Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thuỷ sản cung cấp cho học sinh những hiểu biết về nguyên lý, nguyên tắc và phương pháp thực hiện các kỹ thuật chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản. Mời các bạn cùng tham khảo!
NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT
SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN
Động vật thủy sản yêu cầu sự giám sát chặt chẽ về môi trường và sức khỏe do sống trong môi trường nước, khiến cho việc quan sát hoạt động của chúng trở nên khó khăn Chúng tồn tại trong hệ sinh thái phức tạp và thường xuyên biến động, với nhiều yếu tố như thức ăn thừa và thủy sản chết tiềm ẩn dưới đáy ao Đối tượng nuôi thủy sản rất đa dạng về loài, môi trường sống, và kỹ thuật nuôi, dẫn đến sự phong phú trong các loại bệnh mà chúng có thể mắc phải, trong đó nhiều bệnh chưa xác định được vật chủ và không có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng.
Bệnh trong nuôi thủy sản thường không chỉ do một nguyên nhân riêng lẻ, mà là kết quả của nhiều sự kiện và nguyên nhân liên quan, bao gồm sự tương tác giữa vật chủ, môi trường và mầm bệnh Sự hiện diện của mầm bệnh trong mô tôm hoặc cá không nhất thiết là nguyên nhân chính gây bệnh Thường thì nguyên nhân khởi phát bệnh là do biến đổi xấu về môi trường, gây tổn thương hoặc giảm khả năng kháng bệnh của tôm, cá Khi đó, mầm bệnh có sẵn trong môi trường sẽ có cơ hội xâm nhập vào cơ thể Vì vậy, việc xem xét đồng thời vật chủ, mầm bệnh và môi trường là cần thiết để xác định nguyên nhân gây bệnh và có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
I.2 NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN
I.2.1 Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu
Thao tác thu thập, xử lý và phân tích mẫu đóng vai trò quan trọng trong kết quả chẩn đoán bệnh Các yếu tố như thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu, phương pháp cố định, nhiệt độ bảo quản, chất lượng môi trường phân lập và thời gian sử dụng dung dịch hóa chất đều cần được xem xét cẩn thận Ngoài ra, số lần mẫu bị đông lạnh và rã đông cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích Để đảm bảo tính so sánh của kết quả, cần có sự đồng nhất giữa các phòng thí nghiệm và các phương pháp phân tích được sử dụng.
I.2.2 So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm Để so sánh kết quả phân tích hay kết quả chẩn đoán từ các phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh thủy sản, các yếu tố sau đây cần phải được xem xét:
I.2.2.1 Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng
I.2.2.2 Phương thức so sánh, ví dụ:
- Mật số vi-rút so với hàm lượng kháng thể
- Giới hạn xác định kết quả dương và âm tính
- Độ nhạy của phương pháp (ví dụ như % kết quả dương tính thật trên số kết quả dương tính)
- Tính chuyên biệt (ví dụ như % kết quả âm tính thật trên số kết quả âm tính)
- Các tính toán và đọc kết quả
I.2.3 Những vấn đề cần lưu ý
I.2.3.1 Giá trị giới hạn cho những phép phân tích
Cần thiết lập các giá trị giới hạn cho các phép phân tích định lượng nhằm xác định rõ ràng kết quả âm tính và dương tính.
Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật
I.2.3.2 Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán
Phương pháp phân tích mẫu hiệu quả là phương pháp có khả năng phân biệt rõ ràng giữa kết quả dương tính và âm tính, cũng như giữa cá thể nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh.
Hiệu lực của phương pháp được đánh giá qua hai yếu tố chính: tính nhạy, tức khả năng xác định chính xác mẫu có bị nhiễm hay không, và tính chuyên biệt, tức khả năng phát hiện mẫu không bị nhiễm bệnh.
Tính hiệu lực của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu Nếu có sự khác biệt, kết quả cần được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học để đảm bảo tính chính xác.
I.2.3.3 Tính ổn định của phương pháp
Một phương pháp được coi là ổn định khi nó mang lại kết quả đáng tin cậy và nhất quán qua nhiều lần thực hiện Tính ổn định của phương pháp phụ thuộc vào hai yếu tố chính: sự biến động giữa các cá thể phân tích và sự biến động giữa các lần đọc kết quả.
I.2.3.4 Đối chứng Đối chứng phải được bố trí trong tất cả các phân tích, gồm có đối chứng dương và đối chứng âm Lý tưởng nhất là đối chứng chuyên biệt cho loài cho tất cả các phân tích Các xét nghiệm phân tử như trường hợp của phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction-PCR) phải có đối chứng DNA để theo dõi khả năng tạp nhiễm giữa các mẫu trong quá trình ly trích, đối chứng là DNA của vật chủ để kiểm soát khả năng khuếch đại DNA của mẫu và đối chứng PCR để kiểm soát sự tạp nhiễm trong quá trình thực hiện phản ứng
I.2.4 Phát hiện và chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán lâm sàng bệnh lý bao gồm việc ghi nhận và mô tả các ảnh hưởng của bệnh thông qua quan sát tổng quát, thay đổi về hành vi và hoạt động, cũng như những vết lở loét và tổn thương bên ngoài Đồng thời, cần thực hiện các quan sát và mô tả ở mức hiển vi để đánh giá tình trạng bệnh lý của các nội quan.
I.2.4.2 Những biện pháp sàng lọc (screening)
Biện pháp sàng lọc là các phương pháp xét nghiệm được thực hiện trên cơ thể sinh vật khỏe mạnh nhằm phát hiện sự nhiễm trùng của các mầm bệnh truyền nhiễm có khả năng gây bệnh trong tương lai.
- Xác định sự hiện diện của nhóm hay loại mầm bệnh nào đó
- Xác định mức độ cảm nhiễm (tự nhiên hoặc nhân tạo) của mầm bệnh trong mẫu phân tích
- Xác định sự hiện diện của mầm bệnh chuyên biệt ở mức loài, chủng hay các dạng biến hoá của mầm bệnh đó
- Mức độ cảm nhiễm dù ít hay nhiều của mầm bệnh qua chẩn đoán có ý nghĩa là vật chủ đang bị nguy hiểm
Chẩn đoán sơ bộ là quá trình xác định các khả năng bệnh lý dựa trên những quan sát tổng quát và bằng chứng gián tiếp Trong giai đoạn này, thường xuất hiện nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau.
• Chần đoán xác định (Confirmatory Diagnosis) – kết quả xét nghiệm dương tính thật của mầm bệnh với độ tin cậy của phương thức xét nghiệm cao
I.2.4.5 Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission)
Trong chẩn đoán và xác định nguyên nhân gây bệnh, việc hiểu rõ các con đường lây truyền bệnh là rất quan trọng Dịch tễ học (epidemiology hoặc epizootiology) giúp xác định hình thức lây truyền và các yếu tố ảnh hưởng như môi trường, thao tác, giai đoạn phát triển và ổ bệnh Những yếu tố này cần được khảo sát, ghi nhận trong quá trình điều tra và nghiên cứu để có cái nhìn toàn diện về sự lây lan của bệnh.
I.2.5 Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản
Chẩn đoán bệnh thủy sản đóng vai trò quan trọng trong quản lý và khống chế bệnh, bao gồm việc sàng lọc cá thể mang mầm bệnh trong chọn giống và vận chuyển Việc này giúp giảm rủi ro bộc phát bệnh do sốc hay thay đổi môi trường và giảm nguy cơ lây bệnh từ những cá thể kháng bệnh Ngoài ra, chẩn đoán cũng giúp xác định nguyên nhân gây sức khỏe kém, từ đó đề xuất các giải pháp khống chế hoặc xử lý bệnh phù hợp với từng tình huống cụ thể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1
1 Austin, B., and Austin, D A (999) Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition
2 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa (2005) Giáo trình bệnh học thủy sản
3 Ellis, A E (1985) Fish and Shellfish Pathology
4 FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease fisheries technical paper
5 Lightner, D V (1996) A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic
Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp
6 Noga, E J (1999) Fish Disease: Diagnosis and Treatment
7 OIE (2006) Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals
8 Post, G (1983) Textbook of Fish health
CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT
KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp phát hiện kháng nguyên trên tiêu bản mô thông qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể, sử dụng kháng thể đặc hiệu Các kháng thể này có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, enzym, hoặc chất phóng xạ, giúp nhận diện khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang, hoặc các loại kính hiển vi khác.
- Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể
Phương pháp phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào giúp nghiên cứu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh.
Quan sát bằng kính hiển vi điện tử và kính hiển vi huỳnh quang yêu cầu áp dụng một số phương pháp đặc biệt để đạt được hình ảnh rõ nét và chi tiết.
Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật IHC (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên)
Mẫu sử dụng cho xét nghiệm là mô hoặc dịch cơ thể còn tươi, với thời gian chuẩn bị khoảng 24 giờ Sau đó, mẫu sẽ được xử lý bằng một trong các phương pháp thích hợp.
Vết bôi/kính phết cho xét nghiệm IHC cần được gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị Nếu quá thời gian này, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để đảm bảo kháng nguyên không bị hư hỏng Để biết thêm chi tiết về cách chuẩn bị tiêu bản, người gửi cần tuân theo hướng dẫn của phòng thí nghiệm nhận mẫu.
Formalin là dung dịch cố định mẫu hiệu quả, thường được sử dụng với nồng độ 10% trong vòng một tuần cho mẫu dày dưới 1 cm, hoặc cố định trong 48 giờ trước khi bảo quản trong ethanol để phục vụ cho các phương pháp mô học và miễn dịch Mặc dù mẫu đông lạnh giúp loại bỏ sự liên kết chéo của một số kháng nguyên với formalin, nhưng lại làm giảm chi tiết hình thái của mô và tế bào Phương pháp đông lạnh yêu cầu kỹ thuật trữ đông đặc biệt cho IHC và gặp khó khăn trong việc xác định tình trạng bệnh trước khi đông lạnh Cách lưu trữ tốt nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, đặt trong isopentane và đông lạnh bằng nitơ lỏng hoặc ở -70°C.
Có nhiều phương pháp IHC được áp dụng tùy thuộc vào mục đích phát hiện kháng nguyên, dựa trên loại mẫu như vết bôi, đúc parafin hoặc đông lạnh Việc lựa chọn phương pháp cũng phụ thuộc vào dạng mẫu vật cần phát hiện bệnh và độ nhạy mong muốn.
Khi thực hiện IHC, cần lưu ý các thông tin quan trọng sau: cách cố định mẫu, thời gian cố định, những miêu tả đặc trưng về mẫu và loài.
II.2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp
- Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phương pháp mô học hay nhuộm truyền thống
- Xác định chính xác tác nhân gây bệnh dựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với kháng nguyên
Việc xác định khả năng gây bệnh của mầm bệnh có thể được thực hiện trực tiếp thông qua việc nghiên cứu sự tương tác ở mức tế bào, liên quan đến các yếu tố hình thái và cấu trúc của chúng.
- Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả
- Đòi hỏi quá trình tạo ra kháng thể chuyên biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên
- Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh
Kết quả âm tính hoặc dương tính giả chủ yếu phụ thuộc vào chất lượng mô được sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, cũng như kinh nghiệm của người phân tích trong việc làm việc với kháng thể.
KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT
Kỹ thuật nuôi vi sinh vật là phương pháp hữu hiệu để chẩn đoán sơ bộ các mầm bệnh vi sinh vật ở mức họ hoặc giống Tuy nhiên, trong trường hợp cần chẩn đoán chính xác, cần áp dụng các phương pháp định danh chuyên biệt phù hợp với từng loài hoặc týp.
Phương pháp nuôi vi sinh vật trong chẩn đoán bệnh có hạn chế là dễ gặp phải âm tính giả với một số mầm bệnh yêu cầu điều kiện nuôi cấy đặc biệt Bên cạnh đó, tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy cũng có thể dẫn đến dương tính giả trong kết quả chẩn đoán.
II.2.1.1 Ứng dụng Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm
Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi
Vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng, giúp kiểm soát sự phát triển và theo dõi sự thay đổi khả năng kháng thuốc Điều này cũng hỗ trợ xác định loại kháng sinh hiệu quả với từng loài vi khuẩn Một số môi trường chọn lọc phổ biến được sử dụng để nuôi mầm bệnh vi khuẩn trong thủy sản bao gồm
- Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin agar
- Edwardsiella ictaluri: Edwardsiella ictaluri agar
Cơ, gan, thận và máu của sinh vật bị bệnh có thể được thu thập để kiểm tra Trong một số trường hợp, mẫu bệnh phẩm thủy sản lở loét có thể được lấy bằng cách sử dụng gạc bông tại vết thương Ngoài ra, mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của sinh vật bệnh.
II.2.1.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các mầm bệnh cơ hội
II.2.2 Nuôi nguyên sinh động vật
Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm
Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin để tránh nhiễm khuẩn
Để đảm bảo an toàn cho mẫu ruột, phân, máu hoặc các mô cơ thể, cần rửa sạch mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý có chứa kháng sinh nhằm ngăn ngừa nhiễm khuẩn Sau đó, mẫu nên được bảo quản trong tủ lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm.
II.2.2.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được xử lý trong vòng 24 giờ
Nuôi vi-rút là một phương pháp quan trọng trong chẩn đoán nhiễm vi-rút, thường được kết hợp với các xét nghiệm phân tử như PCR Để thu mẫu hiệu quả, cần chú ý đến loại vi-rút, cho dù đó là vi-rút DNA hay RNA.
Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc, vì vậy việc nuôi vi-rút thường phải thực hiện trên tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri hoặc trong lọ tiệt trùng Để vi-rút phát triển, mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy với nhiệt độ thích hợp.
Mẫu bệnh cần được thu thập ngay khi có triệu chứng bộc phát, vì vi-rút có thể không còn trong cơ thể vật chủ sau khoảng 2 ngày Tùy thuộc vào điều kiện thực tế, mẫu có thể được vận chuyển sống hoặc sử dụng các phương pháp bảo quản như ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng để gửi về phòng thí nghiệm.
Mẫu gửi đến phòng thí nghiệm cần kèm theo thông tin về loại mẫu, loại vi-rút nghi ngờ và thời gian quan sát dấu hiệu bệnh Mẫu có thể là mô hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, và mẫu máu cần thu với dung dịch chống đông Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu phụ thuộc vào loại vi-rút, theo hướng dẫn của phòng thí nghiệm Một số phòng thí nghiệm yêu cầu mẫu được giữ trong môi trường bổ sung protein và kháng sinh, vận chuyển trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong 5 ngày Nếu quá 5 ngày, mẫu phải được bảo quản ở -70°C.
Việc phân lập vi-rút từ mô hoặc máu của vật chủ bị bệnh là bằng chứng rõ ràng cho sự nhiễm vi-rút, nhưng vi-rút có thể chỉ là mầm bệnh thứ cấp Để chẩn đoán chính xác, cần có cơ sở chứng minh vi-rút liên quan đến tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc là tác nhân gây bệnh chính Điều này yêu cầu áp dụng các kỹ thuật như tế bào học hoặc mô bệnh học, kết hợp với các phương pháp như IHC và hiển vi điện tử Hiện nay, quy trình PCR đã được phát triển cho hầu hết các vi-rút gây bệnh ở thủy sản, giúp sàng lọc và xác định vi-rút mới hiệu quả Tuy nhiên, cần thận trọng khi sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh và xác nhận mối liên hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý.
TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II
1 Alday de Graindorge, V and Flegel, T.W (1999) Diagnosis of shrimp diseases with emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon
2 Austin, B., and Austin, D A (999) Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition
3 FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease Fisheries technical paper
4 Forbes, B A., Sahm, D F., and Weissfeld, A S (2002) Laboratory methods in basic virology In: Diagnostic Microbiology 11th edition
5 Hirsh, D C., MacLachlan, N J., and Walker, R L (2004) Laboratory Diagnosis In: Veterinary Microbiology 2nd edition
6 Lightner, D V (1996) A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp
7 Noga, E J (1999) Fish Disease: Diagnosis and Treatment
8 OIE (2006) Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals
9 Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải (2002) Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi
10 Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S
(1999) Diagnostic Procedures for Finfish Diseases
11 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa (2005) Giáo trình bệnh học thủy sản.
CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH
PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH
Kỹ thuật miễn dịch điện di cho phép xác định chính xác tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di, nhanh chóng và nhạy hơn so với các phương pháp truyền thống Một ưu điểm nổi bật là kháng nguyên không có thời gian khuếch tán trước khi bị kết tủa bởi kháng thể, giúp bảo tồn tính thuần nhất của các thành phần đơn dòng ngay cả khi chúng có mặt ở nồng độ rất thấp Cuối cùng, việc giải thích hình ảnh thu được từ kỹ thuật này cũng trở nên dễ dàng hơn.
III.1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp
Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở dạng hòa tan thì mới có thể khuếch tán được Mặt khác phương pháp này có tính nhạy không cao
III.2 PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH
Hiện tượng ngưng kết xảy ra khi kháng nguyên và kháng thể tạo thành mạng lưới, cho phép các hạt kết tụ lại thành đám có thể nhìn thấy bằng mắt thường Mạng lưới này chỉ hình thành với kháng thể có ít nhất hai hóa trị, trong đó IgM có khả năng ngưng kết mạnh hơn IgG do có đến 10 vị trí kết hợp Kháng nguyên hữu hình, như hồng cầu và tế bào vi sinh vật, thường đa hóa trị và có epitop bề mặt liên kết chéo với kháng thể, tạo thành cụm dễ thấy Kháng thể trong phản ứng này được gọi là kháng thể gây ngưng kết, và phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa, thường được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh.
Phản ứng ngưng kết xảy ra trong một hỗn hợp chứa các tiểu phần lơ lửng trong dung môi, nơi các tiểu phần này duy trì trạng thái ổn định.
III.2.2 Xếp loại các phản ứng ngưng kết
Ngưng kết được phân loại thành ngưng kết chủ động và ngưng kết thụ động Ngưng kết chủ động liên quan đến các hạt hữu hình như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng và vi khuẩn, đã mang sẵn các nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu Trong khi đó, ngưng kết thụ động sử dụng các hạt chất trơ làm giá đỡ cho các quyết định kháng nguyên hòa tan, thường là hồng cầu đã được xử lý bằng formol, được gắn một cách nhân tạo lên bề mặt của chúng.
