Các bài báo trong tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh_tập 16_part 8

Trong phần này chúng ta tiếp tục đến với các bài báo: 1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID AMIN TRONG NƯỚC MẮM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 2. KHẢO SÁT KIẾN THỨC, THÁI ĐỘ, THỰC HÀNH VỀ VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA NGƯỜI SỬ DỤNG THỨC ĂN ĐƯỜNG PHỐ TẠI THÀNH PHỐ SÓC TRĂNG, TỈNH SÓC TRĂNG NĂM 2011 3. ĐẶC ĐIỂM BỆNH TAY CHÂN MIỆNG TẠI TỈNH ĐỒNG NAI NĂM 2011 4. CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ CỦA PHỤ NỮ MANG THAI VỚI SANH NON TẠI BÌNH PHƯỚC TỪ 012011 ĐẾN 072011 5. PHÂN TÍCH KHẢ NĂNG HIẾN THẬN Ở MỘT SỐ CỘNG ĐỒNG TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 6. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ Ở BỆNH NHÂN UỐN VÁN ĐIỀU TRỊ TẠI BV BỆNH NHIỆT ĐỚI TP.HCM 7. KHẢO SÁT THỰC TRẠNG KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ SỐT DENGUE, SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE CỦA 15 BỆNH VIỆN ĐA KHOA TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 8. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN VỚI HÀNH VI DÙNG CHUNG BƠM KIM TIÊM Ở NAM NGHIỆN CHÍCH MA TÚY TỈNH ĐỒNG NAI 9. NHÂN 2 TRƯỜNG HỢP BỆNH ẤU TRÙNG GIUN ĐẦU GAI THỂ THẦN KINH: TỔNG HỢP Y VĂN VỀ BỆNH LÝ THẦN KINH DO LOÀI KÝ SINH TRÙNG ĐANG BỊ LÃNG QUÊN 10. HIỆU LỰC PHÁC ĐỒ ARTESUNATE ĐƠN TRỊ LIỆU TẠI VÙNG SỐT RÉT LƯU HÀNH KHÔNG CÓ GIAO LƯU BIÊN GIỚI, MIỀN TRUNG VIỆT NAM 11.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID AMIN TRONG NƯỚC MẮM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Châu Vĩnh Thị*, Trần Đại Nghĩa*, Phan Nguyễn Thị Trung Hương* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Hiện nay, chất lượng nước mắm đánh giá tiêu nitơ tổng, thường gọi độ đạm nước mắm (6) Cách đánh chưa phản ánh xác chất lượng nước mắm bị lợi dụng để làm giả mức chất lượng cách thêm vào chất có chứa nitơ khơng phải protein (ure, melamin…) Mục tiêu: Xây dựng quy trình xác định hàm lượng acid amin nước mắm để nghiên cứu giá trị dinh dưỡng sản phẩm Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát việc tách 20 loại acid amin L-alanine(Ala), L-arginine(Arg), Laspartic acid(Asp), L-cystine(Cyt), L-glutamicacid (Glu), L-glycine (Gly) L-Histidine (His), L-isoleucine (Ile), Lleucine(Leu), L-lysine(Lys), L-methionine(Met), L-phenylalanine(Phe),L-proline(Pro), L-serine(Ser), Lthreonine(Thr), L-tyrosine (Tyr),L-valine(Val), L-Cystein (Cys), L-Tryptophan (Try), Taurin(Tau) nước mắm cột Primesep 100 hệ sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kết nối đầu dị MS Sau đó, khảo sát phương pháp xử lý mẫu loại tạp nước mắm thẩm định quy trình phân tích Kết quả: Xây dựng quy trình phân tích 20 acid amin nước mắm có giá trị hiệu sau: khoảng làm việc từ vài ppm 100 ppm, riêng Cystin (3 -21 ppm); giới hạn phát máy (ILOD) từ vài ppb (Arginin) đến 400 ppb (Serin), tỷ lệ phục hồi lớn 88%, độ lệch thực nghiệm acid amin dao động từ 2% 12% (lysin) Kết luận: Có thể ứng dụng cột Primesep 100 phân tích lúc 20 acid amin nước mắm hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối với đầu dị MS Từ khóa: Xây dựng quy trình, hàm lượng acid amin, nước mắm, sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT DEVELOPMENT OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH MS DETECTOR METHOD TO DETERMINE ACID AMINS CONCENTRATION IN FISH SAUCE Chau Vinh Thi, Tran Dai Nghia, Phan Nguyen Thi Trung Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No - 2012: 293 - 305 Background: Nowadays, the quality of fish sauces quality is evaluated by the concentration of total nitrogen, also called the protein level in fish sauce This criterion could not evaluate properly the quality of fish sauces and could be couterfeited by adding nonprotein subtances (urea, melamin…) Objectives: To develop a new method for identifying concentration of 20 acid amin contained in fish sauce in order evaluate properly the quality of this product Methods: evaluate the separation of 20 amino acids including: L-alanine(Ala), L-arginine(Arg), L-aspartic acid(Asp), L-cystine(Cyt), L-glutamicacid (Glu), L-glycine (Gly) L-Histidine (His), L-isoleucine (Ile), Lleucine(Leu), L-lysine(Lys), L-methionine(Met), L-phenylalanine(Phe),L-proline(Pro), L-serine(Ser), Lthreonine(Thr), L-tyrosine (Tyr),L-valine(Val), L-Cystein (Cys), L-Tryptophan (Try), Taurin(Tau) using Primesep 100 colunm combine with high performance liquid chromatography (HPLC) and MS detector After * Viện Vệ Sinh Y Tế Cơng Cộng Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ths.DS Châu Vĩnh Thị ĐT: 0983723529 Email: chauvinhthi@yahoo.com.vn Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 292 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 that, investigate sample processing method to eliminate interference subtances and validate the establishing method Result: Estabishing a method to analyze 20 amino acid contained in fish sauce with following efficiencies: working range was from ppm 100ppm vary depent each acid amin; the linearity of response ranged from ppm to 100 ppm (especially Cystin (3-21 ppm), instrument limit of detection (LOD) was ppb (Arginin) to 400 ppb (Serin), method experimental bias are vary depent on each acid amin from 2% to 12% percent (Serin), method accuracy was 2.10 percent and method recovery was 97.90 percent Conclusion: This study established a method to analyze 20 amino acid simultaneously in fish sauces using Primesep 100 colunm combine with high performance liquid chromatography (HPLC) and MS detector Keywords: fish sauce, acid amin, to develop method analysis, high peformance liquid chromatography ĐẶT VẤN ĐỀ Nước mắm sản phẩm truyền thống sử dụng rộng rãi bữa ăn ngày Việt Nam Theo tài liệu nghiên cứu cho biết thành phần tổng quát nước mắm bao gồm tiêu (3) pH (từ 5,5-6,5), muối ăn (18-23 g/100 ml), độ ẩm (từ 60%-70%) Ngồi nước mắm cịn có 20 acid amin tự taurine, aspartate, threonine, glutamate, methionine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan lysine… Hiện công tác kiểm tra đánh giá chất lượng nước mắm dựa tiêu hàm lượng nitơ tổng công bố độ đạm nước mắm Giá trị cao nước mắm đắt tiền Tuy nhiên dựa vào tiêu chưa phản ánh xác giá trị dinh dưỡng nước nắm bị lợi dụng để đưa vào chất chứa nito đạm (ure, melamin…) để nâng cao giá trị Do đó, chúng tơi xây dựng quy trình xác định hàm lượng acid amin nước mắm để nghiên cứu giá trị dinh dưỡng sản phẩm 20 loại acid amin L-alanine(Ala), Larginine(Arg), L-aspartic acid(Asp), Lcystine(Cyt), L-glutamicacid (Glu), L-glycine (Gly) L-Histidine (His), L-isoleucine (Ile), Lleucine(Leu), L-lysine(Lys), L-methionine(Met), L-phenylalanine(Phe),L-proline(Pro), Lserine(Ser), L-threonine(Thr), L-tyrosine (Tyr),Lvaline(Val), L-Cystein (Cys), L-Tryptophan (Try), Taurin(Tau) phân tích mẫu nước mắm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với đầu dò MS, cột Primesep 100 293 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU -PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Chất chuẩn Bảng 1: Hỗn hợp chuẩn gốc acid amin nồng độ acid amin Hãng sản xuất: Sigma ; Mã số: AA-S-18 Các loại acid amin l-alanine l-arginine l-aspartic acid l-cystine l-glutamic acid glycine l-histidin l-isoleucine l-leucine l-methionine l-phenylalanine l-proline l-serine l-threonine l-tyrosine l-valine 89,09 174,2 133,1 240,3 147,1 75,07 155,2 131,2 131,2 149,2 165,2 115.1 105,1 119,1 181,2 117,2 Nồng độ (µmol/ml) (±4%) 2,50 2,50 2,50 1,25 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 Đối tượng nghiên cứu - Nước mắm cốt công ty Việt Hương Hải (Nguyễn Duy, Phường 9, Quận 8, TP HCM) Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất Dụng cụ Các dụng cụ thủy tinh không thủy tinh thường sử dụng phịng thí nghiệm Trang thiết bị Máy cất nước lần Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Cân phân tích số lẻ (độ nhạy 0,1 mg) Sartorius Máy ly tâm Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao: Hiệu Shimadzu + Bơm LC – 20AD XR + Autosampler SIL – 20AD XR + Degasser DGU – 20 A5 + Interface CBM – 20A + Cột sắc ký phân tích: Cột chuyên dụng phân tích acid amin Primesep 100 (250 x 4,6 mm) + Đầu dò khối phổ lần (MS) Shimazdu + Đầu dò EDSL Pha động B: Acetonitrile - H2O (30:70), bổ sung TFA = 0,3% Tốc độ dịng: 1,2 mL/phút Cột phân tích: Cột Primesep 100: 250x 4,5 mm, đường kính hạt 5µm Thể tích tiêm:10 mcl Các thông số khảo sát: Khảo sát chương trình gradient nồng độ: Bảng 3: Chương trình gradient nồng độ thứ Thời gian (Phút) 0.01 22.00 22.01 Hóa chất Bảng 2: Các dung mơi, hóa chất sử dụng nghiên cứu Dung mơi, hóa chất Methanol Acetonitrile Trifluoracetic acid Nước cất lần Độ tinh khiết Hãng sản xuất HPLC grade HPLC grade AR grade J.T.Baker J.T.Baker Merck 30.00 30.00 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Sự kiện Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Kết thúc Tỉ lệ thể tích (%) 100 0 100 100 100 Bảng 4: Chương trình gradient nồng độ thứ Thời gian (Phút) 0.01 5.00 Phương pháp nghiên cứu Bước 1: Khảo sát tối ưu h óa điều kiện để tách acid amin hệ thống sắc ký lỏng cột Primesep 100, đầu dò EDSL Bước 2: Khảo sát hai quy trình xử lý, tách chiết acid amin mẫu nước mắm Bước 3: Thẩm định quy trình định lượng acid amin phương pháp thống kê Bước 4: Áp dụng phương ph áp xây dựng phân tích mẫu nước mắm thị trường Khảo sát thông số pha động hệ thống HPLC –EDSL Các thông số cố định: Đầu dò EDSL: nhiệt độ: 750C, gas flow: 1,5l/phút; Gain: Khảo sát thông số sắc ký: Các thông số cố định Hệ pha động: Pha động A: Acetonitrile - H2O (30:70), bổ sung TFA = 0,05% Nghiên cứu Y học 20.00 22.00 22.01 30.00 30.00 Sự kiện Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Dòng A Dòng B Dịng A Dịng B Tỉ lệ thể tích (%) 100 100 0 100 100 100 100 Kết thúc Khảo sát thông số khối phổ Các thông số cố định Chế độ chạy: API (+),API (-); Curtain Gas: 2,5l/phút; Hiệu điện thế: 15 KV Interface temperature: 4000C; CDL temperature: 250 C Khảo sát thông số thời