Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA in vitro khơng cần có sự hiện diện của tế bào.
IV.1.1. Nguyên tắc
Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau (hình 4.1):
IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94-95 ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.
IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):
Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70 ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1phút. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):
Nhiệt độ được tăng lên đến 72 ºC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotit/giây ở 70oC; 24 nucleotit/giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/giây.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản
sẽ tạo ra 2n bản DNA từ một khuôn ban đầu. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu.
Hình 4.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR
IV.1.2. Ứng dụng
PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cDNA để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. PCR cũng được dùng để phân tích tiến hố, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể.
PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng (protozoa hay metazoa) và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm nuôi hiện nay được chẩn đốn bằng PCR gồm có: (i) ở cá có vi-rút gây bệnh ở cá nheo mỹ (channel catfish virus-CCV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu (infectious hematopoietic necrosis virus-IHNV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử tuyến tụy (infectious pancreatic necrosis virus-IPNV), vi-rút gây xuất huyết và nhiễm trùng máu (viral hemorrhagic septicemia virus-VHSV), vi-rút gây hoại tử hệ thần kinh (viral nervous necrosis virus-VNNV) và Renibacterium salmoninarum; (ii) ở tơm có vi-rút đốm trắng (WSSV), vi-rút đầu vàng (YHV), vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious hypodermal and haematopoeitic necrosis virus-IHHNV), vi-rút gây hộI chứng taura (Taura syndrome virus-TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặc biệt là nhóm Vibrio.
IV.1.3. Phương pháp