Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chuyển gen cbf1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (glycine max (l ) merill)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2020 m ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN TIẾN DŨNG GS.TS NGƠ XN BÌNH Thái Ngun, năm 2020 m i LỜI CẢM ƠN Trang em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm thầy cô giáo Khoa tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS Ngơ Xn Bình thầy giáo TS Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm tận tình bảo, giúp đỡ hướng dẫn em thời gian thực luận văn Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Học viên Ngô Thị Bảo Oanh m ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Những đóng góp đề tài Ý nghĩa Khoa học thực tiễn đè tài luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tương 1.2 Đặc tính chống chịu đậu tương 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương nước giới 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Tại Việt Nam 1.4 Đặc điểm gen CBF1 10 1.4.1 Đặc điểm gen CBF1 10 1.4.2 Các nghiên cứu gene CBF1 10 1.5 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trình chuyển gen vào trồng 12 1.5.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12 1.5.2 Cấu trúc chức Ti-Plasmid 13 1.5.3 Cấu trúc chức T-DNA 13 1.5.4 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 14 m iii Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu thực vật 16 2.1.2 Vật liệu di truyền 16 2.1.3 Hóa chất 16 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.5 Phân tích, đánh giá sau chuyển gen 21 2.6 Chọn lọc dòng chuyển gen phun chất diệt cỏ Basta Error! Bookmark not defined.24 2.7 Các tiêu đánh giá 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 25 3.1.1 Kết biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 25 3.1.2 Kết biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm 31 3.1.3 Kết biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc 37 3.2 Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính sử dụng phương pháp PCR 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Đề nghị 4847 TÀI LIỆU THAM KHẢO m iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương giới năm gần Bảng Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần Bảng Kết tạo đa chồi thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A Tumefaciens………………………27 Bảng Kết chọn lọc mẫu biến nạp thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A Tumefaciens 28 Bảng 3 Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 29 Bảng Kết chuyển gen CBF1 vào đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 30 Bảng Kết tạo đa chồi thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 33 Bảng Kết chọn lọc mẫu biến nạp thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 34 Bảng Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 35 Bảng Kết chuyển gen CBF1 vào đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 36 Bảng Kết tạo đa chồi thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 38 Bảng 10 Kết chọn lọc mẫu biến nạp thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 40 m v Bảng 11 Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 41 Bảng 12 Kết chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 42 Bảng 13 Kết tách chiết DNA tổng số chuyển gen T0 44 Bảng 14 Đánh giá biểu gen chuyển gen T0 PCR 45 m vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne 13 Hình Sự tương tác Agrobacterium với tế bào thực vật chế chuyển T-DNA 15 Hình Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương 19 Hình Một số hình ảnh trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 26 Hình Hình ảnh chuyển gen tái sinh mơi trường SEM (A) 28 Hình Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 30 Hình Kết biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 32 Hình Kết mẫu biến nạp kéo dài chồi rễ 34 Hình Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 36 Hình 10 Kết biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 39 Hình 11 Kết mẫu biến nạp kéo dài chồi rễ 40 Hình 12 Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 42 Hình 13 Hình ảnh sàng lọc chuyển gen sau ngày Basta 43 Hình 14 Kết phân tích PCR chuyển gen T0 46 m vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CCM Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide LB Luria-Bertani OD600 Mật độ vi khuẩn đo bước sóng 600 nm quang phổ kế