gian lưu mảnh ion acid amin : bơm acid amin vào hệ phân tích để khảo sát thời gian lưu mảnh ion đặc trưng Bảng 5: Các thông số phổ khối lượng ID Q1(m/z) Event Arg 175 294 Nghiên cứu Y học 295 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 ID Q1(m/z) Event His 156 Leu 132 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Ile 132 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Lys Nghiên cứu Y học 147 296 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Met 150 Phe 166 Thr 120 Val 118 Gly 76 Ala 90 Ser 106 Pro 116 Asp 134 Glu 148 Tyr 182 Trp 188 Cys 122 Cyt 241 Tau 124 Khảo sát quy trình loại tạp nước mắm Để phân tích acid amin nước mắm phải loại bỏ tạp chất nước mắm để mẫu phân tích sạch, tránh làm thối hóa cột phân tích, tránh tượng ảnh hưởng (matrix effect) tượng giảm ion (ion suppression) đến trình phân tích Các tạp chất có mẫu nước mắm cần phải loại bỏ: Các protein, peptit cịn sót lại trình thủy phân Các hợp chất béo cá cịn sót lại., hợp chất màu,các loại phụ gia tạo vị, chất bảo quản, loại muối Các bước thực chung cho quy trình: Chạy mẫu nước mắm thực tế xử lý theo quy trình tách chiết, chạy mẫu với cột phân tách để xác định hiệu quả: hiệu phân tách tạp chất, hiệu suất thu hồi, độ lặp lại, độ ổn định phương pháp Quy trình khảo sát tách acid amin nước mắm: Khảo sát quy trình: Quy trình 297 Nước mắm 2ml + HCl 0,1N 30 ml Bình định mức 50ml Nhỏ giọt acid triclo acetic 10% + HCl 0,1N vừa đủ 50 ml Cho đến hết tủa trắng Hút 10 ml + 30 ml Ethanol Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút ống nghiệm có nắp Tủa trắng Lấy dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm Ly tâm Vial: dịch đem phân tích Quy trình Nước mắm 2ml + HCl 0,1N 30 ml Bình định mức 50ml Nhỏ giọt acid triclo acetic 10% + HCl 0,1N vừa đủ 50 ml Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Cho đến hết tủa trắng Hút 10 ml + 30 ml Methanol ống nghiệm có nắp Tủa trắng Lấy dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm Ly tâm Vial: dịch đem phân tích Thuyết minh quy trình : Hút 2ml mẫu nước mắm cần phân tích vào bình định mức 50ml thêm 30ml HCl 0,1N Thêm từ từ dung dịch tricloacetic 10%, vừa lắc thấy hết tủa trắng Định mức tới 50 mL dung dịch HCl 0,1N Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Hút 10ml dịch sau ly tâm thêm 30 Ethanol Methanol thấy xuất tủa trắng tiếp tục ly tâm Lọc dung dịch qua filter 0,45 µm vào vial Tóm tắt quy trình : Mẫu nước mắm hịa tan dung dịch dung dịch HCl 0,1N để tăng tính phân cực acid amin Thêm acid tricloacetic 10%, mục đích tạo tủa protein peptid Sau mẫu loại tủa ly tâm Dịch tiếp tục loại muối cồn ethanol methanol Tiếp tục ly tâm đem dịch lọc phân tích Vấn đề khảo sát loại muối Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 ethanol hay methanol hiệu suất thu hồi tốt Thẩm định quy trình định lượng phương pháp thống kê Khoảng tuyến tính (Linear range) Độ xác (Precision) Độ (Accuracy) Giới hạn phát giới hạn phương pháp (MLOD, MLOQ) Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết tách acid amin chương trình gradient pha động: Sau chạy khảo sát chương tr ình gradient chuẩn hỗn hợp acid amin với cột phân tích Primesep 100, kết thu sắc ký đồ Chương trình 1: Theo chương trình tách 20 acid amin cần quan tâm từ khoảng thời gian từ phút đến 20 phút kết cho 16 peak Như có cặp acid amin cịn chồng