Đang tải... (xem toàn văn)
No Slide Title KYÕ THUAÄT NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO ÑOÄNG VAÄT I GIÔÙI THIEÄU CHUNG • * Harrison (1907),Carrel (1912) nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät • EÁch laø nguoàn moâ ñaàu tieân ñeå nuoâi caáy • * Söï t[.]
KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I GIỚI THIỆU CHUNG: • * Harrison (1907),Carrel (1912): nuôi cấy tế bào động vật • Ếch nguồn mô để nuôi cấy • * Sự thúc đẩy y học buộc người ta quan tâm đến loài động vật ổn nhiệt • * Dòng Hela Gey cộng thiết lập năm 1952 • * Năm 1961 Hayflick Moorhead nghiên cứu tế bào bình thường có đời sống xác định • * Tạo vaccin kháng virus nghiên cứu ung thư thúc đẩy kỹ thuật nuôi cấy TBĐV phát triiển • * Sự phát triển chung kỹ thuật công nghệ làm nuôi cấy mô quan tâm rộng rãi • * Kỹ thuật nuôi cấy mô ứng dụng nhiều vào lónh vực y học công nghiệp 1 Những thuận lợi nuôi cấy mô a Kiểm soát môi trường b Tính đồng mẫu c Kinh tế Những khó khăn nuôi cấy mô a Sự thành thạo người thao tác b Số lượng c Sự không ổn định Những khác biệt tế bào điều kiện in vitro •* Thay đổi không gian kết hợp •* Không tính tương tác tế bào chuyên biệt, tương tác đa chiều • * Không thực đại diện cho mô mà từ tế bào tách thiếu yếu tố điều hòa II ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính học yếu Tăng trưởng phân chia chậm Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back) Tính chất cần giá đỡ Thay đổi kiểu gen kiểu hình Có thể bảo quản lâu dài phương pháp lạnh sâu Các đặc tính khác III.MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Môi trường • *Môi trường tổng hợp dần thay chiết phẩm sinh học (phôi gà, huyết ) • *Đa số dòng tế bào nuôi cấy môi trường tổng hợp có bổ sung – 10% huyết (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh) * Một vài loại môi trường thường sử dụng nuôi cấy tế bào mô động vật: • Môi trường BM (Basal Medium): tế bào Hela, tế bào L • Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium) • Môi trường D'MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium) • Môi trường F10, F12: R.G Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi • Môi trường Iscove: N.N.Iscove thiết lập sở tiếp tục cải biến môi trường DMEM • Môi trường 5A: T.A Mc.Coy thiết lập, thường dùng cho tế bào bệnh bạch huyết • Môi trường RPMI-1640: G.E Moore thiết lập, dùng để nuôi tế bào mô bạch huyết • Môi trường 199: R.C Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô phôi gà sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt Huyết thanh: • *Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào amino acid thiết yếu, tiền chất nucleic acid, nguyên tố vi lượng… • *Cung cấp nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng phân chia •* Kích thích phục hồi tổn thương tế bào cấy chuyền protein huyết làm bất hoạt trypsin tránh enzym gây tổn thương tế bào • *Cải thiện tính tan chất dinh dưỡng • *Cải thiện tính dính tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ yếu tố làm tăng độ dính tế bào lên giá đỡ • *Chống oxy hóa: huyết có tính kháng oxy hóa mạnh ức chế độc tính oxy 2 Giới thiệu kỹ thuật pha môi trường Một số điều cần lưu ý pha môi trường • Thành phần môi trường: + Acid amin: cung cấp nguồn N cho tế bào + Glucose: cung cấp nguồn C cho tế bào + Vitamine: yếu tố vi lượng quan trọng hoạt động sống tế bào + Muối khoáng: tạo hệ đệm trì áp suất thẩm thấu phù hợp + Protein: quan trọng yếu tố tăng trưởng diện huyết có vai trò kích thích phân bào • Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2 • Sự vô trùng IV KỸ THUẬT TÁCH TẾ BÀO, CHỌN DÒNG TẾ BÀO VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VÂÏT Kỹ thuật tách tế bào Một số khái niệm: • *Dòng tế bào (cell line) • *Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line) Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) • *Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line) • *Tế bào sơ cấp (primary cell) • *Tế bào thứ cấp (secondary cell) Tách tế bào trypsin Kỹ thuật chọn dòng tế bào Tách tế bào từ đóa nuôi cấy trypsin Cấy tế bào vào đóa nuôi cấy 1000 tế bào/ml Nuôi ủ tế bào đến chúng phát triển thành colony Chọn colony tế bào cần tạo dòng Cô lập colony ống kim loại Hút bỏ môi trường ống tách tế bào từ colony Cấy sang đóa môi trường Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật trong phòng thí nghiệm a Cấy chuyền tế bào Đổ bỏ môi trường cũ bình roux có tế bào Rửa tế bào PBS(-) Tách tế bào trypsin Huyền phù tế bào môi trường Cấy tế bào sang bình roux Thay môi trường b Bảo quản tế bào Tách tế bào bình roux trypsin Huyền phù tế bào môi trường Ly tâm thu sinh khối tế bào Huyền phù tế bào môi trường Hút dịch huyền phù cho vào tube bảo quản tế bào 2ml Để tube bảo quản vào hộp xốp bên có lót gòn Cho vào tủ lạnh -70oC qua đêm Bảo quản tube tế bào Nitơ lỏng c Hoạt hóa tế bào Tube tế bào lấy từ nitơ lỏng Cho vào becher nước ấm 37– 38oC để giải đông Hút dịch huyền phù tế bào cho vào bình roux Thêm môi trường giọt vào bình Ủ 37,5oC tủ nuôi Sau 24 giờ, thay môi trường cũ môi trường Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật quy mô pilot công nghiệp a Nuôi cấy bình khuấy: - Thể tích: vài lit đến 20 lit, tốt 10 lit - Hấp vô trùng autoclave * Yêu cầu với cánh khuấy: Tải FULL (36 trang): https://bit.ly/31zWOVz Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net + Phải giữ tốc độ quay ổn định từ 10-300rpm + Có máy đo tốc độ gốc xác + Khởi động lại sau điện giữ nguyên tốc độ cài đặt + Không tỏa nhiệt nhiều + Hoạt động ổn định trong môi trường 37oC Môi trường giảm nồng độ huyết (0.5-5%), bổ sung: + Pluronic F-68 (polyglycol) : nồng độ 0.1% để bảo vệ tế bào chống lại phá học, đặc biệt hàm lượng huyết thấp + Carboxymethyl cellulose (CMC) : nồng độ 0.1% dùng để bảo vệ tế bào khỏi phá vỡ học + Phá bọt (6ppm) : dùng nồng độ huyết treân 2% 4030965 ... Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật trong phòng thí nghiệm a Cấy chuyền tế bào Đổ bỏ môi trường cũ bình roux có tế bào Rửa tế bào PBS(-) Tách tế bào trypsin Huyền phù tế bào môi trường Cấy tế bào. .. độ CO2 • Sự vô trùng IV KỸ THUẬT TÁCH TẾ BÀO, CHỌN DÒNG TẾ BÀO VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VÂÏT Kỹ thuật tách tế bào Một số khái niệm: • *Dòng tế bào (cell line) • *Dòng tế bào liên tục (continued... *Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line) • *Tế bào sơ cấp (primary cell) • *Tế bào thứ cấp (secondary cell) Tách tế bào trypsin Kỹ thuật chọn dòng tế bào Tách tế bào từ đóa nuôi cấy trypsin Cấy