PCR Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction RM Rooting medium - Môi trường rễ SEM Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi m MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae) loại trồng có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Các giống đậu tương trồng Việt Nam thuộc giống phụ G Soja, chi Glycine Hiện nay, đậu tương trồng Việt Nam có hai nguồn gốc, giống địa phương giống nhập nội [1], [2] Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino acid không thay (lysin, triptophan, metionin, leucin ) vitamin (B1, B2, C, D, E, K ) cần thiết cho thể người động vật Ngoài giá trị dinh dưỡng hạt, đậu tương trồng lý tưởng hệ thống luân canh có khả cải tạo đất Sản phẩm từ đậu tương sử dụng đa dạng dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu tương, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu tương đáp ứng nhu cầu đạm phần ăn hàng ngày người gia súc Việt Nam đứng thứ giới, sau Trung Quốc, Thái Lan lượng tiêu thụ sữa đậu tương với khoảng 613 triệu lít/năm thứ giới tính theo bình qn đầu người với 6,8 lít/người/năm Theo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, đậu tương loại trồng chủ lực, điều bất cập diện tích gieo trồng ngày giảm Diện tích đất canh tác nơng nghiệp ngày bị thu hẹp phát triển ngành cơng nghiệp dịch vụ Bên cạnh đó, nhu cầu sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngày tăng Sản lượng đậu tương không đáp ứng đủ nhu cầu nước, phải nhập từ nước bên (Theo Tổng m 41 Lần 62 3 4,84 Lần 56 3,57 Lần 53 11,32 Lần 10 43 9,30 Tổng cộng 605 59 15 9,75 Kết chọn lọc từ 605 mẫu môi trường SIM2 thu tổng số 59 chồi tái sinh môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 9,75%), số chồi đủ tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ 15 chồi (Bảng 3.10, Hình 11) Cây chuyển gen chuyển chậu đất trồng nhà lưới trưởng thành Kết biến nạp 10 thí nghiệm thu 11 đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau chuyển trồng điều kiện nhà lưới (Hình 12) Cây chuyển T0 tiếp tục chọn lọc thuốc trừ cỏ basta PCR Bảng 411 Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ Số sống sót mơi trường RM sau đất Lần 2 Lần 1 Lần 0 Lần Lần 2 Lần 2 Lần Lần Lần thí nghiệm m 42 Lần 1 Lần 10 0 15 11 Tổng cộng Hình 12 Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Bthông qError! Bookmark not defined.12 K2EQ B qchuy B qua vi khuẩn A tumefaciensCúc Hà Bua thông qua vi khuuẩn A tumefacien Số sống Số sống sót Hiệu suất sót sau sau phun biến nạp đất kiểm tra basta (%) 72 1,38 Lần 75 1 1,33 Lần 62 0 Lần 66 0 Lần 71 0 Lần thí Số mẫu biến nghiệm nạp (mẫu) Lần m 43 Lần 59 1,69 Lần 62 0 Lần 57 1 1,75 Lần 55 1 1,82 Lần 10 43 0 Tổng cộng 622 11 0,8 Qua kết bảng 3.12 ta thấy: sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen cấu trúc pER10-pUBQ14:CBF1 với 622 mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc biến nạp thu 11 chuyển gen T0 sống sót Kết sàng lọc thuốc trừ cỏ basta thu kháng thuốc Hiệu suất chuyển gen đạt 0,8% cao ba giống đậu tương sử dụng cho chuyển gen (Cọc chùm 0,48% DT22 0,56%) Hình 13 Hình ảnh sàng lọc chuyển gen sau ngày Basta Ghi chú: (A) Lá không chuyển gen bị chết quét Basta (vạch kẻ màu vàng lá) m 44 (B) chuyển gen CBF1 kháng lại Basta Vạch kẻ ngang giữ vị chí quét Basta để sàng lọc chuyển gen (C) Cây chuyển gen sàng lọc phương pháp phun Basta Mũi tên không chuyển gen bị chết khơng có khả kháng Basta 3.2 Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính sử dụng phương pháp PCR Kết chọn lọc thuốc trừ cỏ Basta thu tổng số 14 chuyển gen T0 giống DT22, Cọc chùm Cúc Hà Bắc Để kiểm tra có mặt gen chuyển CBF gen Bar T0 kiểm tra PCR DNA tổng số tách từ mẫu non dịng chuyển gen theo kít DNeasy Plant Mini Kit hãng QIAGen (https://www.qiagen.com/) Mẫu hịa lỗng với 100µl dung dịch TE kiểm tra nồng độ DNA máy Nanodrop Kết kiểm tra cho thấy mẫu cho kết A260/A280 mức cho phép 1.81-2.02 (Bảng 3.13) Nồng độ DNA dao động từ 192,3 đến 359,3 ng/µl Kết cho thấy mẫu DNA hoàn toàn đảm bảo độ tinh nồng độ để thực thí nghiệm phân tích PCR B Kết quError! Bookmark not defined.13 K3EQ Bquả tách chiết DNA tổng số chuyển gen Cây số Giống A260/A280 ng/µl DT22 1,89 310,8 1,92 303,8 1,95 198,5 1,91 195,8 1,89 287,5 1,92 305,8 2,00 205,5 1,98 192,3 2,02 192,5 Cọc chùm m 45 10 1,94 213,6 1,99 314,4 12 1,81 159,2 13 1,90 302,2 14 1,94 359,3 11 Cúc Hà Bắc Để kiểm tra có mặt gen chuyển CBF1 bar tiến hành kiểm tra PCR với cặp mồi CBF1F/CBF1R BarF/BarR Kết cho thấy tất chuyển