lên Hình 1: Sắc ký đồ 20 acid amin phân tích chương trình gradient Chương trình 2: Theo chương trình này, tách hết 20 acid amin thành 18 peak Như có 02 cặp acid amin cịn chồng lên Chun Đề Y Tế Cơng Cộng 298 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Hình 2: Sắc ký đồ 20 acid amin phân tích chương trình gradient Áp dụng chương trình chạy thứ chạy  Asp – Ser riêng chuẩn acid amin để xác định thời  Cys-Cyt gian lưu acid amin sắc ký đồ kết Do đó, phải sử dụng đầu dò MS kỹ thứ tự acid amin sau: thuật select ion để chọn ion Bảng 6: Thời gian lưu 20 acid amin chạy định lượng lúc 20 acid amin chương trình gradient thứ TT ACID AMIN Rt (phut) Taurin (124) 2,292 Aspartic(134) 5,419 Serine(106) 5,44 Threonin(120) 5,764 Glutamic(148) 5,918 Glycin(76) Alanine (90) 6,599 Proline(116) 7,007 Valine(118) 8,5 10 Tyrosine(182) 8,937 11 Methionin(150) 9,17 12 Isoleucin(132) 11,196 13 Leucin(132) 11,679 14 Cystein(122) 12,5 15 Cystin(241) 12,511 16 Phenylalanin(166) 12,868 17 Histidin(156) 17,783 18 Tryptophan (188) 18,337 19 Lysine(147) 18,338 20 Arginin(175) 19,988 Kết sắc ký đồ ion đầu dò MS Sắc ký đồ select ion 20 acid amin chuẩn Hình 3: Sắc ký đồ mảnh ion 20 acid amin Kết sắc ký đồ EDSL cặp peak có thời gian lưu kh ác sát nên cặp peak sau cịn chập lại thành 01 peak nên khơng thể định lượng đầu dò EDSL được: 299 Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nghiên cứu Y học 300 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Ph ụ b ản S ố * 2012 Độ ổn định mảnh ion đặc trưng cho t ừng acid amin Bảng 7: Độ ổn định thời gian lưu mảnh ion lần phân tích TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Acid amin Alanine (90) Arginin(175) Aspartic(134) Cystin(241) Glutamic(148) Glycin(76) Histidin(156) Isoleucin(132) Leucin(132) Lysine(147) Methionin(150) Phenylalanin(166) Proline(116) Serine(106) Threonin(120) Tyrosine(182) Valine(118) Taurin (124) Tryptophan (188) Cystein(122) 6,599 19,988 5,419 12,511 5,918 17,783 11,196 11,679 18,338 9,17 12,868 7,007 5,44 5,764 8,937 15,518 2,292 18,337 17,867 Thời gian lưu lần chạy chuẩn 6,567 6,567 6,567 6,593 19,95 19,955 19,988 19,998 5,41 5,4 5,419 5,436 12,484 12,5 12,511 12,551 5,899 5,9 5,918 5,938 6,033 6,033 17,835 17,837 17,8 17,9 11,147 11,199 11,896 11,249 11,648 11,678 11,67 11,758 18,332 18,342 18,33 18,342 9,13 9,131 9,16 9,202 12,801 12,833 12,86 12,922 6,999 6,993 7,043 5,428 5,433 5,442 5,46 5,749 5,755 5,758 5,779 8,906 8,875 8,905 8,988 15,433 15,433 15,467 15,589 2,267 2,267 2,28 2,294 18,309 18,321 18,32 18,336 17,833 17,867 17,8 17,9 Nhận xét: - Hệ thống sắc ký với thông số sắc ký đầu dò khối phổ cho sắc ký đồ ion có thời gian lưu ổn định có độ lệch chuẩn tương đối 2% (trừ 301 6,764 19,933 5,424 12,499 5,884 6,067 17,774 11,151 11,656 18,2 9,124 12,744 6,754 5,443 5,789 8,873 15,367 2,297 18,2 17,8 Trung bình SD RSD% 6,610 19,969 5,418 12,509 5,910 6,022 17,822 11,306 11,682 18,314 9,153 12,838 6,966 5,441 5,766 8,914 15,468 2,283 18,304 17,845 0,077 0,026 0,012 0,023 0,019 0,027 0,046 0,291 0,039 0,056 0,030 0,061 0,105 0,011 0,015 0,043 0,077 0,014 0,052 0,040 1,166 0,131 0,226 0,181 0,322 0,453 0,261 2,576 0,338 0,306 0,331 0,476 1,513 0,201 0,266 0,485 0,499 0,594 0,284 0,227 isoleucin 2,567%) Điều cho thấy hệ thống sắc ký ổn định để phân tích 20 acid amin Chuyên Đề Y Tế Công Cộng