dấu nucleotide A, T, C hay G (Solexa Illumina)(2), tín hiệu huỳnh quang gắn lên probe (solid ABI)(14) (iii) Tổng hợp mạch bổ sung dựa mạch khuôn kéo dài đầu 3’ mạch bổ sung nucleotide (A, T, C hay G) nucleotide kéo dài có tín hiệu phát quang (Roche) hay huỳnh quang (Illumina) ghi nhận, kéo dài đầu 3’ mạch bổ sung lần base nhờ kéo dài nối probe dựa sợi khuôn tổng hợp base có tín hiệu huỳnh quang ghi nhận (Solid ABI) Thứ tự lần thổi thuốc thử giải trình tự vào chip nano-well hay vào vi máy tính ghi lại đồng thời với thứ tự cường độ tín hiệu tổng hợp sợi bổ sung clone DNA bám lên vi hay vi hạt, nhờ mà giải trình tự mảnh DNA clone bám vi hay vi hạt Vì có đến hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn clone nên có hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn trình tự giải tương ứng với hàng chục Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 ngàn đến hàng trăm ngàn mảnh DNA từ gene giải Các trình tự mảnh DNA giải phần mềm thiết bị nối lại với cách so chuỗi tìm trình tự trùng lặp hai đầu có kết trình tự ngun gene mà cần vài ngàn dolla Đối với giải trình tự gene vi khuẩn hay virus giải trình tự hệ thực cách dễ dàng với thiết bị có cơng suất nhỏ khoảng đến 10Gbases không cần phải đến hàng trăm Gbases Giải trình tự hệ ứng dụng cách mạng chẩn đoán nghiên cứu Giải trình tự hệ cơng cụ mạnh để phát tác nhân nhiễm trùng bí mật với khả giải hàng trăm ngàn mảnh DNA có mẫu thử công nghệ dễ dàng lôi ánh sáng trình tự nucleic acid tác nhân có mặt mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân Giải trình tự hệ thật cách mạng công nghệ giải trình tự nói riêng cơng nghệ sinh học phân tử nói chung Với tiến thiết bị thuốc thử, giải trình tự gene cá nhân khơng cịn nghiên cứu thực trung tâm giải trình tự lớn giới mà thực phịng thí nghiệm trung bình có thiết bị giải trình tự hệ solid, solexa, ion-proton, 454…và thời gian để có kết kéo dài đến hàng năm mà vài ngày, chí 24 với giá thành khơng phải đến hàng triệu dolla Giải trình tự hệ công cụ nhạy cảm để phát đột biến cho dù tỷ lệ đột biến diện mẫu thử thấp, vài đột biến quần thể khơng đột biến, giải trình tự hệ công cụ thiếu phát định lượng đột biến ung thư, bệnh di truyền… Adapter có barcode Gắn adapter Gắn adapter PCR với mồi gắn barcode đầu 5’ Sản phẩm đưa vào SBS đánh dấu barcode Hình 5: Hai cách đánh dấu barcode mảnh DNA (sản phẩm PCR) trước đưa vào SBS (giải trình tự tổng hợp)(P.H.Vân vẽ 2012) Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Một ứng dụng đặc biệt giải trình tự hệ mới, chẩn đốn tiền sanh phát dị bội thai nhi phân tích DNA bào thai diện máu mẹ dựa ưu điểm độ nhạy cao kỹ thuật Chính nhờ ứng dụng mà tương lai chẩn đoán tiền sanh phát dị bội thai nhi khơng cịn xét nghiệm xâm lấn phải lấy mẫu chọc nước ối mà cần xét nghiệm máu mẹ mà thơi Ngồi ra, câu hỏi mà nhiều nhà nghiên cứu đặt liệu SBS giải trình tự sản phẩm PCR để phát đột biến hay khơng liệu SBS phân biệt trình tự giải sản phẩm PCR nào? Câu hỏi thật kỹ thuật barcode (mã vạch) SBS giải quyết, gắn lên adapter mã vạch thứ tự biết nucleotide (A, T, C, G) hay sử dụng mồi có có đầu 5’ thêm trình tự barcode biết nucleotide, nhờ mà với hỗn hợp nhiều sản phẩm PCR giải trình tự SBS, nhờ trình tự nucleotide barcode, nhận diện trình tự giải sản phẩm PCR (hình 5) Chính có nhiều ứng dụng khơng nghiên cứu mà chẩn đoán phục vụ nhiều khoa lâm sàng khác nên Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tổng Quan thiết phải trang bị thục kỹ thuật giải trình tự hệ TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 Baysal BE et al (2004) Analysis of CHEK2 gene for ovarian cancer susceptibility Gynecol Oncol, Oct 2004; 95(1): 62-69 Mardis ER (2008) "Next-generation DNA sequencing methods" Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387–402 Margulies M, Egholm M, Altman WE et al (2005) "Genome Sequencing in Open Microfabricated High Density Picoliter Reactors" Nature 437 (7057): 376–80 Nyrén, P (2007) "The History of Pyrosequencing" Methods Mol Biology 373: 1–14 Phạm Hùng Vân (2009) PCR real-time PCR – Những vấn đề áp dụng thường gặp Nhà Xuất Bản Y Học Poehlmann, A.et al (2007) "K-ras mutation detection in colorectal cancer using the Pyrosequencing technique."Pathol Res Pract.203, 489-97 Ronaghi et al.; Karamohamed, S; Pettersson, B; Uhlén, M; Nyrén, P (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release" Analytical Biochemistry 242 (1): 84–9 Ronaghi et al.; Uhlén, M; Nyrén, P (1998-07-17) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate" Science 281 (5375): 363 Rusk, N (2011) "Torrents of sequence." Nat Meth 8(1): 4444 Sanger F (8 Dec 1980) Determination of nucleotide sequences in DNA Nobel lecture Sanger F, Coulson AR (1975) "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase" J Mol Biol 94 (3): 441–8 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors" Proc Natl Acad Sci U.S.A 74 (12): 5463–7 Schuster SC (2008) "Next-generation sequencing transforms today's biology" Nat Methods (1): 16–8 Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T et al (July 2008) "A highresolution, nucleosome position map of C elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning" Genome Res 18 (7): 1051–63 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 CẬP NHẬT KHẢ NĂNG CÁC XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIÊM GAN SIÊU VI MẠN TÍNH UPDATE THE POSSIBILITIES OF THE MOLECULAR TESTINGS IN CHRONIC VIRAL HEPATITIS Phạm Hùng Vân*, Võ Đức Xuyên An** XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIÊM GAN B Xét nghiệm phát định lượng HBVDNA Đa số người bị nhiễm virus viêm gan B có đáp ứng miễn dịch bảo vệ, tức tạo kháng thể chống HBsAg (gọi antiHBsAg) tiêu diệt virus viêm gan B Người thử máu dương tính antiHBsAg Tuy nhiên có số người hệ miễn dịch lại tạo kháng thể bảo vệ nên thử máu lúc dương tính với HBsAg Trong thể người có đấu tranh qua lại hệ miễn dịch virus Nếu hệ miễn dịch cân hay ưu kiềm hãm khơng cho virus nhân thành virus hoàn chỉnh mà khơng có hay có virus hồn chỉnh vào máu Những trường hợp gọi người lành mang virus, thử máu thấy HBsAg dương tính dấu hiệu cho thấy có virus hồn chỉnh HBV-DNA, tức acid nhân virus, thường âm tính hay dương tính với số lượng (số copies) thấp (105) Chính mà bị chẩn đốn bị viêm gan B mạn tính (tiêu chuẩn chẩn đoán HBV-DNA 105 copies/ml, ALT cao gấp lần bình thường hay xét nghiệm sinh thiết fibroscan thấy tổ chức gan bị tổn thương) thiết phải điều trị đặc hiệu để kiềm chế không cho virus nhân để gây tổn thương gan Nhiều nghiên cứu cho thấy không điều trị để khống chế số lượng virus hoàn chỉnh máu bệnh nhân ln ngưỡng phát nguy xơ gan hay ung thư gan người cao(22,8,21) Thời gian điều trị thuốc kháng virus kéo dài nhiều năm nhà y học đạt đến thành công khống chế virus không cho nhân loại trừ virus(22,8,21) chúng tồn tế bào gan 11 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 dạng cccDNA (covalently closed circular DNA) không bị tác động thuốc kháng virus Do phải điều trị thuốc kháng virus thời gian dài nên virus có hội tiếp xúc với thuốc kháng virus chúng có hội bị đột biến để kháng thuốc Do thời gian điều trị, xét nghiệm theo dõi virus HBVDNA nhiên bị trở lại dương tính lượng HBV-DNA bị tăng lên dần dấu hiệu cho biết virus có khả kháng lại thuốc điều trị Lúc cần phải xét nghiệm để phát xem thuốc có bị virus đề kháng không? Hiện công ty Nam Khoa phát triển phương pháp giải trình tự đoạn gen 700bases vùng gene rt virus để phát tất điểm đột biến giúp virus kháng lamivudine, adefovir, entecavir tenofovir(2) Có thể ví kỹ thuật kỹ thuật làm kháng sinh đồ dành cho HBV, vượt trội nhiều kỹ thuật khác phát đột