Nghiên cứu thử nghiệm mẫu máu giả định ứng dụng trong ngoại kiểm vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ THU DIỂM NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM MẪU MÁU GIẢ ĐỊNH ỨNG DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM VI SINH Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS HÀ MẠNH TUẤN TS.BS HOÀNG TIẾN MỸ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Nguyễn Thị Thu Diểm MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CÂU HỎI NGHIÊN CỨU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhiễm khuẩn máu 1.1.1 Khái quát nhiễm khuẩn máu 1.1.2 Tác nhân gây nhiễm khuẩn máu 1.1.3 Tác nhân Escherichia coli 1.1.4 Tác nhân Staphylococcus aureus 1.2 Xét nghiệm cấy máu phòng xét nghiệm 1.2.1 Quy trình cấy máu phương pháp thơng thường 1.2.2 Quy trình cấy máu máy tự động 10 1.3 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 12 1.3.1 Định nghĩa ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 12 1.3.2 Các phương thức ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 13 1.3.3 Nguyên tắc thực ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 15 1.3.4 Tầm quan trọng ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 16 1.3.5 Mẫu ngoại kiểm sử dụng chương trình ngoại kiểm tra chất lượn xét nghiệm 17 1.4 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh 18 1.4.1 Tình hình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh giới…………………………………………………………………….19 1.4.2 Tình hình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh Việt Nam………………………………………………………………… 19 1.4.3 Mẫu ngoại kiểm vi sinh 20 1.4.4 Yêu cầu kỹ thuật, thành phần mẫu kiểm vi sinh 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Thiết kế nghiên cứu 25 2.2 Đối tượng nghiên cứu 25 2.3 Cỡ mẫu 25 2.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.5 Quá trình nghiên cứu 26 2.6 Phương pháp nghiên cứu 27 2.6.1 Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate 27 2.6.2 Sản xuất thử nghiệm mẫu bệnh phẩm máu giả định quy mơ phịng thí nghiệm 29 2.7 Vật liệu sở vật chất sử dụng nghiên cứu 35 2.8 Kỹ thuật vi sinh nghiên cứu 39 2.8.1 Định danh vi khuẩn 39 2.8.2 Xác định nồng độ vi khuẩn mẫu bệnh phẩm-phương pháp đếm sống 40 2.9 Kiểm soát sai lệch 41 2.9.1 Kiểm soát sai lệch lựa chọn 41 2.9.2 Kiểm sốt sai lệch thơng tin 42 2.10 Y đức nghiên cứu.……………………………………………….42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 43 3.1 Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate 43 3.1.1 Kết thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate mơi trường nutrient broth, máu cừu 10% 43 3.1.2 Xác định nồng độ Acid boric-Natri formate phù hợp mục đích nghiên cứu sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định 49 3.2 Kết sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa S aureus 56 3.2.1 Kết đánh giá tính đồng mẫu S aureus 61 3.2.2 Kết đánh giá độ ổn định mẫu S aureus 63 3.3 Kết sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa E coli 66 3.3.1 Kết đánh giá độ đồng mẫu E coli 72 3.3.2 Kết đánh giá độ ổn định mẫu E coli 73 3.4 Kết quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân đích S aureus E coli 76 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 78 4.1 Thử nghiệm Acid boric-Natri formate 78 4.2.1 Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate E coli, S aureus môi trường máu giả định 78 4.2.2 Xác định nồng độ Acid boric-Natri formate phù hợp mục đích sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân E coli S aureus……………………………………………………………………… 81 4.2 Sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân đích S aureus E coli quy mơ phịng thí nghiệm 82 4.2.1 Đặc tính mẫu máu 82 4.2.2 Đánh giá chất lượng hai mẫu máu giả định 84 4.3 Quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân đích S aureus E coli 87 KẾT LUẬN 90 KIẾN NGHỊ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO i PHỤ LỤC ix PHỤ LỤC x PHỤ LỤC xii PHỤ LỤC xiii PHỤ LỤC xiv PHỤ LỤC xvi PHỤ LỤC xxi PHỤ LUC xxvi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ Tiếng Việt Từ viết tắt AB Từ Tiếng Anh Acid Boric Chủng vi khuẩn tiêu chuẩn Americal Type Hoa Kỳ Culture Collection BA Thạch máu Blood agar CFU Đơn vị khúm khuẩn Colony forming unit CLXN Chất lượng xét nghiệm EQAs Chương trình ngoại kiểm tra External Quality chất lượng Assessment schemes ATCC GĐ Giai đoạn IQC Nội kiểm tra chất lượng Internal Quality Control ISO Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế International Standard Organization MC Môi trường MacConkey MacConkey Agar NF Natri formate Sodium formate PXN Phòng xét nghiệm TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam XN Xét nghiệm WHO Tổ chức Y tế Thế giới World Health Organization DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng nồng độ AB NF tỉ lệ 2:1 sử dụng thử nghiệm 28 Bảng 2 Hóa chất sinh phẩm 36 Bảng Thiết bị sở vật chất 37 Bảng Tốc độ sinh trưởng E coli biểu thị Log10CFU/mL nhóm ống (S)…………………………… ………………………………… 43 Bảng Tốc độ tăng trưởng E coli biểu thị Log10CFU/mL nhóm ống (C)…………………………………………………………… …44 Bảng 3 Tốc độ tăng trưởng S aureus biểu thị Log10CFU/mL nhóm ống (S) 46 Bảng Tốc độ tăng trưởng S aureus biểu thị Log10CFU/mL nhóm ống (C) 47 Bảng Kết tốc độ sinh trưởng E coli nồng độ AB-NF 51 Bảng Kết tốc độ sinh trưởng S aureus nồng độ AB-NF…….54 Bảng Kết kiểm tra vi khuẩn S aureus 56 Bảng Kết kiểm tra chất sử dụng mẫu S aureus 57 Bảng Kết kiểm tra chế phẩm máu cừu mẫu S aureus 58 Bảng 10 Kết đánh giá tính đồng mẫu S aureus 62 Bảng 11 Kết theo dõi nhiệt độ thùng mẫu S aureus 63 Bảng 12 Kết phân tích độ ổn định mẫu S aureus 65 Bảng 13 Kết kiểm tra vi khuẩn E coli 67 Bảng 3.14 Kết kiểm tra chất lượng chất mẫu E coli 68 Bảng 3.15 Kết kiểm tra chế phẩm máu cừu mẫu E.coli……… .69 Bảng 16 Kết phân tích tính đồng mẫu E coli 73 Bảng 17 Kết theo dõi nhiệt độ thùng mẫu E coli 74 Bảng 3.18 Kết phân tích độ ổn định mẫu E coli 75 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Vi khuẩn hàng đầu xác định từ ni cấy máu dương tính năm Biểu đồ hình trịn biểu thị phân bố nhóm Hình Vi khuẩn Escherichia coli Hình Hình ảnh đặc tính vi khuẩn S aureus Hình Sơ đồ qui trình thực kiểm tra chất lượng 14 Hình Sinh phẩm dụng cụ 36 Hình 2 Thiết bị sở vật chất 38 Hình Phương pháp đếm sống vi sinh vật mẫu 41 Hình Hai nhóm mơi trường (C) (S) có chứa tác nhân E coli 43 Hình Hai nhóm mơi trường (C) (S) có chứa tác nhân S aureus 46 Hình 3 Nhóm ống chứa tác nhân E coli nồng độ AB-NF 49 Hình Nhóm ống chứa tác nhân S aureus nồng độ AB-NF 53 Hình Hỗn hợp máu giả định chứa tác nhân S aureus sau phối trộn 59 Hình Bộ mẫu S aureus sau phân phối vào ống đóng gói 60 Hình Bảo quản mẫu điều kiện giả định vận chuyển 61 Hình Nhiệt kế ghi nhận nhiệt độ thùng mẫu S aureus 64 Hình Hỗn hợp máu giả định chứa tác nhân E coli sau phối trộn 70 Hình 10 Bộ mẫu E coli sau phân phối vào ống, đóng gói 71 Hình 11 Bảo quản mẫu E coli điều kiện vận chuyển