Trong kỹ thuật này dịch sinh học định nghiên cứu được cho chạy điện di trước, sau đó cho tác dụng của kháng thể đặc hiệu ngay trên lớp thạch để hình thành kết tủa kháng nguyên- kháng thể. Như vậy, các thành phần của hỗn hơp phức tạp như huyết thanh được tách ra bằn điện di trong thạch. Sau đó, các phân tử khác nhau định nghiên cứu sẽ được tủa một cách chọn lọc bằng các kháng huyết thanh đặc hiệu với các ptotein đã di chuyển
ngay trên bề mặt của thạch. Kháng thể này nhanh chóng thấm vào bên trong gel của thạch và kết tủa tại chỗ kháng nguyên tương ứng. Những phân tử khơng bị kết tủa thì sẽ được rửa cho đến hết. Từ đó, dễ dàng nhuộm các phức hợp kháng nguyên- kháng thể và sẽ cho ra một hình ảnh chính xác của tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di. Kỹ thuật này rất nhanh và nhạy hơn kỹ thuật điện di để chuẩn đốn những bất thường đơn dịng của Ig. Nó có lợi hơn là kháng ngun khơng có thời gian để khuếch tán trước khi bị kết tủa bởi kháng thể. Tính thuần nhất của một thành phần đơn dịng nào đó nếu có ở một lượng rất thấp thì cũng được bảo tồn trong kỹ thuật này. Sau cùng việc giải thích những hình ảnh thu được cũng dễ dàng hơn trong kỹ thuật miễn dịch điện di.
III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.1.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật đơn giản
III.1.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở dạng hịa tan thì mới có thể khuếch tán được. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy khơng cao.
III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH III.2.1. Nguyên lý
Hiện tượng ngưng kết là do cơ chế hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường có thể nhìn thấy được. Mạng lưới chỉ có thể xuất hiện với các kháng thể có ít nhất là hai hóa trị. IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết mạnh hơn IgG. Nói chung các kháng ngun hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên khơng bị hạn chế.
Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch địi hỏi kháng ngun hữu hình. Đó là kháng ngun có kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật. Kháng ngun hữu hình có epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường. Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh.
Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng trong một dung môi. Các tiểu phần giữ được trạng thái.
III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết
Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chất trơ làm giá đỡ cho các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân tạo lên bề mặt của nó, trong đó thường dùng là hồng cầu đã xử lý bằng formol.
III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp:
Cho các hạt hữu hình có mang sẵn các nhóm quyết định kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn trên các hạt sẽ dẫn đến hình thành mạng lưới và ngưng kết.
III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp:
Kháng nguyên hòa tan được cố định trên những hạt khác nhau tùy theo typ phản ứng, sau đó hỗn hợp hạt sẽ được cho tiếp xúc với huyết thanh trong những điều kiện như ngưng kết trực tiếp.
III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo:
Khi kháng thể không phát huy được tác dụng trên hai vị trí trên, nghĩa là hiện tượng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có xảy ra mà vẫn có hiện tượng ngưng kết. Coombs đã cho thêm kháng thể anti-globulin tạo một cầu nối giữa globulin miễn dịch đã có sẵn trên hạt theo hai hình thức sau: test coombs trực tiếp thử trên hồng cầu đã có gắn sẵn một cách tự nhiên các kháng thể không gây ngưng kết, khi cho thêm kháng thể anti-globulin vào thì sẽ gây ngưng kết; Test Coombs gián tiếp là một test huyết thanh cho phép tìm xem trong
một huyết thanh có hay khơng có kháng thể chống hồng cầu nhưng không gây ngưng kết. Đầu tiên, ủ huyết thanh với một loại hồng cầu đã biết rõ nhóm. Sau đó, rửa sạch thì trên hồng cầu chỉ còn bám kháng thể trong huyết thanh cho nên khi thêm kháng thể anti- glubolin và nếu có ngưng kết thì có nghĩa là trong ấy có kháng thể định tìm (hình 3.5).
III.2.3. Ứng dụng
Phát hiện kháng nguyên và đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với một kháng nguyên dạng hạt. Có 3 dạng thường gặp:
- Ức chế sự ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu.
- Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh được tạo ra để chống lại sự nhiễm khuẩn.
- Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó .
III.2.4. Mẫu phân tích
Mẫu huyết tương hay huyết thanh
III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.2.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật khá đơn giản
III.2.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở dạng hạt. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy khơng cao.
III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG III.3.1. Nguyên lý III.3.1. Nguyên lý
Trong kỹ thuật này kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu sẽ phát sáng. Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, còn rodamin phát quang màu đỏ da cam. Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là kháng thể đánh dấu hoặc kháng thể huỳnh quang.
III.3.2. Phương pháp
III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Kỹ thuật chỉ có hai thành phần: Kháng nguyên và kháng thể, tạo ra hai lớp của phản ứng. Một trong hai thành phần được gắn trực tiếp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Đầu tiên người ta cố định vi khuẩn trên lam kính sau đó phủ kháng thể huỳnh quang lên để kháng thể gắn với tế bào vi khuẩn. Rửa loại bỏ kháng thể thừa rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chỉ có các vi khuẩn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang mới được quan sát (hình 3.6).
Hình 3.6. Kháng thể huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp
Kỹ thuật này ngồi hai thành phần chính là kháng ngun và kháng thể đặc hiệu tạo ra hai lớp của phản ứng cịn có một thành phần nữa được gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, tạo lớp thứ ba là kháng- kháng thể (hình 3.7).
III.3.3. Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng nguyên của một mầm bệnh chuyên biệt trong mô hay tế bào bị nhiễm bệnh. Phương pháp khá tương tự như kỹ thuật IHC, cho phép việc phát hiện kháng nguyên qua sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể có đánh dấu huỳnh quang.
