Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƢỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƢỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS DƢƠNG MINH LAM GS TS NGÔ SỸ HIỀN HÀ NỘI - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các kết công bố luận án trung thực, xác Tơi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - Thầy PGS.TS Dƣơng Minh Lam, ngƣời thầy kính mến ln tận tình hƣớng dẫn, dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt công việc luận án - Thầy GS TS Ngô Sỹ Hiền, ngƣời thầy theo sát bên tơi, bảo tận tình có góp ý vơ q báu q trình nghiên cứu - Quý thầy cô môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, TS Trần Thị Thúy, PGS TS Đoàn Văn Thƣợc, TS Phan Duệ Thanh, ThS Tống Thị Mơ, CN Phạm Thị Hồng Hoa góp ý, hỗ trợ tinh thần suốt q trình tơi thực nghiên cứu - Q thầy PTN Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội; Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp nhiều việc thực luận án - GS TS Trƣơng Xuân Lam giúp đỡ định loại mẫu côn trùng thu thập khu vực nghiên cứu - Phòng Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh - Đại học Sƣ phạm Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực luận án - Ban Giám đốc Học viện Cảnh sát nhân dân, Lãnh đạo Khoa Kỹ thuật hình ln động viên tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu - Gia đình nhỏ, đồng nghiệp, bạn bè yêu thƣơng, động viên, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân iii MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Nấm nấm ký sinh côn trùng 1.1.1 Giới thiệu nấm 1.1.2 Nấm ký sinh côn trùng 1.2 Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 1.2.1 Cyclooligomer depsipeptide 1.2.2 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 18 1.2.3 Con đƣờng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide nấm 24 1.3 Nhu cầu dinh dƣỡng điều kiện nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 26 1.3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 26 1.3.2 Độ pH 28 1.3.3 Nguồn cacbon 29 1.3.4 Nguồn nitơ 30 1.4 Tách chiết, tinh nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng 31 1.4.1 Tách chiết 32 1.4.2 Tinh 33 1.4.3 Nghiên cứu cấu trúc 34 iv 1.5 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 35 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Nguyên vật liệu đối tƣợng nghiên cứu 42 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 42 2.1.2 Hóa chất thiết bị 42 2.1.3 Môi trƣờng 43 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh vật học 43 2.2.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 49 2.2.3 Phƣơng pháp tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide 52 2.2.4 Các phƣơng pháp phân tích 55 2.2.5 Phƣơng pháp toán học 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vƣờn quốc gia Xuân Sơn 57 3.1.1 Kết phân lập nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vƣờn quốc gia Xuân Sơn 57 3.1.2 Một số nhận xét đa dạng chủng nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vƣờn quốc gia Xuân Sơn 85 3.2 Khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập 87 3.3 Định loại chủng nấm CPA14V đặc điểm hình thái sinh học phân tử 91 3.3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm CPA14V 91 3.3.2 Định loại chủng nấm CPA14V phƣơng pháp sinh học phân tử 93 3.4 Nghiên cứu môi trƣờng điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V 99 3.4.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 99 3.4.2 Ảnh hƣởng độ pH môi trƣờng đến sinh trƣởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng C cateniannulata CPA14V 103 v 3.4.3 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sinh trƣởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V 104 3.4.4 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến sinh trƣởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V 106 3.5 Nghiên cứu tách chiết, tinh xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V 108 3.5.1 Tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V quy mơ phịng thí nghiệm 108 3.5.2 Xác định cấu trúc hóa học cyclooligomer depsipeptide 114 3.6 Nghiên cứu khảo sát số hoạt tính sinh học cao chiết tổng, phân đoạn chất beauvericin chủng nấm C cateniannulata CPA14V 122 3.6.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 122 3.6.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa 124 3.6.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC I vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleotide ARN: Acid ribonucleotide CDW: (Cell dry weight): Sinh khối khô COD: Cyclooligomer depsipeptide CzD: Môi trƣờng Czapek – Dox EDTA: Ethylendiamin Tetra Acetic Acid FDM: Môi trƣờng xác định Fusarium HPLC: (High Performance Liquid Chromatography): Sắc kí lỏng hiệu cao áp IC50: (Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% KBTTN: Khu bảo tồn thiên nhiên MIC: (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu MM: Mơi trƣờng khống tối thiểu NCBI: National Center for Biotechnology Information NMR: (Nuclear Magnetic Resonance): Quang phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NRPSs Nonribosomal peptide synthetases PBG: Môi trƣờng dịch chiết khoai tây TLC: (Thin Layer Chromatography): Sắc kí mỏng TSB: Trypcase Soya Broth SBR: Môi trƣờng Sabouraud SDB: Sabouraud Dextrose Broth UV: (Untraviolet and Vissible Spectra): Tia tử ngoại VQG: Vƣờn quốc gia vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số cyclooligomer depsipeptide (COD) phổ biến nấm 11 Bảng 1.2 Khả ức chế sinh trƣởng tế bào ung thƣ số COD 15 Bảng 1.3 Khả kháng khuẩn beauvericin 17 Bảng 1.4 Thành phần số loài thuộc chi Beauveria, Fusarium Isaria sinh tổng hợp COD 19 Bảng 2.1 Môi trƣờng lên men thu nhận COD 43 Bảng 2.2 Các trình tự đƣợc sử dụng để xây dựng phát sinh loài ba vùng gen ITS, LSU, Rpb1 51 Bảng 2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm khảo sát thí nghiệm sau khảo sát tách chiết, tinh COD 53 Bảng 3.1 Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc 84 Bảng 3.2 Khả sinh tổng hợp COD chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc khu vực nghiên cứu 88 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR CC1 tài liệu tham khảo 120 Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V 124 Bảng 3.5 Hoạt tính chống oxi hóa in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V 125 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V 126 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số loại cyclooligomer depsipeptide Hình 1.2 Cấu trúc chung liên kết este nhóm carboxyl C-terminus αhydroxy acid, ß-hydroxy acid hydroxy- acid chuỗi dài 10 Hình 1.3 Cấu trúc Pseudoxylallemycin 12 Hình 1.4 Cấu trúc số diketomorpholine 13 Hình 1.5 Sinh tổng hợp COD 25 Hình 1.6 Con đƣờng sinh tổng hợp beauvericin 30 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn xác định COD tích lũy theo 56 Hình 3.1 Hình thái mẫu CPA1 58 Hình 3.2 Hình thái mẫu CPA3 59 Hình 3.3 Hình thái mẫu CPA5 60 Hình 3.4 Hình thái mẫu CPA13V 61 Hình 3.5 Hình thái mẫu CPA14V 62 Hình 3.6 Hình thái mẫu CPA15 63 Hình 3.7 Hình thái mẫu CPA16 64 Hình 3.8 Hình thái mẫu CPA31 64 Hình 3.9 Hình thái mẫu CPA40 65 Hình 3.10 Hình thái mẫu CPA44 66 Hình 3.11 Hình thái mẫu XS01 67 Hình 3.12 Hình thái mẫu XS07 68 Hình 3.13 Hình thái mẫu XS12 69 Hình 3.14 Hình thái mẫu XS36 70 Hình 3.15 Hình thái mẫu XS37 71 Hình 3.16 Hình thái mẫu XS38 72 Hình 3.17 Hình thái mẫu XS57 73 Hình 3.18 Hình thái mẫu XS65 74 Hình 3.19 Hình thái mẫu XS66 75 Hình 3.20 Hình thái mẫu XS67 76 Hình 3.21 Hình thái mẫu XS69 77 XXXV XXXVI XXXVII XXXVIII XXXIX XL XLI XLII XLIII XLIV XLV XLVI XLVII XLVIII XLIX