Thành phần Hàm lƣợng (g/l) Chitin (khô) 4 Cao nấm men 10 K2HPO4 4 KH2PO4 2 MgSO4.7H2O 1,4 NaCl 1 KCl 1 CaCl2 0,1
Chitin khô được chuyển thành dạng chitin huyền phù theo phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù trước khi pha vào môi trường.
2.5. Phƣơng pháp
2.5.1. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1.1. Phƣơng pháp chuẩn bị chitin huyền phù
Chitin huyền phù được chuẩn bị theo phương pháp của Roberts và Selitrenniko (1998) với một số thay đổi [48]: sử dụng 1g α-chitin khô thu từ vỏ tôm bổ sung vào 20ml HCl 37% lạnh, khuấy đều tại 40C trong 18 giờ. Hỗn hợp sau đó được bổ sung 100ml cồn lạnh 96% và tiếp tục khuấy tại 40C trong 24 giờ tiếp theo. Tiếp theo, ly tâm hỗn hợp ở 40C trong 8000vòng/phút trong 20 phút và rửa bằng nước cất đến khi đạt pH 5 sẽ thu được chitin huyền phù. Bảo quản chitin huyền phù ở 40C. Kết quả 1g chitin khơ có thể thu được khoảng 19g chitin huyền phù [48].
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 20
2.5.1.2. Phƣơng pháp ni cấy chìm
Chủng nấm mốc Penicillium oxalicum 20B được cấy từ ống thạch nghiêng sang môi trường Czapeck với tỉ lệ bào tử 103
bào tử/ml và hoạt hóa trong 36 giờ. Sau đó cấy chuyển sang môi trường lên men MS – Chitin với mật độ giống 7%. Quá trình lên men được tiến hành trong thời gian 5 ngày, tại pH 5, lắc ở 200rpm, nhiệt độ lên men 300C.
Dịch lên men có chứa enzyme chitinase được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối. Sau đó, lấy dịch qua lọc để thực hiện nghiên cứu các bước tiếp theo.
2.5.1.3. Khảo sát các điều kiện thủy phân thích hợp thu sản phẩm N-acetyl-D-glucosamine
Chủng giống Penicillium oxalicum 20B được nuôi cấy như mô tả ở 2.5.1.2.
Chitin huyền phù 20% pha trong đệm acetat được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng thủy phân bởi enzyme chitinase.
Các điều kiện thủy phân được khảo sát gồm có điều kiện nhiệt độ thủy phân, giá trị pH ban đầu, tỷ lệ enzyme:cơ chất và thời gian thủy phân được thể hiện qua bảng 2.4. Các mẫu phản ứng được bổ sung sodium azide nồng độ 0,02%.