Nghiên cứu thu nhận n acetyl d glucosamine ứng dụng chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== ĐỒNG THỊ HƢƠNG TRẦM NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE ỨNG DỤNG CHITINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== ĐỒNG THỊ HƢƠNG TRẦM NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE ỨNG DỤNG CHITINASE CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi Đồng Thị Hương Trầm xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu thu nhận N-Acetyl-D-Glucosamine ứng dụng chitinase” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Thanh Hà, Th.S Dương Thị Ngọc Quỳnh – tận tình giúp đỡ, trực tiếp bảo, hướng dẫn thời gian làm thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Học viên Đồng Thị Hƣơng Trầm MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Chitin – nguyên liệu cho sản xuất GlcNAc 1.1.1 Cấu trúc hóa học 1.1.2 Tính chất chitin 1.1.3 Ứng dụng thương mại chitin 1.2 Chitinase chế xúc tác thủy phân chitin 1.2.1 Giới thiệu enzyme chitinase 1.2.2 Phân loại enzyme chitinase 1.2.3 Cơ chế thủy phân chitin chitinase 1.2.4 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 1.3 Tổng quan N-acetyl-D-glucosamine 10 1.3.1 Cấu trúc hóa học tính chất GlcNAc 10 1.3.2 Ứng dụng N-acetyl-D-glucosamine y h ọc, sinh học, mỹ phẩm 11 1.3.3 Phương pháp thu nhận GlcNAc 12 1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân chitin thành GlcNAc14 1.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 14 1.4.2 Ảnh hưởng pH 15 1.4.3 Ảnh hưởng thời gian thủy phân 15 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu 17 2.2 Hóa chất 17 2.3 Thiết bị 17 2.4 Môi trƣờng 18 2.5 Phƣơng pháp 19 2.5.1 Phương pháp nghiên cứu 19 2.5.2 Phương pháp phân tích 22 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Nghiên cứu điều kiện thu nhận bảo quản dịch enzyme chitinase 27 3.1.1 Nghiên cứu điều kiện cô đặc enzyme chitinase 27 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt tính chitinase kh ả thủy phân chế phẩm chitinase 28 3.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin chitinase từ Penicillium oxalicum 20B 34 3.2.1 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ 34 3.2.2 Ảnh hưởng pH môi trường 35 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian thủy phân 36 3.3 Nghiên cứu thu hồi N-acetyl-D-glucosamine từ dịch thủy phân chitin enzyme chitinase thô thu từ Penicillum oxalicum 20B 38 3.3.1 Khảo sát phương pháp thu hồi sản phẩm N-acetyl-Dglucosamine dạng bột 38 3.3.2 Nghiên cứu tinh N-acetyl-D-glucosamine 41 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 50 Xây dựng đƣờng chuẩn N-acetyl-D-glucosaminetheo phƣơng pháp DNS50 Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin enzyme chitinase thô thu Nacetyl-D-glucosamine 51 Nghiên cứu điều kiện cô đặc dịch enzyme chitinase 54 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện bảo quản đến hoạt tính chitinase khả thủy phân chế phẩm chitinase 54 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine E:S Tỷ lệ enzyme : chất GH 18 Glycohydrolase 18 GH 19 Glycohydrolase 19 DNS Dinitrosalicylic acid DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Chitin Hình 1.2 dạng cấu trúc chitin Hình 1.3 Sơ đồ lớp chitinase Hình 1.4 Cơ chế phân cắt chitin Hình 1.5 Cấu trúc hóa học GlcNAc 10 Hình 2.1 Các bước thu hồi N-acetyl-D-gucosamine 22 Hình 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến hoạt tính chitinase 29 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến hàm lượng GlcNActhu sau 72h thủy phân 30 Hình 3.3 Ảnh hưởng chất bảo quản đến hoạt tính chitinase 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng chất bảo quản bổ sung đến hàm lượng GlcNAc thu sau 72h thủy phân 32 Hình 3.5 Hình ảnh TLC sản phẩm thủy phân chitinhuyền phù 20% chitinase với điều kiện bảo quản (18 ngày) 32 Hình 3.6 Hình ảnh TLC sản phẩm thủy phân chitin huyền phù 20% chitinase với điều kiện bảo quản (217 ngày) 33 Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độđến khả thủy phân chitin huyền phù chitinase thô thu từ canh trường lên men Penicilium oxalicum 20B 34 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH đến khả thủy phân chitin huyền phù chitinase thô thu từ canh trường lên men Penicilium oxalicum 20B 35 Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân GlcNAc 36 Hình 3.10 Hình ảnh TLC sản phẩm thủy phân chitinhuyền phù 20% chitinase thô thu từ canh trường lên men Penicilium oxalicum 20B 37 Hình 3.11 Hình ảnh sản phẩm GlcNAc sau sấy phun 39 Hình 3.12 Hình ảnh TLC sản phẩm GlcNAc sau đông khô 40 Hình PL1 Phương trình đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine 51 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự khác chitinase họ glycohydrolase 18 19 Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng môi trường PDA 18 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường Czapeck 18 Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng môi trường MS-Chitin 19 Bảng 2.4 Nghiên cứu điều kiện thủy phân 20 Bảng 2.5 Các điều kiện bảo quản enzyme chitinase 21 Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ cô đặc dịch enzyme Penicillium oxalicum 20B 27 Bảng 3.2 Kết sấy phun 38 Bảng 3.3 Kết sấy đông khô 39 Bảng 3.4 Kết cô đặc tinh 41 Bảng PL1 Kết xây dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine 50 Bảng PL2 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin 51 Bảng PL3 Ảnh hưởng điều kiện pH đến hiệu suất thủy phân chitin 52 Bảng PL4 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân chitin 52 Bảng PL5 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thủy phân chitin 53 Bảng PL6 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân chitin 54 Bảng PL7 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ chất bảo quản đến hoạt tính enzyme chitinase 54 Bảng PL8 Ảnh hưởng nhiệt độ chất bảo quản đến hàm lượng GlcNAc lại 55 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 3.3.2 Nghiên cứu tinh N-acetyl-D-glucosamine Tiến hành tinh GlcNAc theo qui trình mơ tả phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Dịch thủy phân có hàm lượng GlcNAc đạt 6,70mg/mL ly tâm 10000vòng/phút, 15 phút để loại cặn chất dư Sau dịch xử lý với than hoạt tính nồng độ 20g/l 80oC 15 phút Dịch sau lọc than hoạt tính đem tiến hành quay dịch từ 1500ml xuống 30ml Theo dõi kết tinh 48h, sau 48h khơng có kết tinh, tiến hành kết tủa cồn đến 90o qua đêm Sau kết tủa cồn, ly tâm 10000vòng/phút thu dịch kết tủa mẫu Tiếp tục đặc loại cồn Q trình đặc thu mẫu sản phẩm kí hiệu từ đến B 10Bảng 3.4 Kết cô đặc tinh t Tên mẫu Bƣớc tinh GlcNAc V (ml) (mg/ml) Khối lƣợng (g) GlcNAc (mg/g) GlcNAc (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Thủy phân 6,7 1800 12065,29 Sau lọc than 20g/l 6,28 1500 9425,31 Cặn sau kết tủa cồn 3,72 5,85 0,59 36,88 21,75 Hạt kết tinh to, vàng dịch sau kết tủa cồn ly tâm loại cặn, để lạnh ngày 10,05 10 0,95 105,79 100,50 1,07 9,73 20 1,45 134,21 194,60 2,07 13,32 20 1,7 156,71 266,40 2,83 Hạt kết tinh nhỏ, trắng thành bình dịch sau kết tủa cồn ly tâm loại cặn, để lạnh ngày Cặn trắng bám bình hình thành cô quay Học viên: Đồng Thị Hương Trầm 100 0,23 Trang 41 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Dịch bám thành bình sau quay Dịch sau kết tinh, đặc 14,73 Sấy đông khô 11,56 22,91 10 229,10 2,43 571,33 8415,69 89,34 728 8415,68 89,34 Tổng cộng (1-6) 97,96 Kết bảng 3.4 cho thấy trình lọc than hoạt tính làm sáng màu dung dịch làm thất gần 22% lượng GlcNAc Q trình kết tinh có loại số hạt kết tinh hình thành q trình để lạnh quay Các mẫu kết tinh có hàm lượng GlcNAc (mg/g) nhỏ nhiều lần so với sản phẩm làm tăng độ tinh sản phẩm Mẫu sản phẩm dạng paste có độ ẩm 21,5%, tổng lượng mẫu thu 14,73g Hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt 89,34% Lượng GlcNAc mẫu kết tinh cặn loại vào khoảng 8% chứng tỏ khoảng 2% thất thoát chưa thu hồi Độ tinh mẫu thu theo qui trình đạt 73,26%, tăng khoảng 16 % so với nghiên cứu trước lượng muối kết tinh loại bỏ Hình 3.14 Hình ảnh mẫu (A), (B) (C) Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 42 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dịch enzyme chitinase thô lên men từ chủng Penicilium oxalicum 20B cô đặc lần với hiệu suất thu hồi enzyme 69,12%, mức độ tinh 0,79% Ở điều kiện nhiệt độ 4oC có bổ sung chất bảo quản NaCl, hoạt tính enzyme chitinase giữ ổn định giữ 50% hoạt tính sau 217 ngày bảo quản Hàm lượng GlcNAc thu thủy phân chitinase sau 217 ngày bảo quản giảm 20% Điều kiện thích hợp cho trình thủy phân chitin enzyme chitinase từ chủng Penicilium oxalicum 20B nhiệt độ 400C, pH=5 thời gian 72h Q trình sấy phun sấy đơng khơ ứng dụng thu sản phẩm sấy đơng khơ cho sản phẩm có độ tinh cao Tinh GlcNAc theo qui trình đề xuất đạt hiệu suất thu hồi 89,34% độ tinh sản phẩm đạt 73,26% Kiến nghị Xác định đặc tính chế phẩm chitinase đặc Tiếp tục nghiên cứu quy trình tinh để thu GlcNAc với độ tinh cao Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 43 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Aizi Nor Mazila Ramli, Nor Muhammad Mahadi, Amir Rabu, Abdul Munir Abdul Murad, Farad Diba Abu Bakar and Rosli Md lllias (2011), "Molecular cloning, expression and biochemical characterization of a cold-adapted novel recombinant chitinase from Glaciozyma antarctia Pl12".Microbial Cell Factories, 10(94) Anton P Busink, Dave Speijer, Johannes M F G Aerts and Rolf G Boot (2007), "Evolution of Mammalian Chitinase (-Like) Members of Family 18 Glycosyl Hydrolases".Genetics Society of America (107.075846) Ausa Chandumpai, Narongsak Singhpibulporn, Damrongsak Faroongsarng, Prasart Sornprasit (2004), "Preparation and physic-chemical characterization of chitin and chitosan from the pens of the squid species, Loligo lessoniana and Loligo formosana".Carbohydrate Polymers, 58(467-474) Barnhill, J.G.; Fye, C.L.; Reda, D.J.; Harris, C.L.; Clegg, D.O (2009), "Is All Glucosamine Alike? Clarifying the Controversies for Product Selection and Clinical Research".J Compl Integr Med, 6, 17 Berglund, L, J Brunstedt, K.K.Nielsen, Z.Chen J.D.Mikkelsen and K.A.Marcker, (1995), "A proline-rich chitinase from Beta vulgaris".Plant Mol Biol, 27, 211-216 Bohlman, J.A.; Schisler, D.O.; Hwang, K.O.; Hennling J.P.; Trinkle, J.R.; Anderson, T.B.; Steinke, J.D.; Vanderhoff, A (2004), "N-Acetyl-Dglucosamine and Process for Producing N-Acetyl-D-glucosamine".US Patent NO, 6693188B2 C Sandhya, Leela Krishna Adapa, K Madhavan Nampoothiri, P.Binod, George Szakacs and Ashok Pandey (2004), "Extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in submerged fermentation".FJournal of Basic Microbiology, 44(1), 49-58 Chao-Jen KUO, Li-Chun HUANG, Yi-Chun LIAO, Chen-Tien CHANG and Hsien-Yi SUNG (2009), "Biochemical characterization of a novel chitotriosidase from suspension-cultured bamboo (Bambusa oldhamii) cells".Botanical Studies, 50, 281-289 Cheba, Ben Amar (2011), "Chitin and Chitosan: Marine Biopolymers with Unique Properties and Versatile Applications".Global Journal of Biotechnology & Biochemistry 6(3), 149-153 10 Cohen-Kupiec, R.; Chet, I (1998), "The Molecular Biology of Chitin Digestion".Curr Opin Biotechnol, 9, 270–277 11 Darmanto, Y S (2003), "Effect of chitin and chitosan derived from crab shell and shrimp head on the unfrozen water and denaturation of lizard fish Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 44 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội myofibrils during frozen storage".Journal of Coastal development, 6(2), 97105 12 David B Collinge, Karsten M Kragh, Jorn D Mikkelsen, Klaus K Nielsen, Ulla Rasmussen and Knud Vad (1993), "Plant chitinases".The Plant Journal, 3(1), 31-40 13 Felse, P A., & Panda, T (2000) (2000), "Submerged culture production of chitinase by Trichoderma harzianum in stirred tank bioreactors - the influence of agitator speed".Biochemical engineering journal, 4(2), 115 120 14 Garg N, Gupta H (2010), "Isolation and purification of fungal pathogen(Macrophomina Phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius)".J Pharm Bioall Sci, 2, 38-43 15 Gooday, G.W (1990), "The Ecology of Chitin Degradation".Adv Microb Ecol, 11, 387–430 16 Gupta R, Saxena R, Chaturvedi P, Virdi J (1995), "Chitinase production by Streptomyces viridificans: Its potential in fungal cell wall lysis 1995;78:378–83".J Appl Bacteriol, 78, 378-83 17 Hitoshi Sashiwa, Shizu Fujishima, Naoko Yamano, Norioki Kawasaki, Atsuyoshi Nakayama, Einosuke Muraki, Kazumi Hiraga, Kohei Oda, Seiichi Aiba (2002), "Production of N-acetyl-D-glucosamine from α-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330"., Elsevier Science, Carbohydrate Research 761-763 18 Hitoshi Sashiwa, Shizu Fujishima, Naoko Yamano, Norioki Kawasaki, Atsuyoshi Nakayama, Einosuke Muraki, Mongkol Sukwattanasinitt, Rath Pichyangkura, Sei-ichi Aiba (2003), "Enzymeatic production of N-acetyl-Dglucosamine from chitin Degradation study of N-acetylchitooligosaccharide and the effect of mixing of crude enzymes".Elsevier Science, 391-395 19 Immaculada Aranaz, Marian Mengibar, Ruth Harris, Ines Panos, Beatriz Miralles, Niuris Acosta, Gemma Galed and Angeles Heras (2009), "Functional Characterization of Chitin and Chitosan".Current Chemical Biology, 3, 203-230 20 J H Kuk, W J Jung, G H Jo, Y C Kim, K Y Kim, R D Park (2005), "Production of N-acetyl-β-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp GJ 18 crude enzyme".Applied Microbiology and Biotechnology, 68(3), 384 389 21 Jaime Monreal, Elwyn T Reese (1969), "The chitinase of Serratia marcescens".Canadian Journal of Microbiology, 15(7), 689-696 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 45 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 22 Jeen-Kuan Chen, Chia-Rui Shen and Chao-Lin Liu (2010), "Nacetylglucosamine: Production and Applications".Marine Drugs, 8(16603397), 2493-2516 23 Jennifer L Guthrie, Sagal Khalif, Alan J Castle (2005) (2005), "An improved method for detection and quantification of chitinase activities".Canadian