III.2.2.1 Ngưng kết trực tiếp:
Các hạt hữu hình mang các nhóm quyết định kháng nguyên có khả năng tương tác với kháng thể ở nhiều nồng độ pha loãng khác nhau Sự kết hợp giữa kháng thể và kháng nguyên trên các hạt này sẽ tạo ra mạng lưới và dẫn đến hiện tượng ngưng kết.
III.2.2.2 Ngưng kết gián tiếp:
Kháng nguyên hòa tan được gắn cố định trên các hạt khác nhau tùy thuộc vào loại phản ứng Sau đó, hỗn hợp hạt này sẽ được tiếp xúc với huyết thanh trong điều kiện ngưng kết trực tiếp.
III.2.2.3 Ngưng kết nhân tạo:
Khi kháng thể không hoạt động hiệu quả tại hai vị trí, hiện tượng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể vẫn có thể xảy ra, dẫn đến hiện tượng ngưng kết Coombs đã phát triển phương pháp thêm kháng thể anti-globulin để tạo cầu nối giữa globulin miễn dịch có sẵn trên hồng cầu Test Coombs trực tiếp được thực hiện trên hồng cầu đã tự nhiên gắn kháng thể không gây ngưng kết; khi thêm kháng thể anti-globulin, hiện tượng ngưng kết sẽ xảy ra Trong khi đó, test Coombs gián tiếp là một phương pháp huyết thanh giúp xác định sự hiện diện của kháng thể chống hồng cầu mà không gây ngưng kết Quá trình này bắt đầu bằng việc ủ huyết thanh với hồng cầu đã biết nhóm, sau đó rửa sạch để chỉ còn lại kháng thể trên hồng cầu Khi thêm kháng thể anti-globulin, nếu có ngưng kết, điều đó cho thấy sự hiện diện của kháng thể cần tìm.
Hình 3.5 Phương pháp test coombs trực tiếp vá gián tiếp
Phát hiện kháng nguyên và đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với một kháng nguyên dạng hạt Có 3 dạng thường gặp:
- Ức chế sự ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu
- Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh được tạo ra để chống lại sự nhiễm khuẩn
- Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó
Mẫu huyết tương hay huyết thanh
III.2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp
Kỹ thuật khá đơn giản
Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở dạng hạt Mặt khác phương pháp này có tính nhạy không cao.
KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
Kỹ thuật đánh dấu kháng thể bằng thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng tính chất phát sáng của thuốc nhuộm khi bị kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu Ví dụ, fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, trong khi rodamin phát quang màu đỏ da cam Các kháng thể được gắn với thuốc nhuộm này được gọi là kháng thể đánh dấu hoặc kháng thể huỳnh quang.
III.3.2.1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Kỹ thuật này bao gồm hai thành phần chính: kháng nguyên và kháng thể, tạo ra hai lớp phản ứng Một trong hai thành phần được gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang Quá trình bắt đầu bằng việc cố định vi khuẩn trên lam kính, sau đó phủ kháng thể huỳnh quang lên để chúng gắn với tế bào vi khuẩn Sau khi rửa để loại bỏ kháng thể thừa, vi khuẩn chỉ có thể được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang nếu chúng đặc hiệu với kháng thể đã được gắn.
Hình 3.6 Kháng thể huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp III.3.2.2 Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp
Kỹ thuật này bao gồm hai thành phần chính là kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, tạo ra hai lớp phản ứng Ngoài ra, còn có một thành phần gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, hình thành lớp thứ ba là kháng-kháng thể.
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang là phương pháp hiệu quả để phát hiện kháng nguyên của mầm bệnh trong mô hoặc tế bào nhiễm bệnh Phương pháp này tương tự như kỹ thuật nhuộm miễn dịch mô (IHC), cho phép xác định kháng nguyên thông qua sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể có gắn dấu huỳnh quang.
Mẫu phân tích có thể bao gồm mẫu mô, tế bào và huyết thanh, và chúng có thể được bảo quản bằng các phương pháp như đông lạnh, làm khô hoặc cố định trong dung dịch thích hợp.
III.3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp
Có tính nhạy cao và thao tác nhanh để phát hiện và định dạng mầm bệnh trong mẫu kính phết, mô hay tế bào
III.3.5.2 Nhược điểm: Đòi hỏi phải sử dụng kháng thể huỳnh quang hoặc kháng huyết thanh Việc đọc kết quả đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc chẩn đoán để phân biệt những trường hợp dương tính giả và âm tính giả Phản ứng chéo của kháng thể với kháng nguyên khá có thể xảy cho nên kháng thể sử dụng phải có tính chuyên biệt cao
Hình 3.7 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM
Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA) là một phương pháp nhạy bén và đơn giản, có khả năng phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp, khoảng 0,1 ng/ml So với các kỹ thuật phóng xạ, ELISA không chỉ an toàn hơn mà còn tiết kiệm chi phí, đồng thời đảm bảo độ chính xác tương đương.