giả định 72 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Lưu đồ Quá trình nghiên cứu 26 Sơ đồ 2 Quá trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định 29 Sơ đồ Quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định……………….77 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Nghiên cứu in vitro khác biệt tăng trưởng E coli 45 Biểu đồ Nghiên cứu in vitro khác biệt tăng trưởng S aureus hai nhóm ống (C) (S) biểu thị Log10CFU/mL 48 Biểu đồ 3 Tốc độ sinh trưởng E coli nồng độ AB-NF 52 Biểu đồ Tốc độ sinh trưởng S aureus mồi nồng độ AB-NF 55 Biểu đồ Theo dõi độ ổn định mẫu S aureus qua biểu đồ 66 Biểu đồ Kết theo dõi tính ổn định mẫu E coli qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 76 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xii PHỤ LỤC Mật độ vi khuẩn S.aureus mẫu máu giả định để đánh giá độ đồng mẫu Ống mẫu 10 Kết định danh S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus Lần ( CFU/mL) 22 x103 11 x103 23 x103 19 x103 13 x103 13 x103 24 x103 14 x103 21 x103 30 x103 Log 4,34 4,04 4,36 4,28 4,11 4,11 4,38 4,15 4,32 4,47 Lần (CFU/mL) 21 x103 20 x103 11 x103 16 x103 20 x103 19 x103 24 x103 21 x103 14 x103 23 x103 Log 4,32 4,30 4,04 4,20 4,30 4,28 4,38 4,32 4,15 4,36 Mật độ vi khuẩn E coli mẫu máu giả định để đánh giá độ đồng mẫu Ống mẫu 10 Kết định danh E coli E coli E coli E coli E coli E coli E coli E coli E coli E coli Lần CFU/mL 17 x 103 21 x 103 35 x 103 32 x 103 19 x 103 15 x 103 30 x 103 17 x 103 14 x 103 35 x 103 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Log 4,23 4,32 4,54 4,51 4,28 4,18 4,50 4,23 4,15 4,54 Lần CFU/mL 18 x 103 23 x 103 33 x 103 30 x 103 17 x 103 10 x 103 39 x 103 18 x 103 80 x 103 33 x 103 Log 4,26 4,36 4,51 4,48 4,23 4,00 4,60 4,25 4,90 4,52 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xiii PHỤ LỤC PHÂN TÍCH ĐỘ ĐỒNG NHẤT CỦA CÁC BỘ MẪU NGOẠI KIỂM Bộ mẫu S aureus Bộ mẫu E coli Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xiv PHỤ LỤC Nồng độ độ vi khuẩn S aureus mẫu máu giả định thời điểm đánh giá Thời điểm kiểm tra T1 T3 T5 T7 T9 T11 T13 T15 T17 T19 T21 T23 Ống mẫu Lần CFU/mL 3 3 3 3 3 3 15 x103 14 x 103 18 x 103 16 x 103 15 x 103 18 x 103 14 x 103 15 x 103 17 x 103 13 x 103 14 x 103 19 x 103 12 x 103 15 x 103 18 x 103 11 x 103 17 x 103 19 x 103 12 x 103 20 x 103 19 x 103 14 x 103 17 x 103 18 x 103 13 x 103 15 x 103 16 x 103 13 x 103 14 x 103 14 x 103 12 x 103 13 x 103 11 x 103 11 x 103 12 x 103 90 x 102 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Log10 CFU/mL 4,18 4,15 4,25 4,20 4,18 4,25 4,15 4,18 4,23 4,11 4,15 4,28 4,08 4,18 4,25 4,04 4,23 4,28 4,08 4,30 4,28 4,15 4,23 4,25 4,11 4,18 4,20 4,11 4,15 4,15 4,08 4,11 4,04 4,04 4,08 3,95 Lần CFU/mL 13 x 103 12 x 103 19 x 103 13 x 103 13 x 103 17 x 103 15 x 103 17 x 103 19 x 103 12 x 103 14 x 103 22 x 103 14 x 103 18 x 103 19 x 103 10 x 103 18 x 103 21 x 103 13 x 103 19 x 103 17 x 103 16 x 103 19 x 103 16 x 103 17 x 103 14 x 103 18 x 103 18 x 103 17 x 103 13 x 103 14 x 103 15 x 103 12 x 103 13 x 103 14 x 103 14 x 103 Log10 CFU/mL 4,11 4,08 4,28 4,11 4,11 4,23 4,18 4,23 4,28 4,08 4,15 4,34 4,15 4,25 4,28 4,00 4,25 4,32 4,11 4,28 4,23 4,20 4,28 4,20 4,23 4,15 4,25 4,25 4,23 4,11 4,15 4,18 4,08 4,11 4,15 4,15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xv 2.Nồng độ vi khuẩn E coli mẫu máu giả định thời điểm đánh giá Thời điểm Ống mẫu kiểm tra Lần CFU/mL Lần Log10 CFU/mL CFU/mL Log10 CFU/mL T1 34 x 103 35 x 103 31 x 103 36 x 103 32 x 103 4,51 33 x 36 x 103 4,56 32 x 103 4,51 22 x 103 4,34 24 x 103 4,38 30 x 103 4,48 28 x 103 4,45 34 x 103 36 x 103 4,56 24 x 103 28 x 103 4,45 33 x 103 29 x 103 4,46 35 x 103 34 x 103 4,53 23 x 103 4,36 30 x 103 4,47 34 x 103 4,53 35 x 103 4,54 40 x 103 4,60 39 x 103 4,59 25 x 103 4,40 28 x 103 4,45 36 x 103 4,56 34 x 103 4,53 39 x 103 40 x 103 4,60 26 x 103 28 x 103 4,45 37 x 103 33 x 103 4,52 38 x 103 36 x 103 4,55 28 x 103 4,45 26 x 103 4,41 32 x 103 4,51 37 x 103 4,57 34 x 103 4,53 34 x 103 4,53 23 x 103 4,36 20 x 103 4,30 24 x 103 28 x 103 4,45 4,43 17 x 103 4,23 19 x 103 4,28 103 4,11 T3 T5 T7 T9 T11 T13 T15 T17 T19 T23 4,54 4,49 4,55 4,53 4,38 4,52 4,54 4,59 4,41 4,57 4,58 4,38 4,36 30 x 4,47 36 x 103 4,56 33 x 103 4,52 34 x 103 4,53 103 4,52 27 x 10 20 x 103 18 x 103 17 x 103 4,23 13 x 16 x 103 4,20 18 x 103 4,25 12 x 103 4,01 12 x 103 4,01 15 x 103 4,18 11 x 103 4,04 14 x 103 12 x 103 4,08 10 x 103 80 x 102 3,90 13 x 103 90 x 102 3,95 T21 23 x 10 4,53 103 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 4,30 4,26 4,13 4,00 4,11 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xvi PHỤ LỤC PHÂN TÍCH ĐỘ ỔN ĐỊNH BỘ MẪU S AUREUS Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xvii Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xviii Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 11 ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 13 ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 15 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xix Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 17 ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 19 ngày Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 21 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xx Phân tích độ ổn định mẫu S aureus thời điểm 23 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxi PHỤ LỤC PHÂN TÍCH ĐỘ ỔN ĐỊNH BỘ MẪU E COLI Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxii Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxiii Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 11 ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 13 ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 15 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxiv Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 17 ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 19 ngày Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 21 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxv Phân tích độ ổn định mẫu E coli thời điểm 23 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxvi PHỤ LUC PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ P(value) GIỮA HAI NHĨM ỐNG (C), (S) Giữa nhóm chứa tác nhân E coli Giữa nhóm chứa tác nhân S aureus Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... 1.4.3 Mẫu ngoại kiểm Vi sinh Mẫu ngoại kiểm Vi sinh loại mẫu sử dụng chương trình ngoại kiểm (EQAs) Vi sinh lâm sàng mà phòng xét nghiệm nhận tham gia Những tác nhân đích sử dụng mẫu ngoại kiểm Vi. .. khơ Mẫu giả định có đặc tính tương tự mẫu thật nên diễn tập tình thực tế Tại Vi? ??t Nam, có cơng bố dạng mẫu bệnh phẩm giả định sử dụng ngoại kiểm Vi sinh Tuy nhiên, nghiên cứu dạng mẫu giả định. .. chất lượng mẫu máu giả định sản xuất thử nghiệm dựa vào tiêu chí đánh giá tính đồng độ ổn định Xây dựng quy trình sản xuất mẫu máu giả định sử dụng ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm vi sinh CHƯƠNG