Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thơng tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi.
III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH III.1.1. Nguyên lý
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù hợp với kháng thể.
Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro.
Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack, 1934) (hình 3.1).
Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng
Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau: - Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị.
- Kháng nguyên đa hóa trị
- Kháng ngun phải hịa tan và thành phần của mơi trường như lực ion hay pH có vai trị nhất định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa.
- Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid là những chất gây tủa tốt nhất, còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hịa tan và ít kết tủa hơn.
- Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ kết tủa
III.1.2. Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong mẫu huyết thanh hay huyết tương bằng cách định tính hay định lượng.
III.1.3. Mẫu phân tích
Mẫu huyết thanh hay huyết tương.
III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch
III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng
Phương pháp Heideiberger và Kendall
Phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi khơng, đó là do thay đổi tỷ lệ nồng độ tương đối giữa kháng thể và kháng nguyên. Trong một loạt ống thí nghiệm, cho đều cùng một lượng kháng thể khơng thay đổi. Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần. Kết quả là hiện tượng kết tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình 3.2). Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống. Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể bị tủa. Nếu lấy ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể có trong huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng thể đã bị tủa. Hơn nữa, nếu biết được lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên và kháng thể thì người ta có thể tính ra cơng thức của phức hợp
Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép xác định được 3 khu vực:
- Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể.
- Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép hình thành mạng lưới 3 chiều.
- Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tối ưu cho phép tủa gần hết các phân tử kháng thể và kháng nguyên.
Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng
Định lượng bằng đo độ đục
Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định lượng có giá trị cao.
Kỹ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM…và trong việc tìm các kháng kháng thể.
III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel
Nguyên lý
Kháng thể cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau thì gây tủa, tủa ấy khơng di chuyển và hiện lên trông thấy bằng mắt thường hoặc nhuộm.
Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony)
Trong một lớp thạch không dày, đục thủng suốt những lỗ cách đều nhau, khoảng cách này phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của từng chất phản ứng. Rồi nhỏ vào trong mỗi lỗ đối diện với nhau một dung dịch kháng nguyên và kháng thể. Thời gian xuất hiện các đường cung tủa có thể là hai ngày đến một tuần.
Hình 3.3. Khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony)
Kỹ thuật này dù ít nhạy nhưng cho phép phân tích các hệ thống kháng nguyên- kháng thể. Muốn so sánh giữa hai kháng nguyên hay để phát hiện sự có mặt của nhiều kháng thể trong một huyết thanh thì có thể bố trí hai lơ kháng nguyên trước một lỗ có chứa huyết thanh. Kết quả có thể: (i) Phản ứng giống hệt khi hai kháng nguyên y hệt nhau hay có epitop tương tự thì các đường kết tủa với kháng thể sẽ nối liền nhau; (ii) Phản ứng không y hệt nếu hai kháng nguyên khác nhau thì sẽ kết hợp riêng với hai kháng thể và hai đường kết tủa sẽ cắt chéo nhau hoặc (iii) Phản ứng giống một phần khi hai kháng nguyên có cùng một epitop và một epitop riêng khác nhau thì các kháng thể tương ứng sẽ cho một đường tủa chung liền với nhau và một đường tủa phụ gắn với đường tủa trước đối với kháng nguyên thứ hai (hình 3.3).
Ngược lại, có thể dùng kỹ thuật này để so sánh với nhau hai kháng huyết thanh gây tủa để xem chúng có nhận biết cùng một kháng nguyên hay không. Kỹ thuật này rất hay được dùng để phát hiện các kháng thể chống nhân của một người so với một huyết thanh chuẩn.
Miễn dịch khuếch tán vòng (kỹ thuật Mancini)
Kỹ thuật này dùng để định lượng kháng nguyên. Kháng thể đặc hiệu được hòa đều vào trong thạch trước khi đổ dãy thạch lên trên kính hay hộp petri. Sau đó, đục các lỗ và cho vào đó dung dịch kháng ngun có độ pha lỗng khác nhau. Kháng nguyên sẽ khuếch tán và gặp kháng thể ngay trong thạch và tạo nên những vòng kết tủa mà bề mặt của nó sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Việc định lượng được suy ra từ một đường biểu diễn chuẩn lập ra từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên.
III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện
Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell)
Xuất phát từ nguyên lý của kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật này chỉ khác ở chỗ là sự di chuyển của các kháng nguyên định lượng được thực hiện trong điện trường. Do đó vùng kết tủa có hình tên lửa (cịn gọi là điện di tên lửa) (hình 3.4). Chiều dài của hình tên lửa tỷ lệ với nồng độ kháng nguyên. Kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật Mancini nhưng dùng nhiều chất phản ứng hơn.
Hình 3.4. Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu
Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar và Williams)
Khi dung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng ngun thì khuếch tán kép không đủ để xác định mọi đường kết tủa. Miễn dịch điện di bổ sung thiếu sót ấy bằng cách tách trước các kháng nguyên theo tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường rồi mới gây tủa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu rải trong một rãnh đào sẵn dọc theo chiều điện di. Các đường tủa xuất hiện theo hình thức những cung ở hai bên rãnh.
Kỹ thuật này chủ yếu được dùng để định tính, cho phép đánh giá có hiện tượng tủa hay không so với một đối chứng. Đây là một kỹ thuật tốt để xác định một Ig đơn dòng do tạo ra một cung tủa dày hơn, cong và gần rãnh hơn đồng thời nối liền với cung tủa của Ig huyết thanh cùng lớp.
III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ
Trong kỹ thuật này dịch sinh học định nghiên cứu được cho chạy điện di trước, sau đó cho tác dụng của kháng thể đặc hiệu ngay trên lớp thạch để hình thành kết tủa kháng nguyên- kháng thể. Như vậy, các thành phần của hỗn hơp phức tạp như huyết thanh được tách ra bằn điện di trong thạch. Sau đó, các phân tử khác nhau định nghiên cứu sẽ được tủa một cách chọn lọc bằng các kháng huyết thanh đặc hiệu với các ptotein đã di chuyển
ngay trên bề mặt của thạch. Kháng thể này nhanh chóng thấm vào bên trong gel của thạch và kết tủa tại chỗ kháng nguyên tương ứng. Những phân tử khơng bị kết tủa thì sẽ được rửa cho đến hết. Từ đó, dễ dàng nhuộm các phức hợp kháng nguyên- kháng thể và sẽ cho ra một hình ảnh chính xác của tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di. Kỹ thuật này rất nhanh và nhạy hơn kỹ thuật điện di để chuẩn đốn những bất thường đơn dịng của Ig. Nó có lợi hơn là kháng ngun khơng có thời gian để khuếch tán trước khi bị kết tủa bởi kháng thể. Tính thuần nhất của một thành phần đơn dịng nào đó nếu có ở một lượng rất thấp thì cũng được bảo tồn trong kỹ thuật này. Sau cùng việc giải thích những hình ảnh thu được cũng dễ dàng hơn trong kỹ thuật miễn dịch điện di.
III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.1.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật đơn giản
III.1.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở dạng hịa tan thì mới có thể khuếch tán được. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy khơng cao.
III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH III.2.1. Nguyên lý
Hiện tượng ngưng kết là do cơ chế hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường có thể nhìn thấy được. Mạng lưới chỉ có thể xuất hiện với các kháng thể có ít nhất là hai hóa trị. IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết mạnh hơn IgG. Nói chung các kháng ngun hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên khơng bị hạn chế.
Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch địi hỏi kháng ngun hữu hình. Đó là kháng ngun có kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật. Kháng ngun hữu hình có epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường. Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh.
Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng trong một dung môi. Các tiểu phần giữ được trạng thái.
III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết
Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chất trơ làm giá đỡ cho các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân tạo lên bề mặt của nó, trong đó thường dùng là hồng cầu đã xử lý bằng formol.
III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp:
Cho các hạt hữu hình có mang sẵn các nhóm quyết định kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn trên các hạt sẽ dẫn đến hình thành mạng lưới và ngưng kết.
III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp:
Kháng nguyên hòa tan được cố định trên những hạt khác nhau tùy theo typ phản ứng, sau đó hỗn hợp hạt sẽ được cho tiếp xúc với huyết thanh trong những điều kiện như ngưng kết trực tiếp.
III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo:
Khi kháng thể không phát huy được tác dụng trên hai vị trí trên, nghĩa là hiện tượng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có xảy ra mà vẫn có hiện tượng ngưng kết. Coombs đã cho thêm kháng thể anti-globulin tạo một cầu nối giữa globulin miễn dịch đã có sẵn trên hạt theo hai hình thức sau: test coombs trực tiếp thử trên hồng cầu đã có gắn sẵn một cách tự nhiên các kháng thể không gây ngưng kết, khi cho thêm kháng thể anti-globulin vào thì sẽ gây ngưng kết; Test Coombs gián tiếp là một test huyết thanh cho phép tìm xem trong
một huyết thanh có hay khơng có kháng thể chống hồng cầu nhưng không gây ngưng kết. Đầu tiên, ủ huyết thanh với một loại hồng cầu đã biết rõ nhóm. Sau đó, rửa sạch thì trên hồng cầu chỉ còn bám kháng thể trong huyết thanh cho nên khi thêm kháng thể anti- glubolin và nếu có ngưng kết thì có nghĩa là trong ấy có kháng thể định tìm (hình 3.5).
III.2.3. Ứng dụng
Phát hiện kháng nguyên và đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với một kháng nguyên dạng hạt. Có 3 dạng thường gặp:
- Ức chế sự ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu.
- Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh được tạo ra để chống lại sự nhiễm khuẩn.
- Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó .
III.2.4. Mẫu phân tích
Mẫu huyết tương hay huyết thanh
III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.2.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật khá đơn giản
III.2.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở dạng hạt. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy khơng cao.
III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG III.3.1. Nguyên lý III.3.1. Nguyên lý
Trong kỹ thuật này kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu sẽ phát sáng. Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, còn rodamin phát quang màu đỏ da cam. Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là kháng thể đánh dấu hoặc kháng thể huỳnh quang.
III.3.2. Phương pháp
III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Kỹ thuật chỉ có hai thành phần: Kháng nguyên và kháng thể, tạo ra hai lớp của phản ứng. Một trong hai thành phần được gắn trực tiếp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Đầu tiên người ta cố định vi khuẩn trên lam kính sau đó phủ kháng thể huỳnh quang lên để kháng thể gắn với tế bào vi khuẩn. Rửa loại bỏ kháng thể thừa rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chỉ có các vi khuẩn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang mới được quan sát (hình 3.6).
Hình 3.6. Kháng thể huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp
Kỹ thuật này ngồi hai thành phần chính là kháng ngun và kháng thể đặc hiệu tạo ra hai lớp của phản ứng cịn có một thành phần nữa được gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, tạo lớp thứ ba là kháng- kháng thể (hình 3.7).
III.3.3. Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng nguyên của một mầm bệnh chuyên biệt trong mô hay tế bào bị nhiễm bệnh. Phương pháp khá tương tự như kỹ