Kỹ thuật ELISA hoạt động dựa trên nguyên tắc tương tự như kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nhưng thay vì sử dụng kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, kháng thể được gắn với enzym Khi cơ chất thích hợp được thêm vào, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện của màu sắc chứng tỏ phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, và cường độ màu cho phép xác định nồng độ của kháng nguyên cần phát hiện.
Kỹ thuật ELISA bao gồm hai loại chính: ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp Các enzym phổ biến được sử dụng trong kỹ thuật này bao gồm β-galactosidase, glucooxidase, peroxidase và phosphatase kiềm ELISA có khả năng xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng.
ELISA là phương pháp được sử dụng để đánh giá sự tiếp xúc của mẫu bệnh phẩm với các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi-rút và ký sinh trùng Phương pháp này cho phép tinh sạch kháng nguyên và xác định hàm lượng kháng thể cũng như kháng nguyên trong mẫu.
Huyết thanh hay huyết tương
Hàm lượng kháng thể cần thiết để kết hợp với kháng nguyên của mầm bệnh được xác định thông qua biểu đồ hàm lượng kháng thể chuẩn, và kết quả cuối cùng được thể hiện bằng mức độ hàm lượng kháng thể.
III.4.4.1 Kỹ thuật ELISA gián tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng nguyên
- Nhỏ huyết thanh có kháng thể (ví dụ antitoxin) vào giếng ở bảng nhựa để cho kháng thể bám vào thành giếng
- Nhỏ tiếp dịch kháng nguyên cần xét nghiệm (ví dụ toxin) Nếu là kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ gắn với kháng thể
Thêm cộng hợp gắn enzym vào giếng giúp kháng thể của cộng gắn với kháng nguyên đã liên kết với kháng thể đầu tiên, tạo thành cấu trúc “bánh mì kẹp chả” gồm kháng thể-kháng nguyên-kháng thể gắn enzym.
Enzym sẽ thủy phân cơ chất, dẫn đến sự thay đổi màu của dung dịch Tốc độ thủy phân tỉ lệ thuận với lượng kháng thể đã gắn enzim, đồng nghĩa với kháng nguyên cần xét nghiệm Sự thay đổi màu có thể quan sát bằng mắt thường hoặc đo bằng quang phổ kế.
Hình 3.8 Kỹ thuật ELISA: (a) ELISA gián tiếp; (b) ELISA trực tiếp (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên; S: cơ chất) III.4.4.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng thể
- Nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp thụ lên thành giếng
- Nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ Nếu trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu thì sẽ gắn với nó
- Thêm cộng hợp kháng- kháng thể đã gắn enzym Kháng thể này được tạo thành để khống chế kháng thể người
Tốc độ thủy phân cơ chất enzym liên quan trực tiếp đến sự thay đổi màu của dung dịch, tỷ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định trong mẫu Sự thay đổi màu này có thể được quan sát dễ dàng bằng mắt thường hoặc thông qua quang phổ kế.
III.4.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp
Phương pháp ELISA là một kỹ thuật nhạy bén và dễ thực hiện, cho phép xét nghiệm nhiều mẫu bệnh phẩm cùng lúc Với thời gian thực hiện ngắn, ELISA được coi là phương pháp vàng trong việc sàng lọc và phát hiện bệnh.
Cần phải có kháng thể đơn dòng hay đa dòng phù hợp với kháng nguyên của mầm bệnh cần xét nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III
1 Kuby, J (1997) Antigen-Antibody Interactions In: Immunology 3rd edition
2 Vũ Triệu An và Jean, C.H (2001) Miễn dịch học
3 Nguyễn Lân Dũng (2000) Vi sinh vật học
4 Nguyễn Ngọc Lành (1997) Miễn dịch học
5 Madigan, M.T., Martinko, J.M and Parker, J (2002) Biology of Microorganisms 10th edition
6 Đỗ Ngọc Liên (1999) Miễn dịch học cơ sở.
CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ
IV.1 KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985, cho phép tạo dòng DNA in vitro mà không cần sự hiện diện của tế bào.
Tất cả các DNA polymeraza cần có sự hiện diện của những mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn Mồi là các đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi để tạo thành mạch mới Khi hai mồi chuyên biệt bắt cặp với hai đầu của một trình tự DNA, chỉ đoạn DNA nằm giữa chúng được tổng hợp Hai loại mồi này bao gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau (hình 4.1):
IV.1.1.1 Giai đoạn biến tính (denaturation):
Trong quá trình phản ứng, DNA được biến tính ở nhiệt độ 94-95 ºC trong khoảng 30 giây đến 1 phút, dẫn đến việc tách mạch đôi thành hai mạch đơn.
IV.1.1.2 Giai đoạn lai (hybridization):
Nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của các mồi giúp các mồi bắt cặp với khuôn hiệu quả Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động từ 40-70 ºC tùy thuộc vào Tm của mồi, với thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Giai đoạn này đóng vai trò quyết định trong tính đặc hiệu của phản ứng.
IV.1.1.3 Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Taq polymeraza là 72 ºC, giúp tổng hợp kéo dài mạch DNA theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn Thời gian tổng hợp phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Theo nghiên cứu của Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq polymeraza đạt 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75 ºC - 80 ºC và 60 nucleotit/giây ở nhiệt độ khác.
70 o C; 24 nucleotit/giây ở 55 o C; 1,5 nucleotit/giây ở 37 o C và ở nhiệt độ 22 o C chỉ còn 0,25 nucleotit/giây
Sau ba giai đoạn của quá trình nhân bản, một phân tử DNA khuôn được nhân lên thành hai Các đoạn DNA mới được tạo ra tiếp tục làm khuôn cho các chu kỳ nhân bản tiếp theo, nhờ vào sự bổ sung của hai đầu tận cùng với mồi Kết quả là, sau mỗi chu kỳ, số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng gấp đôi, dẫn đến việc sau n chu kỳ, sẽ có 2^n bản DNA từ một khuôn ban đầu Đặc biệt, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại đạt mức 10^6 so với lượng bản mẫu ban đầu.
Hình 4.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR
PCR có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu gen của động vật và thực vật, cho phép tạo ra số lượng lớn đoạn trình tự DNA đặc hiệu Nó được sử dụng để xác định trình tự DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA làm mẫu lai, và xác định sinh vật chuyển gen Ngoài ra, PCR còn hỗ trợ phân tích tiến hóa và đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể.
PCR là công cụ hiệu quả trong việc phát hiện mầm bệnh như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng và nấm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR bao gồm vi-rút gây bệnh ở cá nheo mỹ (CCV), vi-rút nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu (IHNV), vi-rút gây hoại tử tuyến tụy (IPNV), vi-rút xuất huyết (VHSV), vi-rút hoại tử hệ thần kinh (VNNV) và Renibacterium salmoninarum ở cá Đối với tôm, các mầm bệnh như vi-rút đốm trắng (WSSV), vi-rút đầu vàng (YHV), vi-rút hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV), vi-rút gây hội chứng taura (TSV), cùng với nội ký sinh trùng và vi khuẩn như nhóm Vibrio cũng được phát hiện bằng PCR.
IV.1.3.1 Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn
Trong phòng thí nghiệm, DNA hoặc RNA được chiết xuất từ mẫu bệnh phẩm, với mô cơ thể được lựa chọn dựa trên vị trí mà mầm bệnh thường tấn công để phục vụ cho quá trình chẩn đoán.
Phản ứng PCR bao gồm các thành phần chính như DNA khuôn, hai đoạn mồi dài khoảng 18-24 nucleotid, enzym Taq polymeraza chịu nhiệt, bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), cùng với dung dịch đệm và ion Mg2+.
Phản ứng PCR đạt hiệu quả tối ưu khi sử dụng DNA khuôn tinh khiết; tuy nhiên, một trong những ưu điểm lớn của phương pháp này là khả năng nhân những mẫu DNA không được bảo quản tốt Điều này bao gồm các mẫu như vết máu cũ, tinh dịch khô, hóa thạch, tóc và móng tay của người đã chết.
Mồi đóng vai trò quan trọng nhất trong việc khuyếch đại DNA đặc trưng, gắn với DNA khuôn ở đầu 3’ và cho phép DNA polymeraza kéo dài chuỗi theo chiều 5’ đến 3’ Các yếu tố như trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong phản ứng PCR quyết định sự thành công của quá trình này Do đó, việc chọn mồi cần tuân thủ một số nguyên tắc nhất định để đạt hiệu quả tối ưu.
Trình tự chọn mồi cần đảm bảo không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi "xuôi" và mồi "ngược" Đồng thời, cũng phải tránh các cấu trúc "kẹp tóc" do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của mồi.
- Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt nhau quá xa
- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen
- Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn Phản ứng PCR sẽ tối ưu nếu đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb
Trước đây, trong phản ứng PCR, DNA polymerase I thường được sử dụng, trong đó Taq polymerase, một loại enzyme tách chiết từ vi khuẩn chịu nhiệt, là phổ biến nhất.
Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng với nhiệt độ từ 94-100 C, và enzyme Taq polymerase có hoạt tính cao nhất ở 70-80 C Enzyme này có trọng lượng phân tử 94kD, bao gồm 832 axit amin do gen với 2499 cặp bazơ tổng hợp Nghiên cứu của Saiki (1988) cho thấy hoạt tính của Taq polymerase giảm 50% sau 130 phút ở 92,5 C, sau 40 phút ở 95 C, và chỉ sau 5-6 phút ở 97 C Bên cạnh đó, nồng độ ion Mg2+ và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của enzyme này.
MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN
PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV
Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các quy định sau đây:
Thuốc nhuộm ethidium bromide là một chất độc hại, có khả năng gây ung thư cho cả con người và động vật Khi làm việc với hóa chất này, việc đeo găng tay và kính bảo hộ là rất cần thiết để đảm bảo an toàn Sau khi sử dụng, dung dịch cần được xử lý qua than hoạt tính trước khi thải bỏ.
Chỉ được bật đèn cực tím UV để quan sát kết quả sau khi đã đóng kính bảo vệ
Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc chuẩn bị mẫu
Phòng thí nghiệm cần được thiết kế với khu vực chuẩn bị mẫu riêng biệt trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khuếch đại Việc này giúp ngăn ngừa hiện tượng nhiễm chéo, từ đó giảm thiểu nguy cơ xảy ra kết quả dương tính giả.
V.2 PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV
Nguồn: Farming IntelliGene Technology Corporation (http://www.iq2000kit.com)
Kit IQ2000 (Farming Intelligence, Đài Loan) là hệ thống sinh học phân tử thương mại giúp phát hiện và phân loại hai loại virus YHV và GAV trên tôm he Kit IQ2000 YHV/GAV có khả năng phân biệt các prototype của hai loại virus này và cung cấp kết quả về mức độ nhiễm dựa trên các mẫu đối chứng Bộ kit được thiết kế dựa trên đặc điểm sinh học tự nhiên và trình tự RNA của GAV và YHV, dựa vào nghiên cứu của CSIRO, Úc và BIOTEC, Thái Lan.
Nhiều nghiên cứu gần đây ở Đông Nam Á cho thấy sự tồn tại của nhiều virus khác liên quan đến YHV/GAV Do thiếu thông tin đầy đủ về các virus mới này, Kit IQ2000 YHV/GAV có thể không phát hiện được hoặc phản ứng chéo với các virus liên quan Tác động của những virus này đối với ngành nuôi tôm và mối quan hệ của chúng với YHV/GAV vẫn đang trong quá trình nghiên cứu.
RT - PCR Pre-Mix reagent 4 ống, 420 l/ống,
Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của YHV/GAV
Nested Pre-Mix reagent 4 ống, 840 l/ống,
Bài viết đề cập đến việc chuẩn bị dung dịch đệm cho phản ứng, bao gồm dNTPs và mồi chuyên biệt cho YHV/GAV Cụ thể, có hai loại đối chứng dương: YHV với 1 ống, dung tích 100 µl, chứa 10^4 copies/µl và GAV với 1 ống, dung tích 100 µl, cũng chứa 10^4 copies/µl.
RT enzyme mix 1 ống, 120 l/ống
6X loading Dye (dung dịch nạp mẫu) 1 ống, 1500 l/ống
DNA moclecular weight marker (thang DNA) 1 ống, 100 l/ống
DEPC ddH20 1 chai, 100ml/chai
RNA Extraction Solution (Dung dịch ly trích RNA) 1 chai, 100ml/chai, giữ ở 4 C
V.2.3 Thiết bị và hóa chất
3 Bộ điện di (nguồn và bồn điện di)
4 Bàn đọc UV và máy chụp hình gel
13 Dung dịch điện di là TAE hoặc TBE
V.2.4 Giới hạn phát hiện và tính nhạy
Giới hạn phát hiện và tính nhạy của kit IQ2000 YHV/GAV phụ thuộc vào nguồn mẫu chẩn đoán Đối với tôm ấu niên và tôm trưởng thành, mang là cơ quan lý tưởng để thu mẫu do đặc điểm phân bố của virus Các nguồn mẫu phổ biến được sử dụng trong chẩn đoán được liệt kê trong bảng sau.
Bảng 5.1: Các nguồn mẫu dùng để chẩn đoánn WSSV
Mẫu Số lượng kiểm tra Giới hạn phát hiện Đương lượng của tính nhạy cảm
2 bản sao 2 bản sao/ phản ứng 2 bản sao/l mẫu plasmid
In vitro transcribed RNA analysis shows that for shrimp larvae below PL12, the optimal sample size is 10 individuals with a concentration of 20 copies per reaction, resulting in 500 copies per individual For shrimp larvae from PL12 to PL20, a sample size of 5 individuals with 20 copies per reaction yields 1,000 copies per individual.
Mang (tôm
