2.5.2. Phương pháp phân tích
2.5.2.1. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Braford
Nguyên tắc
Trong môi trường acid Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanhhấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Dựa vào đường chuẩn của protein tính ra hàm lượng protein trong mẫu.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 23
Cách tiến hành
Thí nghiệm được tiến hành với enzyme chitinase thô ở các nồng độ cô đặc khác nhau. Lấy 1ml mẫu cần đo cho vào ống falcol, thêm 2ml thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, lắc đều lên, để phản ứng màu xảy ra trong bóng tối, sau 20 phút, đem đo OD ở bước sóng 595nm, dựa vào kết quả đo được và phương trình đường chuẩn, ta tính được nồng độ protein có trong mẫu.
2.5.2.2. Xác định hoạt độ enzyme chitinase
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme chitinase xúc tác thủy phân
cơ chất, giải phóng N-acetyl-D-glucosamine tương ứng với 1µmol GlcNAc tạo thành trong 1 phút ở 400C.
Hoạt độ enzyme chitinase được xác định dựa trên lượng đường khử tạo thành qua phản ứng thủy phân cơ chất chitin huyền phù.
Cách tiến hành
Enzyme chitinase thô thu được từ canh trường lên men Penicillium oxalicum 20B được ủ với chitin huyền phù 1% trong đệm acetat pH 5
theo tỷ lệ 1:1 ở 400C trong 45 phút.
Dịch thu được sau thủy phân đem ly tâm ở 6000vòng/phút trong 10 phút để loại cơ chất còn dư.
Hàm lượng GlcNAc tạo thành được xác định dựa vào phản ứng đường khử với DNS ở 1000C trong 5 phút và so màu ở bước sóng 540nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định hàm lượng GlcNActhu được sau quá trình thủy phân.
Hoạt tính thủy phân của enzyme chitinase được xác định theo công thức U (U/ml) =( )
Trong đó:
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 24
M: Khối lượng phân tử của GlcNAc (M = 221,21) t: Thời gian thủy phân (45 phút)
V1: Thể tích dung dịch phản ứng V2: Thể tích enzyme
2.5.2.3. Xác định hiệu suất thủy phân N-acetyl-D-glucosamine
Hiệu suất thủy phân chitin thành N-acetyl-D-glucosamine được xác định dựa trên lượng đường khử tạo thành bởi chitinase ở bước sóng 540nm sau khi cho phản ứng với acid dinitrosalicylic (DNS).
Thí nghiệm được tiến hành với dịch enzyme chitinase thơ thu được từ canh trường lên men Penicillium oxalicum 20B. Tiến hành thủy phân chitin huyền phù
20% bằng chitinase thô thu được theo tỉ lệ 1:1. Các mẫu phản ứng được bổ sung 1 giọt sodium azide nồng độ 0,02% để kháng khuẩn. Tiếp theo, tất cả các mẫu được đem thủy phân ở 400C trong 72 giờ. Sau đó đem dịch thủy phân ra ly tâm, loại cặn và những cơ chất còn dư sau phản ứng và đem xác định lượng đường khử bằng phương pháp DNS. Các mẫu được xác định lặp lại 2 lần. Hiệu suất thủy phân N- acetyl-D-glucosamine được xác định theo công thức:
H =
Trong đó:
H: Hiệu suất thủy phân (%)
M1: hàm lượng đường khử GlcNAc (mg/ml) M2: khối lượng chitin (khô) (mg/ml)
2.5.2.4. Xác định phổ sản phẩm của quá trình thủy phân
Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) để xác định phổ sản phẩm tạo thành. Mẫu nghiên cứu được cố định trên bản silicagel và sử dụng n – propanol 99% : ammoniac 27% với tỷ lệ 2:1 (v/v). Sản
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 25
phẩm tạo thành được xác định khi nhúng bản sắc ký qua dung dịch hiện màu là H2SO4 5% pha trong cồn tuyệt đối và sấy mẫu ở 1400C trong 30 phút.
Cách tiến hành
Chuẩn bị bản mỏng: Chuẩn bị một bản sắc ký bản mỏng (bản silica, Kieselgel 60 F245 Merck). Sấy bản mỏng ở 800C trong 30 phút. Sau đó chấm mẫu lên các vị trí đã đánh dấu, sau mỗi lần chấm phải sấy khơ ln. Đường kính mỗi mẫu chấm < 5mm.
Dung mơi chạy sắc ký: tùy từng mẫu chất cần phân tích mà sử dụng loại dung mơi thích hợp. Dung mơi sử dụng cho quá trình phân tách N-acetyl-D-glucosamine là n-propanol (99%) và NH3 (27%) với tỷ lệ 2:1. Dung dịch phải pha trước khi chạy sắc ký 4 giờ.
Dung dịch hiện màu: Sấy bản mỏng ở 800C trong 5 phút cho khô trước khi cho vào dung dịch hiện màu. Dung dịch hiện màu là H2SO4 5% pha trong cồn tuyệt đối.
2.5.2.5. Xác định hiệu suất thu hồi GlcNAc
Hiệu suất thu hồi của sản phẩm GlcNAc sau mỗi bước được tính theo cơng thức:
Trong đó:
M1: Lượng GlcNAc tính theo DNS trong bước trước M2: Lượng GlcNAc tính theo DNStrong bước tiếp theo
2.5.2.6. Xác định độ ẩm sản phẩm GlcNAc
Xác định hàm ẩm nhanh của sản phẩm GlcNAc bằng phương pháp sấy hồng ngoại
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 26
2.5.2.7. Phƣơng pháp xác định độ tinh sạch của GlcNAc:
Đem 1g mẫu pha trong 1ml nước cất thu dịch. Xác định lượng GlcNAccó trong dịch dựa theo phương pháp DNS với GlcNAc là chất chuẩn.
Công thức xác định độ tinh sạch:
Trong đó: G1: hàm lượng GlcNAc của sản phẩm tinh sạch thu được (mg) G2: khối lượng mẫu đem xác định (mg)
W- độ ẩm của sản phẩm (%) T: mức độ tinh sạch (%)
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu điều kiện thu nhận và bảo quản dịch enzyme chitinase
3.1.1. Nghiên cứu điều kiện cô đặc enzyme chitinase
Sau khi lên men, dịch lên men được lọc bằng giấy lọc để loại sinh khối và cơ chất dư thu dịch nổi. Tuy nhiên dịch enzyme thu được có hoạt độ thấp, hiệu suất thủy phân khơng cao, vì vậy đề tài tiến hành cơ đặc dịch enzyme xác định mức độ cơ đặc thích hợp để tạo hiệu suất thủy phân cao hơn và thu sản phẩm có nồng độ cao hơn. Nồng độ sản phẩm cao sẽ giảm chi phí cho q trình thu hồi sản phẩm sau này.
Đề tài tiến hành khảo sát các mức độ cô đặc bằng phương pháp lọc dòng ngang. Để lựa chọn được nồng độ cơ đặc thích hợp, đề tài đã khảo sát các nồng độ cô đặc ở 2 lần, 3 lần, 4 lần. Kết quả cơ đặc được trình bày trong bảng 3.1.
Qua bảng 3.1, ta thấy hoạt độ enzyme dịch sau khi được cô đặc từ 2, 3 đến 4 lần tăng tương ứng lên 1,84; 2,77 và 3,6 lần. Hiệu suất thu hồi enzyme giảm trong q trình cơ đặcvà mức độ cơ đặc enzyme càng cao thì hiệu suất thu hồi enzyme càng giảm. Tại mức độ cô đặc 4 lần, hiệu suất thu hồi enzyme đạt 85,97%. Nguyên nhân có thể do một lượng enzyme đã bị đi qua màng lọc, chiếm 2,66% lượng enzyme ban đầu. Ngoài ra, một lượng enzyme bị giữ lại trên màng cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu suất thu hồi enzyme, thể hiện ở lượng protein sau khi lọc giảm gần 27mg tương ứng khoảng hơn 8% lượng protein.
B 7Bảng 3.1. Khảo sát các nồng độ cô đặc dịch enzyme Penicillium oxalicum 20B
B Mẫu V (ml) Hoạt độ enzyme (U/ml) Proteint ổng (mg) Tổng U Enzyme /Protein (U/mg) Hiệu suất (%) Mức độ tinh sạch (%) Dịch tổng ban đầu 3900 0,0137 326,27 53,487 0,164 100 1,000
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 28 (chưa cô đặc) Dịch cô đặc 2 lần 1900 0,0253 306,79 48,082 0,157 89,90 0,96 Dịch cô đặc 3 lần 1400 0,0380 286,34 46,310 0,162 86,58 0,99 Dịch cô đặc 4 lần 1220 0,0494 249,93 45,983 0,184 85,97 1,12 Dịch qua lọc màng 300 0,0005 48,99 1,423 0,029 2,66 0,18 Q trình cơ đặc enzyme hầu như khơng làm thay đổi mức độ tinh sạch của enzyme, kết quả tinh sạch qua các bước cơ đặc dao động từ 0,96-1,12 lần. Vì vậy, đề tài tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trên enzyme cô đặc 4 lần.
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện bảo quản đến hoạt tính chitinase và khả năng thủy phân của chế phẩm chitinase và khả năng thủy phân của chế phẩm chitinase
Điều kiện bảo quản enzyme có ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính của enzyme. Để bảo quản enzyme trong một thời gian dài mà khơng làm giảm hoạt tính của enzyme, có rất nhiều các phương pháp như: bổ sung chất bảo quản hoặc giữ enzyme ở các nhiệt độ thích hợp.
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản
Đề tài tiến hành nuôi cấy và lên men chủng Penicilium oxalicum 20B thu
dịch enzyme chitinase. Sau đó, tiến hành cơ đặc 4 lần dịch enzyme chitinase bằng phương pháp lọc dòng ngang và bảo quản dịch enzyme sau cô đặc ở các ở các điều kiện đã chọn. Sự thay đổi của hoạt độ enzyme chitinase khi bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau được thể hiện qua biểu đồ hình 3.1.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 29