III.3.4. Mẫu phân tích
Mẫu phân tích có thể là mẫu mô, mẫu tế bào, huyết thanh. Các mẫu này có thể được lưu trữ bằng cách đơng lạnh, làm khô hay cố định trong dung dịch cố định thích hợp.
III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.3.5.1. Ưu điểm:
Có tính nhạy cao và thao tác nhanh để phát hiện và định dạng mầm bệnh trong mẫu kính phết, mơ hay tế bào.
III.3.5.2. Nhược điểm:
Đòi hỏi phải sử dụng kháng thể huỳnh quang hoặc kháng huyết thanh. Việc đọc kết quả đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc chẩn đoán để phân biệt những trường hợp dương tính giả và âm tính giả. Phản ứng chéo của kháng thể với kháng nguyên khá có thể xảy cho nên kháng thể sử dụng phải có tính chun biệt cao.
Hình 3.7. Kỹ tḥt miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
III.4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM III.4.1. Nguyên lý III.4.1. Nguyên lý
Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA-Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật phóng xạ thì kỹ thuật này rất rẻ tiền và an tồn hơn mà vẫn chính xác như nhau.
Ngun tắc của kỹ thuật ELISA giống như kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nhưng thay vì kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất này thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên với kháng thể, thông qua cường độ màu người ta biết được nồng độ của kháng nguyên cần phát hiện.
Kỹ thuật ELISA được chia làm hai dạng là ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp. Các enzym thường dùng trong kỹ thuật ELISA là -galactoxidaza, glucooxidaza, peroxidazza
và phophadaza kiềm. ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như vi-rút, vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng.
III.4.2. Ứng dụng
ELISA được sử dụng để đánh giá sự tiếp xúc của mẫu bệnh phẩm với những tác nhân gây bệnh khác nhau như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng. Kháng nguyên được làm tinh sạch và hàm lượng kháng thể sử dụng cũng như hàm lượng kháng nguyên có thể xác định được.
III.4.3. Mẫu phân tích
Huyết thanh hay huyết tương
III.4.4. Phương pháp
Hàm lượng kháng thể sử dụng để kết hợp với kháng nguyên của mầm bệnh được xác định bằng biểu đồ hàm lượng kháng thể chuẩn. Kết quả được đọc bằng hàm lượng kháng thể.
III.4.4.1. Kỹ thuật ELISA gián tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng nguyên.
- Nhỏ huyết thanh có kháng thể (ví dụ antitoxin) vào giếng ở bảng nhựa để cho kháng thể bám vào thành giếng.
- Nhỏ tiếp dịch kháng nguyên cần xét nghiệm (ví dụ toxin). Nếu là kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ gắn với kháng thể.
- Thêm cộng hợp gắn enzym vào giếng để cho kháng thể của cộng gắn với kháng nguyên mà trước đó đã gắn với kháng thể đầu tiên, tạo nên một “bánh mì kẹp chả” là kháng thể- kháng nguyên- kháng thể gắn enzym (hình 3.8a).
- Bổ sung cơ chất của enzym. Enzym sẽ thủy phân cơ chất này làm thay đổi màu của dung dịch. Tốc độ thủy phân của enzym sẽ tỉ lệ thuận với lượng kháng thể đã gắn enzim, cũng có nghĩa là tỉ lệ thuận với kháng nguyên cần xét nghiệm. Sự thay đổi màu dung dịch có thể nhìn thấy được bằng mắt thường hoặc đo được bằng quang phổ kế.
Hình 3.8. Kỹ thuật ELISA: (a) ELISA gián tiếp; (b) ELISA trực tiếp (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên; S: cơ chất)
III.4.4.2. Kỹ thuật ELISA trực tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng thể. - Nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp thụ lên thành giếng.
- Nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ. Nếu trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu thì sẽ gắn với nó.
- Thêm cộng hợp kháng- kháng thể đã gắn enzym. Kháng thể này được tạo thành để khống chế kháng thể người.
- Thêm cơ chất của enzym. Tốc độ thủy phân cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu của dung dịch và tỉ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định trong mẫu. Sự thay đổi màu có thể quan sát bằng mắt thường hay quang phổ kế (hình 3.8b).
III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.4.5.1. Ưu điểm:
Phương pháp ELISA là phương pháp khá nhạy và dễ thực hiện. Có thể xét nghiệm cùng một lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian thực hiện ngắn nên được xem như là phương pháp vàng trong sàng lọc/phát hiện bệnh.
III.4.5.2. Nhược điểm:
Cần phải có kháng thể đơn dịng hay đa dòng phù hợp với kháng nguyên của mầm bệnh cần xét nghiệm.
III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III
1. Kuby, J. (1997). Antigen-Antibody Interactions. In: Immunology. 3rd edition. 2. Vũ Triệu An và Jean, C.H. (2001). Miễn dịch học.
3. Nguyễn Lân Dũng. (2000). Vi sinh vật học.
4. Nguyễn Ngọc Lành. (1997). Miễn dịch học.
5. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. (2002). Biology of Microorganisms. 10th edition.
CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ
IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dịng DNA in vitro khơng cần có sự hiện diện của tế bào.
IV.1.1. Nguyên tắc
Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau (hình 4.1):
IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94-95 ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.
IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):
Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70 ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1phút. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):
Nhiệt độ được tăng lên đến 72 ºC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotit/giây ở 70oC; 24 nucleotit/giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/giây.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản
sẽ tạo ra 2n bản DNA từ một khuôn ban đầu. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu.
Hình 4.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR
IV.1.2. Ứng dụng
PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cDNA để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. PCR cũng được dùng để phân tích tiến hố, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể.