II.2.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật hố mơ miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC) cho phép phát hiện kháng nguyên trên tiêu bản mơ bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với kháng ngun qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (kỹ thuật IFC), enzym, chất phóng xạ… để có thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang hay những loại kính hiển vi khác (hình 2.1).
II.2.2. Ứng dụng
- Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể.
- Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương pháp này cho phép tìm hiểu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh .
- Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương pháp đặc biệt được sử dụng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử.
II.2.3. Mẫu phân tích
Mẫu sử dụng là mơ hay dịch cơ thể cịn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24
giờ. Sau đó mẫu được xử lý bằng một trong các phương pháp sau:
Vết bơi/kính phết: vết bơi dùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phịng thí nghiệm trong vịng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản. Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để kháng nguyên không bị hư. Thông tin chi tiết về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phịng thí nghiêm nhận mẫu.
Formalin: cố định mẫu (dày khoảng <1 cm) trong dung dịch đệm trung tính (10% formalin) và đúc khối bằng paraffin trong vòng < 1 tuần. Hoặc cố định 48 giờ trong formalin, sau đó bảo quản trong ethanol để có thể bảo quản mẫu cho việc phát hiện bằng phương pháp mô học hoặc phương pháp miễn dịch.
Đông lạnh: ưu điểm của mẫu đông lạnh là tách được trường hợp liên kết chéo của một số kháng nguyên với formalin làm ảnh hưởng đến sự liên kết kháng nguyên-kháng thể. Tuy nhiên phương pháp đông lạnh làm giảm đi chi tiết về hình thái của mơ và tế bào, địi hỏi phải có phương pháp trữ đông đặc biệt cho IHC, giới hạn việc xác định tình trạng bệnh trước khi mơ được trữ đơng và thao tác thực hiện tiêu bản khó hơn so với tiêu bản bằng cách đúc khuôn parafin như trong phương pháp mô bệnh học. Phương thức trữ đông tốt nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, để trong isopentane và đông lạnh bằng nitơ lỏng hay ở –70°C.
II.2.4. Thao tác
Có nhiều phương pháp IHC được sử dụng tuỳ theo mục đích phát hiện kháng nguyên chủ yếu dựa trên loại mẫu (vết bôi, đúc parafin hay đông lạnh), dạng mẫu vật để phát hiện bệnh và độ nhạy cần đạt được.
Những thơng tin cần có khi thực hiện IHC là: (i) cách cố định mẫu; (ii) thời gian cố định; (iii) những miêu tả đặc trưng về mẫu và (vi) loài.
II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
II.2.5.1. Ưu điểm:
- Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phương pháp mơ học hay nhuộm truyền thống.
- Xác định chính xác tác nhân gây bệnh dựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với kháng nguyên.
- Có thể giúp xác định một cách trực tiếp khả năng gây bệnh của mầm bệnh qua sự tương tác ở mức tế bào về mặt hình thái hoặc cấu tạo.
II.2.5.2. Nhược điểm:
- Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả.
- Địi hỏi q trình tạo ra kháng thể chun biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên.
- Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh.
- Kết quả âm tính hay dương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của người phân tích.
II.3. KỸ THUẬT NI VI SINH VẬT
Những kỹ thuật ni vi sinh vật giúp cho việc chẩn đốn sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở mức họ hoặc có khi đến mức giống. Trong trường hợp đòi hỏi phải có chẩn đốn xác định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp.
Tuy nhiên hạn chế của phương pháp ni vi sinh vật trong chẩn đốn bệnh là thường dễ gặp trường hợp âm tính giả đối với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy đặc biệt. Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong q trình ni cấy rất dễ gây nên hiện tượng dương tính giả trong chẩn đốn.
II.2.1. Ni vi khuẩn
II.2.1.1. Ứng dụng
Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của lồi vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm
II.2.1.2. Phương pháp
Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi. Vi khuẩn thường được nuôi trong mơi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng. Cách làm này vừa có thể giúp kiểm sốt sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả năng kháng thuốc trong cùng một quần thể cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực với lồi vi khuẩn đó. Một số mơi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản như:
- Vibrio sp: TCBS
- Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin
agar
- Flexibacter sp: Cytophaga
II.2.1.3. Mẫu phân tích
Cơ, gan, thận hay máu của sinh vật bị bệnh. Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy sản lở loét mẫu có thể được thu bằng cách dùnh gạc bơng gịn lấy mẫu tại vết thương. Mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của bệnh phẩm.
II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh.
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các
mầm bệnh cơ hội
II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật
II.2.2.1. Ứng dụng
Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm
II.2.2.2. Phương pháp
Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dịng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin để tránh nhiễm khuẩn.
II.2.2.3. Mẫu phân tích
Mẫu ruột, phân, máu hay các mơ cơ thể. Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý có chứa kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi chuyển mẫu đến phịng thí nghiệm trong vịng 24 giờ.
II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh.
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được
xử lý trong vịng 24 giờ
II.2.3. Ni vi-rút
II.2.3.1. Ứng dụng
Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chẩn đoán nhiễm vi-rút. Việc phân lập vi-rút thường gắn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp thu mẫu cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút.
II.2.3.2. Phương pháp
Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên việc nuôi vi-rút thường được thực hiện trên tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống. Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri hoặc trong lọ tiệt trùng. Mẫu được nghiền và sau đó cho vào mơi trường ni cấy và nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển.
II.2.3.3. Mẫu phân tích
Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể khơng cịn hiện diện trên cơ thể vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý. Tùy theo điều kiện thực tế mà mẫu có thể được vận chuyển sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng để chuyển về phịng thí nghiệm.
Mẫu gởi đến phịng thí nghiệm phải kèm theo các thơng tin về loại mẫu, loại vi-rút tình nghi bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý liên quan đến vi-rút đó. Mẫu được thu có thể là mẫu mơ hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu được thu với dung dịch chống đông.
Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phịng thí nghiệm phân tích hướng dẫn. Một số phịng thí nghiệm địi hỏi mẫu phải được giữ trong mơi trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mẫu phải được vận chuyển trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong vòng 5 ngày. Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mẫu ở -70°C, v.v….
II.2.3.4. Đọc kết quả
Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng cứ cho sự nhiễm vi-rút. Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Điều cần thiết trong q trình chẩn đốn là phải có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Việc này địi hỏi những kỹ thuật có thể xác định vai trò gây bệnh của vi-rút như tế bào học hoặc mô bệnh học đi kèm theo bằng những phương pháp như IHC hay hiển vi điện tử. Cần phải ghi nhận rằng hiện tại qui trình PCR đã được phát triển đối với hầu hết vi-rút gây bệnh ở thủy sản giúp cho việc sàng lọc và xác định vi-rút mới khá hiệu quả. Tuy nhiên việc sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh cần phải được thận trọng khi xác nhận quan hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý.
II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II
1. Alday de Graindorge, V. and Flegel, T.W. (1999). Diagnosis of shrimp diseases with emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon.
2. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition
3. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. Fisheries technical paper
402/2.
4. Forbes, B. A., Sahm, D. F., and Weissfeld, A. S. (2002). Laboratory methods in basic virology In: Diagnostic Microbiology. 11th edition.
5. Hirsh, D. C., MacLachlan, N. J., and Walker, R. L. (2004). Laboratory Diagnosis. In: Veterinary Microbiology 2nd edition.
6. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp.
7. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment. 8. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.
9. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi.
10. Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S. (1999). Diagnostic Procedures for Finfish Diseases
11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình bệnh học thủy sản.
CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH
Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thơng tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi.
III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH III.1.1. Nguyên lý
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù hợp với kháng thể.
Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro.
Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack, 1934) (hình 3.1).
Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng
Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau: - Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị.
- Kháng nguyên đa hóa trị
- Kháng ngun phải hịa tan và thành phần của mơi trường như lực ion hay pH có vai trò nhất định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa.
- Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid là những chất gây tủa tốt nhất, còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hịa tan và ít kết tủa hơn.
- Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ kết tủa
III.1.2. Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong mẫu huyết thanh hay huyết tương bằng cách định tính hay định lượng.
III.1.3. Mẫu phân tích
Mẫu huyết thanh hay huyết tương.
III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch
III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng
Phương pháp Heideiberger và Kendall
Phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi khơng, đó là do thay đổi tỷ lệ nồng độ tương đối giữa kháng thể và kháng nguyên. Trong một loạt ống thí nghiệm, cho đều cùng một lượng kháng thể khơng thay đổi. Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần. Kết quả là hiện tượng kết tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình 3.2). Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống. Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể bị tủa. Nếu lấy ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể có trong huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng thể đã bị tủa. Hơn nữa, nếu biết được lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên và kháng thể thì người ta có thể tính ra cơng thức của phức hợp
Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép xác định được 3 khu vực:
- Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể.
- Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng khơng cho phép hình thành mạng lưới 3 chiều.
- Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tối ưu cho phép tủa gần hết các phân tử kháng thể và kháng nguyên.
Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng
Định lượng bằng đo độ đục
Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định lượng có giá trị cao.
Kỹ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM…và trong việc tìm các kháng kháng thể.
III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel
Nguyên lý
Kháng thể cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau thì gây tủa, tủa ấy khơng di chuyển và hiện lên trông thấy bằng mắt thường hoặc nhuộm.