biến cho thuốc kháng virus một, mà cung cấp cho bác sĩ nhiều thông tin định xác liệu có nên thay đổi thuốc không Xét nghiệm phát đột biến precore core promoter Trong gen (DNA) virus viêm gan B có gene gọi gene tiền lõi, mã hóa thơng tin di truyền giúp virus sinh kháng nguyên e (HBeAg) kháng nguyên virus tiết ngồi nhân Do máu bệnh nhân có xuất HBeAg có nghĩa có nhân virus thể Nếu bệnh nhân điều trị thuốc kháng virus virus bị chặn lại không nhân đồng thời hệ thống miễn dịch nhận diện HBeAg bệnh nhân có hội phát triển mà máu bệnh nhân xuất kháng thể chống HBeAg (gọi antiHBeAg) Trường hợp y học gọi có chuyển đổi huyết chứng minh hệ miễn dịch thắng với kết xét nghiệm cho thấy HBeAg trở nên âm tính, anti-HBeAg dương tính, HBV-DNA khơng phát hay 12 phát số lượng thấp Tuy nhiên bệnh nhân bị viêm gan B mạn tính, q trình đấu tranh virus với hệ miễn dịch thể thúc đẩy virus viêm gan B có nguy tạo đột biến vùng precore (codon 1896) tạo nên mã kết thúc gene hay đột biến vùng core promoter (codon 1762 hay 1764) mà virus tổng hợp kháng nguyên HbeAg(17), lúc virus gọi bị đột biến precore và/hay core promoter Đột biến precore, đặc biệt đột biến core promoter(4,16,18,26,47) có liên hệ cao với nguy ung thư gan bệnh nhân viêm gan B mạn tính, bệnh nhân viêm gan B mạn điều trị với thuốc kháng virus, kết xét nghiệm cho thấy HBeAg âm tính, AntiHBeAg dương tính, HBVDNA lại xuất dương tính, đồng thời men gan trồi sụt thất thường, dấu hiệu báo động nguy virus đột biến precore và/hay core promoter Trong trường này, cho định xét nghiệm phát đột biến precore/core promoter cần thiết Xét nghiệm phát đột biến precore/core promoter công ty Nam Khoa thực giải trình tự với nguyên tắc dùng PCR khuếch đại đoạn dài 250 bases vùng gene preC chứa vị trí (1762, 1764 1896) giải trình tự trực tiếp để phát xem có đột biến vị trí hay khơng (40) Một kết phát có đột biến precore và/hay core promoter bệnh nhân bắt buộc bệnh nhân phải điều trị suốt đời hay điều trị HBsAg biến Xét nghiệm định lượng HBsAg Thuốc kháng virus giải pháp giúp điều trị khỏi hẳn bệnh bệnh nhân viêm gan B mạn tính Do nhà điều trị trơng chờ liệu pháp interferon có nhiều chứng y học cho thấy interferon phối hợp với thuốc kháng virus giúp loại trừ HBV vĩnh viễn khỏi bệnh nhân chứng minh qua biến HBsAg máu, tức xét nghiệm HBsAg trở nên âm tính Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 trình điều trị Tuy nhiên bệnh nhân điều trị liệu pháp có kết khỏi bệnh Chính phải có xét nghiệm giúp theo dõi để tiên đoán hiệu điều trị interferon Xét nghiệm phát định lượng HBV-DNA khơng thể làm điều sau điều trị thời gian ngắn HBV-DNA máu bệnh nhân trở nên âm tính Các nhà nghiên cứu cho thấy có liên hệ rõ ràng thay đổi lượng kháng nguyên HBsAg máu bệnh nhân với hiệu điều trị interferon Nếu trình điều trị, lượng HBsAg máu giảm cách có ý nghĩa chứng minh liệu pháp interferon có hiệu bệnh nhân (10,20) Chính nhờ phát mà xét nghiệm miễn dịch cổ điển xét nghiệm HBsAg quay trở lại thành xét nghiệm thiếu bác sĩ muốn định điều trị interferon kết hợp thuốc kháng virus bệnh nhân viêm gan B mạn tính Dù xét nghiệm cổ điển phải có kết định lượng theo IU (đơn vị quốc tế) nên có vài hệ thống kín chấp nhận thực lý xét nghiệm định lượng HBsAg đắt so với xét nghiệm miễn dịch thơng thường khác định tính HBsAg, anti-HBsAg, HBeAg, antiHBeAg, anti-HBcAg… Xét nghiệm định lượng cccDNA sinh thiết gan hay máu Ngay sau HBV-DNA vào nhân tế bào gan, cccDNA thành lập trở thành chất liệu di truyền để từ phiên mã thành gene điều khiển tổng hợp thành phần cấu trúc chức HBV Sự phát định lượng cccDNA có ý nghĩa chứng minh hiệu điều trị đặc hiệu thuốc kháng virus hay interferon có loại trừ virus khỏi bệnh nhân hay không (46)] Về ngun tắc cccDNA tìm thấy tế bào gan, nhiên cccDNA tìm thấy máu Xét nghiệm real-time