Ứng dụng: PCR thời gian thật (real-time PCR) là dạng biến hoá của PCR được sử dụng
để phát hiện trình tự và số lượng DNA hoặc RNA của mầm bệnh.
Phương pháp: căn cứ trên sự phân cắt DNA theo chiều 5'-3' của DNA polymerase cắt
mẫu dò được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang trong phản ứng PCR giúp xác định cường độ của chất đánh dấu và từ hệ số tương quan tính được hàm lượng DNA trong mẫu phân tích.
Mẫu sử dụng: mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét, mẫu là mẫu tươi hay được lưu trữ ở -70 °C.
Ưu điểm: phương pháp PCR thời gian thật rất nhạy và chuyên biệt. Cho phép xác định số
lượng vi-rút nhiễm trong mơ của bệnh phẩm. Qui trình thực hiện trong vịng (24 – 48 giờ).
Nhược điểm: tốn kém, địi hỏi thời gian và trình độ chun mơn để thiết kế qui trình.
IV.2. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI HẠN IV.2.1. Nguyên lý
Kỹ thuật phân tích tính đa dạng về chiều dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism-RFLP) dựa trên sự tách biệt từng đoạn DNA bằng các enzym giới hạn (restriction enzyme-RE). Sự di chuyển của DNA từ thạch đến màng thấm và sử dụng mẫu dò DNA qua phương pháp lai phân tử để phát hiện các đoạn DNA với trình tự đặc hiệu.
Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò DNA với các phân tử DNA được lưu giữ trên giá thể để dị tìm các phân tử sinh học đặc trưng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lưu giữ như màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhưng vẫn duy trì được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác.
IV.2.2. Phương pháp
Phương pháp Southern được Giáo sư Edwin M. Southern xây dựng và thử nghiệm thành cơng vào năm 1975. Ở đây, q trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn DNA bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau. Các bước tiến hành trong kỹ thuật này có thể được tóm tắt như sau:
- DNA bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng một hay nhiều enzym giới hạn (RE) và được phân tách bằng điện di trên bản gel.
- DNA được biến tính ngay trên gel rồi được thấm truyền lên màng lai. Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn DNA trên màng lai được giữ nguyên như trên bản gel.
- DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dị DNA có đánh dấu bằng phóng xạ hoặc hố học. Sau quá trình lai người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dị khơng bắt cặp.
- Cuối cùng người ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hố học tự ghi để định vị các phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang.
Việc phát hiện các phân tử trên màng được tiến hành thông qua kỹ thuật đánh dấu. Phổ biến nhất là gắn các nucleotide với các đồng vị phóng xạ 32P dạng 32P-dNTP. Ưu điểm lớn của phương pháp phóng xạ này là có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện được vết DNA ở mức ng (10-9 g) và thấp hơn. Tuy nhiên phương pháp đánh dấu phóng xạ địi hỏi phịng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra và bảo đảm an tồn phóng xạ đồng bộ. Những năm gần đây kỹ thuật phi phóng xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh (cold labelling) đang từng bước thay thế kỹ thuật phóng xạ. Trong đó nổi bật là kỹ thuật phát quang hố học kích hoạt (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) và kỹ thuật sử dụng đánh dấu với digoxigenin (DIG).