Fournal of Microbiology, 51(6), 491 - 495 24 Jonlanta Kumirska, Mirko X Weinhold, Jorg Thoming and Piotr Stepnowski (2011), "Biomedical Activity of Chitin/Chitosan Based Materials-Influence of Physicochemical Properties Apart from Monecular Weight and Degree of N-Acetylation".Polymers, 3(1875-1901, ISSN 2073-4360) 25 K Jami al Ahmadi, M Tabatabaei Yazdi, M.Fathi Najafi, A.R Shahverdi, M A Faramarzi, Gh Zarrini and J Behravan (2008), "Isolation and Characterization of a Chitionolytic Enzyme Prodiucing Microorganism, Paenibacillus chitinolyticus JK2 from Iran".Research Journal of Microbiology 3(6), 395-404 26 K Jamialahmadi, J Behravan, M Fathi Najafi, M Tabatabaei Yazdi, A.R Shahverdi and M.A Faramarzi (2011), "Enzymatic Production of N-acetylD-glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp PTCC1691".Biotechnology, 10(3), 292-297 27 Kasprzewska, Anna (2003), "Plant chitinase-Regulation and function" 8, 809-824 28 Kim-Chi Hoang, Tzu-Hsuan Lai, Chung-Sheng Lin, Ying-Tsong Chen and Chun-Yi Liau (2011), "The Chitinolytic Activities of Streptomyces sp TH11".International Journal of Molecular Sciences, 12(ISSN 1422-0067), 5665 29 Laura Ramirez-Coutino, Maria del Carmen Marin-Cervantes, Sergio Huerta, Sergio Revah, Keiko Shirai (2006), "Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases".Process Biochemistry, 41(5), 1106-1110 30 Lee, E.A.; Pan, C.H.; Son, J.M.; Kim, S.I (1999), "Isolation and Characterization of Basic Exochitinase from Leaf Extract of Rehmannia glutinosa".Biosci Biotechnol Biochem, 63, 1781–1783 31 Lerner, D.R and N.V.Raikhel (1992), "The gene for stinging nettle lectin (Urtica dioica agglutinin) encodes both a lectin and a chitinase".J Biol Chem, 267, 11085-11091 32 Li, Y.L.; Wu, S.T.; Yu, S.T.; Too, J.R (2005), "Screening of a Microbe to Degrade Chitin" Taiwanese J Agric Chem Food Sci, 43, 410-418 33 Louise, C.A.; Pedro, A.; Charles, A.H (1999), "Process for Producing NAcetyl-D-glucosamine".US Patent NO 5998173 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 46 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 34 Maria Cecillia Gortari, Roque Alberto Hours (2013), "Biotechnological processes for chitin recovery out of crustacean waste: A minireview".Electronic Journal of Biotechnology,(ISSN: 0717-3458) 35 Marina Duarte Pinto Lobo, Fredy Davi Albuquerque Silva, Patricia Gadelha de Castro Landim, Paloma Ribeiro da Cruz, Thais Lima de Brito, Suelen Carneiro de Medeiros, Jose Tadeu Abreu Oliveria, Ilka Maria Vasconcelos, Humberto D’Muniz Pereira and Thalles Barbosa Grangeiro (2013), "Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli".BMC Biotechnology (1472-6750/13/46) 36 May Bente Brurberg, Bjornar Synstad, Sonja Sletner Klemsdal, Daan M.F van Aalten Leif Sundheim and Vincent G.H Eijsink (2000), "Chitinases from Serratia marcescens" 37 Merina Paul Das, L Jeyanthi Rebecca, S Sharmila, Anu, Ankita Banerjee and Dhiraj Kumar (2012), "Identification and optimization of cultural conditions for chitinase production by Bacillus amyloliquefaciens SM3".Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 4(11), 4816-4821 38 Nielsen, K.K, Mikkelsen, J.D.Kragh, K.M and Bojsen, K (1993), "An acidic class III chitinase in sugar beet: Induction by Cercospora beticola, characterization, and expression in transgenic tobacco plants".Mol Plant Microbe Interact, 6, 495-506 39 Pankaj Patidar, Deepti Agrawal, Tushar Banerjee, Shridhar Patil (2005), "Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation".Process Biochemistry, 40, 2962-2967 40 Paolo Senin, Monza (Milano) (IT); Antonino Santoro; Luigi Angelo Rovati (2010), "Compositions containing N-acetylglucosamine for use in dermocosmetology and aesthetic medicine".United States; Patent Application Publication, US 20100028395A1 41 Pradip Kumar Dutta, Joydeep Dutta and V.S Tripathi (2004), "Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications".Journal of Scientific & Industrial Rếarch, 63, pp 20-31 42 Qiwang Xu, Junkang Liu, Zetao Yuan (2006), "Use of N-acetyl-Dglucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for suppressing side-effect of radiotherapy and chemotherapy".United States Patent No US 7,037,904 B2 43 Qlwang Xu, Funkang Liu, Zetao Yuan (2006), "Use of N-acetyl-Dglucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for suppressing side-effect of radiotherapy and chemotherapy".United States Patent (No US 7,037,904 B2) Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 47 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 44 Rath Pichyangkura, Sanya Kudan, Kamontip Kuttuyawong, Mongkol Sukwattanasinitt, Sei-ichi Aiba (2002), "Quantitative production of 2acetamido-2-deoxy-D-glucose from crystalline chitin by bacterial chitinase".Elsevier Science, Carbohydrate Research 337, 557-559 45 Reetarani S Patil, Vandana Ghormade, Mukund V Deshpande (2000), "Chitinolytic enzymes: an exploration".Enzyme and microbial technology, 473-483 46 Rifat Hamid, Minhaj A Khan, Mahboob Ahmad, Malik Mobeen Ahmad, Malik Zainul Abdin, Javend Musarrat and Saleem Javed (2013), "An update: Chitinase".J Pharm Bioallied Science, 5(1), 21-29 47 Rifat Hamid, Minhaj A Khan, Mahboob Ahmad, Malik Mobeen Ahmad, Malik Zainul Abdin, Javend Musarrat and Saleem Javed (2013), "An update: Chitinase".Journal of Pharmacy Bioallied Sciences, 5(1), 21-29 48 Roberts WA, Selitrennikoff CP (1998), "Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity".J Gen Microbiol, 134(169-76) 49 Saboki Ebrahim, K.Usha and Bhupinder Singh (2011), "Pathogenesis Related (PR) Proteins in Plant Defense Mechanism".Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances 50 Sakai, K (1995), " In Chitin, Chitosan Handbook".Japanese Society of Chitin and Chitosan, Ed.; Gihodo, Tokyo, , pp 209–218 51 Sanjeev Kumar, Rohit Sharma, Rupinder Tewari (2011), "Production of NAcetylglucosamine Using Recombinant Chitinolytic Enzymes".Indian J Microbiol 319-325 52 Sashiwa, H.; Fujishima, S.; Yamano, N.; Kawasaki, N.; Nakayama, A.; Muraki, E.; Aiba, S (2001), "Production of N-Acetyl-D-glucosamine from β-Chitin by Enzymatic Hydrolysis".Chem Lett, 31, 308–309 53 Shishi H, Neuhaus J.M, Ryals J and Meins F Jr (1990), "Structure of a tobacco chitinase gene: evidence that different chitinase genes can arise by transposition of sequences encoding a cysteine-rich domein".Plant Mol Biol, 14, 357-368 54 Speck, Ulrich Prof Dr (1989), "N-acetylglucosamine for buccal application" DE3927723 A1 55 T., Neuhaus J.M Sticher L Meins F.Jr and Boller (1991), "A short Cterminal sequence is necessary and sufficient for the targeting of chitinases to the plant vacuole".Proc Natl Acad Sci U.S.A, 88, 1062-1066 56 Takeshi Watanabe, Ryo Kanai, Tomokaru Kawase, Toshiaki Tanabe, Masaru Mitsutomi, Shohei Sakuda and Kiyotaka Miyashita (1999), "Family 19 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 48 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội chitinases of Streptomyces species: distribution".Microbiology 145, 3353-3363 characterization and 57 Tomokaru Kawase, Akihiro Saito, Toshiya Sato, Ryo Kanai, Takeshi Fujii, Naoki Nikaido, Kiyotaka Miyashita and Takeshi Watanabe (2004), "Distribution and Phylogenetic Analysis of Family 19 Chitinase in Actinobacteria".Applied and Environmental Microbiology, 70(2), 1135 58 Tsuyoshi Ohno, Sylvie Armand, Toshinao Hata, Naoki Nikaidou, Bernard Henrissat, Masaru Mitsutomi and Takeshi Watanabe (1996), "A Modular Family 19 Chitinase Found in the Prokaryotic Organism Streptomyces griseus HUT 6037".Journal of Bacteriology, 5065-5070 59 V Shanmugaiah, N Mathivanan, N Balasubramanian and P T Manoharan (2008), "Optimization of cultural conditions for production of chitinase by Bacillus laterosporous MML2270 isolated from rice rhizosphere soil".African Journal of Biotechnology, 7(15), 2562-2568 60 Xu, Qiwang, Liu Junkang, Yuan Zetao (2002), "The use of N-acetyl-Dglucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for preventing and treating sexual disorder".EUROPEAN PATENT APPLICATION, 371 61 Yamabhai, Feisal Khoushab and Montarop (2010), "Chitin Research Revisited".Marine rugs ISSN 1660-3397 62 Yoon Gyo Lee, Ki-Chul Chung, Seung Gon Wi, Jae Chang Lee, Hyeun-Fong Bea (2009), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704".Protein Expression and purification, 65, 244-250 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 49 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội PHỤ LỤC Xây dựng đƣờng chuẩn N-acetyl-D-glucosaminetheo phƣơng pháp DNS Thí nghiệm tiến hành với nồng độ đường khác thể tích phản ứng với DNS, so màu bước sóng 540nm Kết thể qua bảng PL1 B 11Bảng PL1 Kết xây dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine Nồng độ đƣờng STT (mg/ml) Giá trị OD 540 nm 0,033 0,1 0,136 0,2 0,233 0,3 0,376 0,5 0,564 0,6 0,783 0,7 0,864 0,8 1,044 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 50 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 1.2 y = 1.2527x + 0.0031 R² = 0.9913 OD 540nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ NAG (mg/ml) H 19Hình PL1 Phương trình đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin enzyme chitinase thô thu Nacetyl-D-glucosamine B 12Bảng PL2 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin Nhiệt độ (oC) Hàm lƣợng GlcNAc tƣơng đối (%) 30 31,25% 33 33,59% 37 77,34% 40 100% 43 82,03% Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 51 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội B 13Bảng PL3 Ảnh hưởng điều kiện pH đến hiệu suất thủy phân chitin pH Hàm lƣợng GlcNAc tƣơng đối (%) 3,5 68,24% 77,50% 4,5 92,37% 100% 5,5 52,35% 19,82% B 14Bảng PL4 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân chitin E S Unit S (g) E/S 0,092 0,01875 4,906667 0,069 0,01875 3,68 0,046 0,01875 2,45 1 0,023 0,01875 1,226 0,023 0,0375 0,613 0,023 0,05625 0,408 0,023 0,075 0,306 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 52 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội B 15Bảng PL5 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thủy phân chitin Thời gian (h) Nồng độ NAG (mg/ml) Hiệu suất thu hồi NAG (%) 0.173077 2.769230769 0.349299 5.588776004 0.637397 10.1983551 0.7985 12.77600387 0.997823 15.96516691 24 1.552733 24.84373488 28 1.748911 27.98258345 32 1.848331 29.57329463 48 1.976294 31.62070634 52 2.075955 33.21528786 56 1.890663 30.25060474 72 5.101355 81.62167392 76 5.063377 81.01403 80 4.828012 77.24818578 96 4.801645 76.82631834 100 4.758587 76.13739719 104 4.707063 75.31301403 120 4.753266 76.05224964 124 4.692066 75.07305273 128 4.578616 73.25786164 144 4.571118 73.13788099 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 53 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nghiên cứu điều kiện cô đặc dịch enzyme chitinase B 16Bảng PL6 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân chitin Thời gian thủy phân Dịch enzyme ban đầu 27,26 26,98 26,81 Dịch enzyme cô đặc lần 60,01 57,25 53,44 (ngày) Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện bảo quản đến hoạt tính chitinase khả thủy phân chế phẩm chitinase B 17Bảng PL7 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ chất bảo quản đến hoạt tính enzyme chitinase Thời gian (ngày) 12 15 18 27 30 33 36 39 42 45 48 51 Hoạt tính enzym chitinase điều kiện bảo quản khác Nhiệt độ phòng 0.0324 0.0294 0.0288 0.0249 0.0256 0.0251 0.0232 0.0138 0.0118 0.0091 0.0100 0.0124 0.0120 0.0114 0.0102 0.0100 4oC -20oC Glycerol Glycerol + NaCl 0.0324 0.0334 0.0302 0.0352 0.0252 0.0340 0.0330 0.0326 0.0323 0.0328 0.0330 0.0319 0.0244 0.0250 0.0308 0.0295 0.0324 0.0304 0.0284 0.0398 0.0274 0.0379 0.0342 0.0263 0.0240 0.0358 0.0221 0.0339 0.0346 0.0262 0.0311 0.0312 0.0340 0.0238 0.0194 0.0190 0.0191 0.0204 0.0259 0.0216 0.0209 0.0303 0.0213 0.0154 0.0154 0.0254 0.0151 0.0219 0.0316 0.0265 0.0132 0.0211 0.0181 0.0242 0.0259 0.0146 0.0140 0.0253 0.0151 0.0134 0.0131 0.0224 0.0145 0.0138 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Glycerol + Mannitol 0.0349 0.0311 0.0356 0.0304 0.0235 0.0385 0.0298 0.0278 0.0303 0.0290 0.0189 0.0183 0.0153 0.0197 0.0265 0.0304 NaCl 0.0336 0.0404 0.0394 0.0405 0.0308 0.0318 0.0342 0.0267 0.0272 0.0281 0.0265 0.0314 0.0268 0.0273 0.0299 0.0302 Trang 54 Luận văn tốt nghiệp 54 57 86 174 217 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 0.0094 0.0270 0.0265 0.0090 0.0269 0.0264 0.0067 0.0131 0.0178 0.0000 0.0385 0.0025 0.0000 0.0101 0.0000 0.0173 0.0198 0.0148 0.0129 0.0120 0.0097 0.0170 0.0193 0.0082 0.0271 0.0323 0.0225 0.0210 0.0199 0.0183 0.0365 0.0087 0.0069 0.0093 0.0154 B 18Bảng PL8 Ảnh hưởng nhiệt độ chất bảo quản đến hàm lượng GlcNAc lại Thời gian (ngày) 18 27 36 45 54 217 Hàm lƣợng GlcNAc lại Nhiệt độ phòng 2.1114 0.0179 0.0119 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 4oC -20oC 2.1114 2.1114 2.0816 2.4062 2.4188 2.4268 2.2791 2.1362 2.1114 2.0935 2.0697 2.4062 2.4188 2.4268 2.2791 0.0000 Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Glycerol Glycerol + NaCl 2.1858 2.1858 1.7749 2.4926 2.4387 2.1394 1.7921 1.9829 2.0459 2.0459 1.8612 2.6683 2.3347 2.2669 1.9796 1.9527 Glycerol + Mannitol 2.0968 2.0968 2.0935 2.7040 2.6144 2.4627 2.1354 2.0200 NaCl 2.0518 2.0518 2.0549 2.4181 2.7696 2.5265 2.4986 2.1889 Trang 55 ... KỸ THU? ??T HƢỚNG D? ? ?N KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà N? ??i – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi Đồng Thị Hương Trầm xin cam đoan n? ??i dung lu? ?n v? ?n với đề tài ? ?Nghi? ?n cứu thu nh? ?n N- Acetyl- D- Glucosamine ứng d? ??ng... Xây d? ??ng đƣờng chu? ?n N -acetyl- D- glucosaminetheo phƣơng pháp DNS50 Nghi? ?n cứu điều ki? ?n thủy ph? ?n chitin enzyme chitinase thô thu Nacetyl -D- glucosamine 51 Nghi? ?n cứu điều ki? ?n cô đặc d? ??ch... chitinase từ Penicillium oxalicum 20B, ti? ?n hành đề tài: ? ?Nghi? ?n cứu thu nh? ?n N- Acetyl- D- Glucosamine ứng d? ??ng chitinase? ?? N? ??i dung nghi? ?n cứu đề tài: Khảo sát ảnh hưởng điều ki? ?n nhiệt độ, pH,