PCR Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tổng Quan định lượng cccDNA(34) sinh thiết gan huyết có khả trở thành xét nghiệm cần thiết để đánh giá hiệu điều trị đặc hiệu thuốc kháng virus interferon bệnh nhân Xét nghiệm xác định kiểu gene HBV Trước nhà nghiên cứu phải dựa dấu ấn kháng nguyên bề mặt (HBsAg) HBV để phân biệt nhóm HBV Ngày nhờ hiểu biết cặn kẽ trình tự gene HBV, nhà nghiên cứu phân genotype khác (A-I)(23,24,27,28) Sự phân bố genotype tùy thuộc vào địa dư, ví dụ Mỹ genotype chủ yếu A, C sau B(23), cịn Việt Nam chủ yếu C đến B(12,11,37,38,43) Genotype HBV liên quan nhiều đến tiến triển bệnh, đột biến kháng thuốc Nhiều nghiên cứu cho thấy genotype C có dự hậu kém, đáp ứng với thuốc kháng virus, nguy đột biến core promoter cao nguy ung thư gan cao genotype B(7) Do ý nghĩa nên nhiều nhà lâm sàng cho định xét nghiệm xác định genotype HBV TS Kenji Abe Viện Nghiên Cứu Bệnh Nhiễm Tokyo phát triển kỹ thuật nested multiplex PCR để xác định genotype HBV áp dụng phịng thí nghiệm có phương tiện PCR(24) Đối với phịng thí nghiệm có phương tiện giải trình tự phịng thí nghiệm cơng ty Nam Khoa ngồi phương pháp Kenji Abe, xây dựng xét nghiệm vừa phát đột biến precore/core promoter vừa xác định genotype (40), hay xét nghiệm vừa phát đột biến kháng thuốc vừa xác định genotype dựa sở giải trình tự phát đột biến muốn tìm sau so chuỗi gene bank với chương trình blast search để xác định genotype trình tự giải được(2,43) Với giải pháp bác sĩ khơng cần cho định tìm genotype có thơng tin genotype kèm với kết phát đột biến precore/core promoter hay đột biến kháng thuốc Ngồi ra, để giúp phịng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR 13 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 có khả thực xét nghiệm định type HBV, công ty Nam Khoa phát triển kỹ thuật real-time multiplex PCR (không cần nested-PCR) dựa cặp mồi thiết kế Kenji Abe Kỹ thuật đạt độ nhạy tương đương nested multiplex PCR Kenji Abe có ưu điểm dễ dàng thực hiện, phân tích kết mà khơng cần phải điện di (hình 1), tránh nguy ngoại nhiễm khơng cần phải thực nested PCR Hiện kỹ thuật real-time multiplex PCR công ty Nam Khoa phát triển phổ biến rộng rãi đến phịng thí nghiệm lâm sàng có thiết bị real-time PCR Hình 1: Hình minh họa cách đọc kết quả: Type B đỉnh chảy 84oC; Type C đỉnh chảy 82oC, âm nghiệm đỉnh chảy 76oC Xét nghiệm phát đột biến đoạn gene PreS2 Xét nghiệm phát đột biến trốn thoát vaccine HBV TS Kenji Abe phát mẫu ung thư gan lấy từ bệnh nhi bị ung thư gan Việt Nam có tỷ lệ cao phát HBVDNA, có đến 36% có đột biến đoạn gene PreS2 Đột biến xác định có vai trị ung thư gan (15) qua cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Đài Loan, nhóm nghiên cứu gây ung thư gan thực nghiệm chuột(33,45) Với chứng này, nhà y học phải quan tâm đến xét nghiệm truy tầm đột biến đoạn PreS2 bệnh nhân viêm gan B mạn tính để phát sớm nguy ung thư gan Công ty Nam Khoa với hợp tác TS Kenji Abe xây dựng thành công kỹ thuật PCR giải trình tự để phát đột biến gây ung thư quan trọng sẵn sàng hợp tác nhà nghiên cứu điều trị để có nghiên cứu rộng nguyên ung thư gan, thống kê ung thư hàng đầu Việt nam Một người chích ngừa viêm gan B có kháng thể bảo vệ (anti-HBsAg) có nguy nhiễm HBV dẫn đến viêm gan mạn tính cao sau chủng ngừa họ bị nhiễm chủng virus mang đột biến trốn thoát vaccine Chủng đột biến trốn vaccine có đột biến codon 145 (Gly145Arg/Lys) đột biến mà virus thay đổi tính kháng nguyên epitope “a” để trốn thoát khả bảo vệ kháng thể chống HBsAg nhờ mà nhiễm bệnh nhân gây bệnh(3,14,13) 14 Với vị trí đột biến xác định với chế gây bệnh rõ ràng vậy, cho nhà điều trị nghiên cứu phải quan tâm đến vấn đề phát đột biến trốn thoát vaccine bệnh nhân tồn song song huyết vừa anti-HBsAg vừa HBsAg, hay bệnh nhân sau chủng ngừa mà tự nhiên lại xuất HBsAg biến anti-HBsAg TS Kenji Abe phòng thí Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Tổng Quan nghiệm công ty Nam Khoa sẵn sàng để hổ trợ nghiên cứu Hình 2: Bộ gene HBV vùng đích mà dựa vào xét nghiệm sinh học phân tử triển khai phịng thí nghiệm NK-BIOTEK XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIÊM GAN C Xét nghiệm phát định lượng HCVRNA Một người bị nhiễm virus viêm gan C thường hệ miễn dịch người tạo miễn dịch bảo vệ chống virus, xuất kháng thể đặc hiệu HCV (antiHCV) khơng có ý nghĩa thể có miễn dịch bảo vệ loại trừ virus Chỉ có số may mắn khỏi nhờ hệ thống chống đỡ không đặc hiệu khác thể loại Chun Đề Y Tế Cơng Cộng trừ virus, cịn lại đa số trường hợp, virus tồn tại, nhân tế bào gan phóng thích virus vào máu Do để xác định người có bị nhiễm HCV hay khơng, bác sĩ phải cho định làm xét nghiệm phát định lượng HCVRNA, tức tìm định lượng virus viêm gan C máu Nếu xét nghiệm cho kết HCV-RNA dương tính có nghĩa máu bệnh nhân có diện virus viêm gan C, tức bệnh nhân bị nhiễm HCV Xét nghiệm phát định lượng HCV-RNA xét nghiệm sinh học phân tử, 15 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 thông thường thực kỹ thuật real-time PCR Do gene HCV RNA, để làm xét nghiệm, RNA virus sau tách chiết từ máu bệnh nhân phải phiên mã ngược (reverse transcription) thành DNA bổ sung, gọi cDNA, trước thực real-time PCR để phát định lượng Chính xét nghiệm gọi cách xác RT-qPCR (RT reverse transcription) Cũng giống xét nghiệm qPCR phát định lượng HBVDNA, có nhiều phịng xét nghiệm Việt Nam thực xét nghiệm sinh học phân tử dựa hệ thống mở kỹ thuật PCR Cũng hệ thống mở nên kiểm sốt chất lượng phải phịng xét nghiệm quan tâm để tránh sai lầm trình làm xét nghiệm, tức phải ln ln làm xét nghiệm với chứng chuẩn để kiểm soát nguy sơ sót xảy q trình làm xét nghiệm chúng tơi trình bày xét nghiệm phát định lượng HBV-DNA trên(39,41) Một người sau nhiễm virus viêm gan C thường khơng có triệu chứng hay có triệu chứng khơng đặc hiệu mơ hồ Tuy nhiên virus âm thầm xâm nhập nhân tế bào gan trình diễn tiến lâu, hàng chục năm, làm tế bào gan bị tàn phá dần dần, gây hậu viêm gan mạn tính đến xơ gan, từ xơ gan dẫn đến ung thư gan Nguy người bị nhiễm HCV dẫn đến viêm gan mạn tính xơ gan đến ung thư gan cao (có thể 1720%) Do vậy, khác với nhiễm virus viêm gan B cần phải xác định bị viêm gan B mạn tính (ALT tăng cao hay có bất thường tổ chức gan phát qua sinh thiết hay fibroscan) cần phải điều trị đặc hiệu; người bị xác định nhiễm virus viêm gan C nên định điều trị đặc hiệu mà không cần phải có dấu hiệu chứng minh gan bị thương tổn viêm gan mạn tính Tuy nhiên trước điều trị, bệnh nhân phải thiết định 16 làm hai xét nghiệm: định lượng HCV-RNA định genotype HCV để bác sĩ theo dõi hiệu điều trị định thời gian điều trị đặc hiệu(25,31) Chỉ cần tháng sau điều trị đặc hiệu liệu pháp interferon phối hợp với ribavirin, bác sĩ nên cho lại định phát định lượng HCV-RNA để xác định bệnh nhân có đáp ứng sớm với liệu pháp điều trị hay không? Nếu kết HCV-RNA máu bệnh nhân trở nên âm tính sau tháng điều trị tín hiệu vui cho bệnh nhân, chứng tỏ bệnh nhân có đáp ứng sớm với điều trị bác sĩ rút ngắn thời gian điều trị cho bệnh nhân (có thể 1/2 năm) Nếu HCVRNA máu bệnh nhân chưa biến bác sĩ phải chờ thêm tháng để làm lại xét nghiệm phát định lượng HCV-RNA, kết định lượng lần cho thấy lượng virus không giảm hay giảm 100 lần bác sĩ phải cân nhắc thay đổi phương thức hay phải ngưng điều trị bệnh khơng đáp ứng với điều trị Nếu kết định lượng cho thấy lượng virus giảm 100 lần (chuyên môn gọi giảm log) bác sĩ đánh giá phát đồ điều trị đặc hiệu có hiệu lúc phải định thời gian điều trị Quyết định tuỳ thuộc vào genotype HCV mà bệnh nhân bị nhiễm loại (biết từ lần xét nghiệm trước định điều trị cho bệnh nhân) Nếu không may mà bệnh nhân bị nhiễm HCV genotype bác sĩ phải điều trị cho bệnh nhân với tổng thời gian 12 tháng Nếu bệnh nhân bị nhiễm HCV genotype 1, mà hay (tại Việt Nam, phát genotype HCV 3, 4, 5) bác sĩ cần điều trị cho bệnh nhân với tổng thời gian tháng Trước định chấm dứt điều trị cho bệnh nhân bác sĩ phải định lại xét nghiệm phát định lượng HCV-RNA để xem virus có cịn máu bệnh nhân hay khơng Nếu xét nghiệm cho kết dương tính bác sĩ chưa thể ngưng điều Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 trị mà phải tiếp tục thêm tháng kết trở nên âm tính Sau chấm dứt điều trị, bác sĩ phải thường xuyên theo dõi xem bệnh nhân có bị tái phát hay tái nhiễm không xét nghiệm phát định lượng HCV-RNA máu bệnh nhân tháng lần Bất lúc xét nghiệm trở nên dương tính bác sĩ phải xem bệnh nhân bị tái phát hay tái nhiễm phải trở lại điều trị đặc hiệu ban đầu Xét nghiệm xác định genotype HCV Genotype kiểu khác biệt vi sinh vật loài dựa vào khác biệt trình tự nucleotide gene vi sinh vật Cho đến y học xác định HCV phân làm genotype lớn đến 6, có khuynh hướng cho có đến 11 genotype HCV Trong genotype, HCV lại phân thành type genotype có type 1a, 1b, 1c; genotype có type 2a, 2b, 2c Xét nghiệm xác định genotype HCV loại xét nghiệm sinh học phân tử trình bày, kết xác định genotype HCV bệnh nhân có giá trị để giúp bác sĩ tiên đoán hiệu điều trị, xác định thời gian điều trị đặc hiệu, liều ribavirin sử dụng cho bệnh nhân Hình 3: HCV Việt Nam chủ yếu i Việt Nam chủ yếu t Nam chủ yếu yếu u thuộc Genotype 6[46] số c Genotype 6[46] mộc Genotype 6[46] số t số số dịchch tễ đặc trưng Trước đây, genotype HCV xác định dựa vào khác biệt trình tự vùng 5’ NC tức vùng khơng mã hố gene HCV, sở nhiều kỹ Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Tổng Quan thuật xét nghiệm xác định genotype HCV đời xét nghiệm inoLIPA lai vạch Bayer (sau Siemen) giải trình tự vùng 5’ NC Trugene (mà sau Siemen) Tại Việt Nam, công ty Nam Khoa phát triển kỹ thuật vừa định lượng HCV-RNA vừa xác định genotype HCV dựa vùng 5’ NC(32,42) Nguyên tắc kỹ thuật định lượng HCV-RNA trước kỹ thuật qPCR sau giải trình tự sản phẩm qPCR để xác định genotype HCV cách so chuỗi với thư viện genotype HCV NCBI Nhờ với định xét nghiệm vừa xác định genotype HCV, vừa định lượng HCV-RNA mà bác sĩ cho trước định điều trị đặc hiệu, bệnh nhân phải trả chi phí cho xét nghiệm xác định genotype HCV mà có kết định lượng HCV-RNA Ngồi kỹ thuật giải trình tự lai vạch, kỹ thuật real-time PCR sử dụng dò Taqman phát triển để xác định genotype HCV dựa vùng 5’ NC công ty Nam Khoa công ty phát triển kỹ thuật Tuy nhiên gần nhà nghiên cứu chứng minh xét nghiệm xác định genotype HCV dựa khác biệt trình tự vùng 5’ NC không đủ sức để phân biệt nhiều subtype genotype HCV với genotype 1(5,6), có nhiều trường hợp xác định genotype thật genotype Để xác định xác genotype HCV phải dựa giải trình tự vùng NS5B gene HCV(6,19) Trong cơng trình nghiên cứu phối hợp với chúng tôi, TS Kenji Abe(44) Viện Nghiên Cứu Các Bệnh Nhiễm Trùng Tokyo phát triển phương pháp dùng PCR tổ để khuếch đại vùng đặc hiệu vùng NS5B sau giải trình tự sản phẩm khuếch xác định genotype HCV Cơng trình nghiên cứu cho phép chúng tơi có nhận định tỷ lệ phân bố genotype HCV mẫu huyết lấy từ người Việt Nam nhiễm HCV, có 60% trường hợp thuộc genotype 17 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 genotype nhiều cơng trình trước cơng bố Ngồi ra, nghiên cứu so sánh kết xác định genotype HCV dựa giải trình tự vùng 5’ NC với giải trình tự vùng NS5B thực với kết cho thấy 40% trường hợp genotype bị xác định genotype dựa trình tự vùng 5’ NC Chính vậy, với đồng ý TS Kenji Abe, triển khai kỹ thuật giải trình tự vùng NS5B cơng ty Nam Khoa để giúp nhà lâm sàng có thơng tin xác genotype HCV chắn kỹ thuật dựa giải trình tự vùng 5’ NC Trugene, hay real-time PCR đích 5’ NC HCV sử dụng Việt Nam hồn tồn khơng xác Hình 4: Đa số SNP(A) IL28B thuộc kiểu switch-on, từ 22-26% kiểu switch-off (dữ liệu từ NK- BIOTEK) Hiện giới nghiên cứu đáp ứng điều trị interferon genotype Việt Nam quốc gia mà nhiễm HCV chủ yếu lại genotype 6, hướng mở để nhà nghiên cứu có nghiên cứu mang tâm quốc tế đề tài Xét nghiệm xác định công tắc interferon (interferon switch) Điều trị bệnh nhân nhiễm HCV với liệu pháp Interferon khơng phải lúc có kết thành cơng: bệnh nhân khỏi bệnh hồn tồn Do nhà điều trị quan tâm tiên đoán hiệu điều trị interferon bệnh nhân Trước số nhà nghiên cứu cho HCV bị đột 18 biến trình điều trị nên kháng interferon Tuy nhiên nay, qua số cơng trình nghiên cứu công phu so sánh đánh giá khác biệt SNP gene người, nhà nghiên cứu phát vài vị trí vùng gene interleukin 28B (IL28B) có liên quan đến khả thành công hay nguy tái phát bệnh nhân nhiễm HCV điều trị interferon(9,30,35,36) Có SNP IL28B xác định, SNP (A) rs12979860, SNP (B) rs8099917, SNP (C) rs12980275 SNP (A) công tắc interferon: kiểu gene C/C công tắc bật (switch-on) C/T công tắc tắt (switch-off) Switch-on cho phép tiên đốn hiệu điều trị thành cơng interferon cao (trên 80%) với nguy tái phát tiến triển mạn tính so với switch-off tiên đoán hiệu điều trị thấp với nguy tái phát tiến triển mạn tính cao Tại cơng ty Nam Khoa, làm nghiên cứu xác định công tắc interferon bệnh nhân nhiễm HCV kỹ thuật giải trình tự, kết cho thấy có khoảng 20% bệnh nhân interferon swith-off Kết nghiên cứu cho thấy mẫu mà nghiên cứu (trên 100 mẫu) ba SNP có liên quan với cần làm xét nghiệm xác định SNP (A) đủ không cần phải xác định thêm SNP (B) SNP (C) Xét nghiệm xác định công tắc interferon có ý nghĩa kết xét nghiệm giúp bác sĩ tư vấn khả thành công liệu pháp interferon bệnh nhân Ngoài bệnh nhân điều trị với kết HCV-RNA âm tính mà bác sĩ chưa làm xét nghiệm xác định genotype HCV bệnh nhân, bác sĩ cho định xác định công tắc interferon để định thời gian điều trị tiên đoán hiệu điều trị thay cho xét nghiệm xác định genotype HCV lúc thực HCV-RNA biến bệnh nhân Chính khả hữu dụng cao xét nghiệm nên nghiên cứu áp dụng thành kỹ thuật real-time PCR sử dụng dò taqman xác định công tắc Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 interferon với mong muốn xét nghiệm đưa sử dụng rộng rãi nhiều phịng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR Nghiên cứu mối liên hệ SNP(A) IL28B với đáp ứng điều trị interferon hướng Tổng Quan nghiên cứu nên làm có nghiên cứu HCV genotype 1, chưa có genotype Việt Nam với đa số bệnh nhân nhiễm HCV genotype 6, mà nghiên cứu theo hướng cần thiết Hình 5: Bộ gene HCV vùng đích mà dựa vào xét nghiệm sinh học phân tử triển khai phịng thí nghiệm NK-BIOTEK Xét nghiệm phát đột biến core HCV Ngồi cơng tắc interferon, có ghi nhận đột biến thay aminoacid (aa) 70 91 vùng core HCV thuộc genotype 1b có liên quan đến đáp ứng thành công với liệu Chuyên Đề Y Tế Công Cộng pháp interferon phối hợp với ribavirin(1) Các ghi nhận mở hướng tiếp cận mà nhà điều trị hay nghiên cứu nên quan tâm, tìm hiểu mối liên quan đột biến precore, công tắc interferon genotype HCV đáp ứng điều trị interferon phối 19 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 hợp với thuốc kháng virus Phịng thí nghiệm NK-Biotek có đủ phương tiện để phối hợp nghiên cứu lĩnh vực mới, thú vị đầy thách thức KẾT LUẬN Việt Nam quốc gia có tỷ lệ nhiễm viêm gan B cao giới, viêm gan C Việt Nam bị xếp vào nhóm quốc gia có tỷ lệ nhiễm dân số đứng hạng nhì Có lẽ mà Việt Nam nay, ung thư gan xếp vào đầu danh sách ung thư, cao ung thư phổi Viêm gan B mạn nhiễm viêm gan C bệnh lý khơng thể trị được, bệnh lý khơng điều trị mà cịn trị khỏi Tuy nhiên định điều trị theo dõi hiệu điều trị nhà điều trị cần phải có thơng tin cần thiết đến từ xét nghiệm sinh học phân tử Với tiến kỹ thuật hiểu biết cặn kẽ gene HBV HCV, xét nghiệm sinh học phân tử để phục vụ cho mục đích chẩn đốn theo dõi hiệu điều trị viêm gan B mạn tính nhiễm HCV khơng có khó khăn Việt Nam Có thể nói có phịng thí nghiệm có khả lột trần tồn bí ẩn gene HBV HCV bệnh nhân Bài viết nhằm mục đích giúp nhà nghiên cứu điều trị rõ khả để không tận dụng mà mở hợp tác nghiên cứu sâu có trình độ tương đương quốc tế HBV HCV Việt Nam Cơ sở để chúng tơi nói có hợp tác chặt chẽ bình đẳng với chuyên gia hàng đầu lĩnh vực này, TS Kenji Abe Viện Nghiên Cứu Bệnh Nhiễm Trùng Tokyo 10 11 12 13 14 15 16 17 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 Akuta N, Suzuki F, et al (2010) Amino Acid Substitution in Hepatitis C Virus Core Region and Genetic Variation Near the Interleukin 28B Gene Predict Viral Response to Telaprevir with Peginterferon and Ribavirin HEPATOLOGY Vol 52(2): 421-429 19 An VDX, Van PH et al (2010) Direct sequencing the polymerase gene amplified from the HBV genome isolated from patients’ sera to detect the mutations causing the resistance to lamivudine, adefovir, and entecavir Proceeding of the 2nd National Conference in Medical Molecular Biology (Ha Noi, 18-19 Sep 2010) Pp 198-199 Carman WF (1997) The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus, J Viral Hepat., (Suppl 1), 11 Chan HLY, Hussain M, Lok ASF (1999) Different hepatitis B virus genotypes are associated with different mutations in the core promoter and precore regions during hepatitis B e antigen seroconversion Hepatology ;29:976–984 Chen Z., and Weck KE (2002) Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b J Clin Microbiol 40:3127– 3134 Chinchai T, Labout J, Noppornpanth S, Theamboonlers A, Haagmans BL, Osterhaus AD, and Poovorawan Y (2003) Comparative study of different methods to genotype hepatitis C virus type variants J Virol Methods 109:195–201 Chun-Jen L; Jia-Horng K; Ding-Shinn C (2005) Therapeutic Implications of Hepatitis B Virus Genotypes Liver International ;25(6):1097-1107 EASL Consensus Conference on Hepatitis B (2003) J Hepatol; 39: S3-25 Ge D, Fellay J, Thompson AJ, et al (2009) Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance Nature ;461:399-401 Hui M, Rui-feng Y and Wei L (2010) Quantitative serum HBsAg and HBeAg are strong predictors of sustained HBeAg seroconversion to pegylated interferon alfa-2b in HBeAgpositive patients Journal of Gastroenterology and Hepatology 25; 1498–1506 Huy TT, and Abe K (2004) Molecular epidemiology of hepatitis B and C virus infections in Asia, Pediatr Int., 46, 223, 2004 Huy TT, Ngoc TT, and Abe K.(2008) New complex recombinant genotype of hepatitis B virus identified in Vietnam, J Virol., 82, 5657 Kalinina T, et al (2003) Deficiency in virion secretion and decreased stability of the hepatitis B virus immune escape mutant G145R, Hepatology, 38, 1274 Kalinina T, et al (2003) Selection of a secretion-incompetent mutant in the serum of a patient with severe hepatitis B, Gastroenterology, 125, 1077 Kenji A, et al (1997) Pre-S2 deletion mutants of hepatitis B virus could have an important role in hepatocarcinogenesis in Asian children Cancer Sci December 2009; vol 100; no 12: 2249–2254 Kidd-Ljunggren K, Oberg M, Kidd AH Hepatitis B virus X gene 1751 to 1764 mutations: implications for HBeAg status and disease J Gen Virol ;78:1469–1478 Kramvis A, and Kew MC (1999) The core promoter of hepatitis B virus, J Viral Hepat ; 6; 415, Kurosaki M, Enomoto N, Asahina Y, Sakuma I, Ikeda T, Tozuka S, et al (1996) Mutations in the core promoter region of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B J Med Virol 49:115–123 Laperche S, Lefrère JJ et al (2005) Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5’ Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter Study Journal of Clinical Microbiology, 43(2); 733-739 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng