PHẦN 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin của chitinase từ Penicillium
3.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng để đảm bảo quá trình thủy phân hiệu quả, đồng thời việc khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ giúp cho quá trình nghiên cứu cũng như sản xuất chế phẩm sau này có nhiều thuận lợi. Đề tài đã thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính thủy phân chitin huyền phù của chitinase từ
Penicilium oxalicum 20B. Các điều kiện nhiệt độ khảo sát là 30, 33, 37, 40 và 430C với pH 5 và nồng độ chitin huyền phù là 2% (w/v), thời gian thủy phân là 6 ngày,có bổ sung 0,02% sodium azide nhằm ức chế các vi khuẩn lạ phát triển làm ảnh hưởng đến hàm lượng sản phẩm tạo thành. Do sản phẩm của quá trình thủy phân chitin huyền phù bằng chitinase thô thu từ Penicillium oxalicum 20B chủ yếu là GlcNAc nên coi lượng đường khử trong dịch thủy phân tương đương với lượng GlcNAc. Kết quả thu được được trình bày qua hình 3.7.
H 13Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độđến khả năng thủy phân chitin huyền phù của chitinase thô thu từ canh trường lên men Penicilium oxalicum 20B
Kết quả cho thấy khi nhiệt độ tăng dần từ 30 đến 400C, lượng sản phẩm GlcNAc cũng tăng lên. Ở các nhiệt độ 430C hay 370C, lượng GlcNAc tạo thành chỉ giảm khoảng 20%. Trong khi đó, ở nhiệt độ 30 và 330C lượng sản phẩm GlcNAc
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 35
giảm tới 70%. Kết quả thu được cho thấy: chitinase thu từ Penicilium oxalicum 20B có nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất là 400C. Kết quả này phù hợp với các kết quả đã công bố trước đây là nhiệt độ tối ưu của chitinase nằm trong khoảng từ 20-500
C. Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự năm (2009), nhiệt độ tối ưu thủy phân chitin của chitinase từ Penicilium sp LYG 0704 là 400C [52]. Trong khi đó chitinase từ dịch tự phân của Penicilium oxalicum ATCC 64198 hoạt động tối ưu ở 350C [53].
3.2.2. Ảnh hưởng của pH môi trường
Penicilium oxalicum là lồi nấm mốc có khả năng sinh trưởng và phát triểntrong một dải pH rộng. Tương tự như nhiệt độ, giá trị pH ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ tối ưu của enzyme cũng như độ bền của enzyme. Để xác định khoảng pH thích hợp cho chitinase của Penicilium oxalicum 20B, đề tài đã tiến hành phản ứng thủy phân chitin huyền phù 2% (w/v) tại các giá trị pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 và 6,0 với cùng điều kiện nhiệt độ 400C, thời gian 6 ngày. Kết quả được thể hiện trên hình 3.8.
H 14Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân chitin huyền phù của chitinase thô thu từ canh trường lên men Penicilium oxalicum 20B
Nhìn vào hình trên ta thấy pH ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả của quá trình thủy phân, pH thích hợp cho chitinase thơ của chủng 20B là pH axit và hoạt tính
0 20 40 60 80 100 3.5 4 4.5 5 5.5 6 Hàm lƣợ ng GlcNAc tƣơ ng đối (% ) pH thủy phân
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 36
thủy phân cao hơn trong khoảng 4,5 đến 5. Hàm lượng GlcNAc đạt cao nhất tại pH 5. Càng gần pH trung tính khả năng thủy phân chitin huyền phù của enzyme càng giảm, tại pH 6 hàm lượng GlcNAc thu được giảm xuống chỉ còn hơn 20% so với pH 5. Kết quả này phù hợp với các kết quả đã nghiên cứu trước đây là khoảng pH tối ưu của chitinase nằm trong khoảng 4-9. Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự, khoảng pH tối ưu cho chitinase từ Penicillium sp LYG 0704 là pH 5. Rodriquez và cộng sự cũng cho thấy pH tối ưu của chitinase thu từ Penicillium oxalicum là pH 5.
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Trong quá trình thủy phân, lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp giúp chúng ta thu hồi tối đa lượng sản phẩm tạo thành cũng như giảm chi phí cho quá trình sản xuất. Thời gian thủy phân chitin huyền phù bởi chitinase thô thu từ
Penicilium oxalicum 20B được thực hiện tại pH 5, nhiệt độ 400C, cơ chất chitin keo 20% (w/v), với lượng enzyme tương ứng 1,8U/g cơ chất.
H 15Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân GlcNAc
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 37
Kết quả cho thấy hàm lượng GlcNAc được tạo thành ngay sau 1 giờ thủy phân đạt hàm lượng 0,17mg/ml và cao nhất đạt 5,10mg/ml sau 72 giờ. Hàm lượng GlcNAc tạo thành trong dịch thủy phân không tăng sau các giờ tiếp theo.
Như vậy, ta có thể kết luận rằng thời gian thủy phân cho hiệu suất GlcNAc đạt cao nhất là 72 giờ.
H 16Hình 3.10. Hình ảnh TLC sản phẩm thủy phân chitinhuyền phù 20% bởi chitinase thô thu từ canh trường lên men Penicilium oxalicum 20B
1:(GlcNAc)1-4; 2,3, 4: Sản phẩm thủy phân lần lượt (GlcNAc)2, (GlcNAc)3, (GlcNAc)4bằngchitinase thô; 5; 6, 7, 8, 9, 10: Sản phẩm thủy phân chitin huyền phùbới chitinase thô sau 1, 2, 24, 4, 6 và 8 giờ; 11: chitinase thô (đối chứng);12:
chitin huyền phù
Nhìn vào hình ảnh sắc ký, ta có thể thấy sản phẩm tạo thành sau quá trình thủy phân chitin huyền phù của chitinase thô thu từ Penicillium oxalicum 20B sau 1 giờ đến 24 giờ thủy phân đều tạo thành GlcNAc đơn phân. Khi cho chitinase này thủy phân với cơ chất là di-, tri- và tetra-GlcNAc tinh khiết thì cũng tạo thành một sản phẩm duy nhất là GlcNAc đơn phân. Điều đó có nghĩa là là hệ chitinase thu từ
Penicillium oxalicum 20B có chứa N-axetyl-D-hexosamindase, thủy phân các
oligomer từ đầu không khử thành các monomer tương ứng. Do sản phẩm của quá trình thủy phân chỉ chứa duy nhất GlcNAc nên sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thu hồi và tinh sạch sản phẩm cũng như nâng cao hiệu quả của quá trình sản xuất.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 38