gen mang gen chuyển CBF1 với kích thước tương ứng (Bảng 3.14 hình 14) Bảng 514 Đánh giá biểu gen chuyển gen T0 PCR Kết PCR Cây số Kháng Basta CBF1F/CBF1R BarF/BarR x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + 10 x + + 11 x + + 12 x + + m 46 13 x + + 14 x + + Ghi chú: (x): kháng basta; (+): Dương tính Hình 14 Kết phân tích PCR chuyển gen T0 Ghi chú: (A) Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen CBF1F/CBF1R; (B) Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen BarF/BarR M: DNA marker, từ 1-14: số thứ tự mẫu m 47 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận  Kết chuyển gen CBF1 thu số đậu tương sống sót sau trình chọn lọc: • DT22: 30 • Cọc chùm: 13 • Cúc Hà bắc: 15  Số đậu tương chuyển gen CBF1 sống sót sau bầu đất: • DT22: 12 • Cọc chùm: • Cúc Hà bắc: 11  Số đậu tương chuyển gen CBF1 sống sót sau sàng lọc phun Basta: • DT22: • Cọc chùm: • Cúc Hà bắc: Hiệu biến nạp gen thông qua chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pER10-pUBQ14:CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc cao đạt 0,8%, sau đến giống đậu tương DT22 đạt 0,56% thấp giống đậu tương Cọc chùm đạt 0,48% Kết sàng lọc chuyển gen thuốc trừ cỏ basta phân tích PCR xác định 14 đậu tương có phản ứng dương tính với gen đích CBF1 m 48 4.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen vào số giống đậu tương địa phương khác Tiến hành thí nghiệm khẳng định lại có mặt gen đích ước đốn số copy phương pháp Southern blot dòng chuyển gen thu Tiếp tục đánh giá chọn lọc kiểm tra đậu tương chuyển gen hệ T1, T2 T3 để kiểm tra đặc tính chuyển gen qua hệ m TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Phạm Hồng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, Nhà xuất Trẻ Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Huy Hồng (1992), Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiễn sỹ, Hà nội Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa nhân gen dehydrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt Nam” Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khhoa học sống - Đại học Y Hà nội NXB KHKT Hà nội, 2224 – 2227 Trần Thị Phương Liên (1999), “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam’’, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội Chu Hoàng Mậu (2001), “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Singh, Ram J.; Nelson, Randall L.; Chung, Gyuhwa (2006) Genetic Resources, Chromosome Engineering, and Crop Improvement: Oilseed Crops, Volume London: Taylor & Francis tr 15 Hymowitz, Theodore (1995) “Evaluation of Wild Perennial Glycine Species and CrossesFor Resistance to Phakopsora” Trong Sinclair, J.B.; Hartman, G.L Proceedings of the Soybean Rust Workshop Urbana, IL: National Soybean Research Laboratory tr 33–37 m 10 Newell, C A; Hymowitz, T “Hybridization in the Genus Glycine Subgenus Glycine Willd (Leguminosae, Papilionoideae)” American Journal of Botany : 70 (3): 334–348 11 AF Garay Wallace Wilhelm (1983), “Root System Characteristics of Two Soybean Isolines Undergoing Water Stress Condition”, Agronomy Journal, Vol 75 12 Lakshmi P Manavalan & Satish K Guttikonda & Vinh T Nguyen & J Grover Shannon & Henry T Nguyen (2009), “Evaluation of diverse soybean germplasm for root growth and architecture”, Plant Soil 13 Tetsuji Oya, Alexandre Lima Nepomuceno, Norman Neumaier, Jose Renato Boucas Rarias, Satoshi Tobita Osamu Ito (2004), “Drought tolerance characteristics of Brazilian soybean cultivars evaluation and characterization of drought tolerance of various Brazilian soybean cultivars in field”, Plant Prod.Sci (2): 129-137 14 Mary Dell Chilton, Randall K Saiki, Narendra Yadavt, Milton P Gordon and Francis Quetieri (1980), “T-DNA from Agrobacterium Ti plasmid is in the nuclear DNA fraction of crown gall tumor cells”, Proc Nati Acad Sci USA, Vol 77, No 7, pp 4060-4064 15 Mutasim M Khalafalla, Hany A El-Shemy, Shaikh M Rahman, Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L] Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method”, African Journal of Biotechnology Vol (18), pp 1594-1599 16 Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky (2006), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology”, Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154 17 Genlvin S.B (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T- DNA transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology (51), pp 223-256 m 18 Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens” Ann.Rev Phytopathol 32: 157-179 19 Lan-Ying Lee and Stanton B Gelvin (2008), “T-DNA Binary Vectors and Systems”, Plant Physiology, Vol 146, pp 325-332 20 R Walden, B Reiss, C Koncz, and J Schell (1997), “The impact of Tiplasmid-derived gen vector on the study of the mechanism of action of phytohormones”, Annu Rev Phytopathol 35:45-66 21 Tetsuya Yamada, Satoshi Watanabe, Maiko Arai, Kyuya Harada, Keisuke Kitamura (2010),"Cotyledonary node pre-wounding with a micro-brush increased frequency of Agrobacterium-mediated transformation in soybean”, Plant Biotechnology, 27, 217-220 22 Mutasim M Khalafalla, Hany A El-Shemy, Shaikh M Rahman, Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L] Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method”, African Journal of Biotechnology Vol (18), pp 1594-1599 23 Gustavo A., Cabrera J., (1998), “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp 1-11 24 Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens” Ann.Rev Phytopathol 32: 157-179 25 Hooykass P.J.J., Schilperoort, R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology (35), pp 205-218 26 Hille J., Wullems G., Schiperoort R.A., (1983), “Non-oncogenic T- Region mutants of Agrobacterium tumefaciens transfer T-DNA into plant cells”, Plant Molecular Biology (2), pp 155-163 27 Kirankumar S Mysore, Burgund Bassuner, Xiao-bing Deng, Nune S Darbinian, Andrei Motchoulski, Walt Ream, and Stanton B Gelvin (1998), m “Role of the Agrobacterium tumefaciens VirD2 Protein in T-DNA Transfer and Integration”, MPMI, Vol 11, No 7, pp 668-683 28 Michal Sharabi- Schwager, Amnon Lers, Alon Samach, Charles L Guy and Ron Porat (2009), “Overexpression of the CBF2 transcriptional activator in Arabidopsis delays leaf senescence and extends plant longevity’’, Journal of Experimental Botany, Vol 61, No 1, pp 261–273 29 http://soybeanbreederstoolbox.org/ 30 El Kayal W, NavarroM, Marque G, Keller G, Marque C, Teulieres C (2006) Ex pression profile of CBF- like transcriptional factor genes from Eucalyptus in response to cold J Exp Bot.57: 2455- 2469 31 Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi- Shinozaki K (2004) A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress- induciblerd 29 Apromoter impeoved drought and low- temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer Plant Cell Physiol 45: 346- 350 32 Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Hà Nội 33 Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., and Napoli, C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs antisense constructs and single-copy vs complex TDNA sequences” Plant Mol.Biol 31: 957-973 34 http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC 35 https://www.gso.gov.vn 36 Yoshida, T., Fujita Y., et al (2010), AREB1, AREB2, and ABF3 are master transcription factors that cooteratively reglate ABRE dependent ABA signation, The Plant Journal, 61(4) pp 672- 685 37 Jian Lia, Yaqing Wâng, BoYua, Qiping Songa, Yang Liua Tony, H H Chenb Gang Lia Xinghong Yanga “Ectopic expression of StCBF1 have m difirent functions in response to freezing and drought stresses in Arabidopsis” Plant science Pp 221- 233 38 Singh S, Rathore M, Goyary D, Singh RK, Anandhan S, Sharma DK, Ahmed Z “carrot antifreeze protein enhances chilling tolerance in transgenic tomato”, Haldwani 263 39 Paz MM, Martinez JC, Kalvig AB, Fonger TM, Wang K “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation” Plant Cell Rep 2006 Mar; 25(3):206-13 m PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CCM SIM SEM RM GM (Co- (Shoot (Shoot (Rootting (Germination cultivation induction elongation elongation medium) medium) medium) medium) medium) Full-strenght MS x X X x x B5 Vitamins 1x 1x 1x 1x 1x 3,9 mg/l 0,59 mg/l 0,59 mg/l 0,59 mg/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 7,5 g/l 7,5 g/l 7,5 g/l Compounds MES Sucrose pH Agar 7,5 g/l Acetosyringone (AS) - 0,4 - mM - - - L– cysteine* - 400 mg/l - - - L– asparagine* - - - 50 mg/l - acid* - - - 100 mg/l - BAP mg/l 1,67 mg/l 1,67 mg/l - - IAA - - - 0,1 mg/l - IBA - - - - 0,8 mg/l Ticarcillin - - 250 mg/l 250 mg/l 250 mg/l Cefotaxime - - 200 mg/l 200 mg/l 200 mg/l L - izoglutamic Ghi chú: (*) – Lọc qua màng lọc bổ sung sau khử trùng môi trường m PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG LB STT Thành phần Khối lượng Trytone 10 g/L Yeast Extract g/L Nacl 10 g/L m