PHẦN 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu điều kiện thu nhận và bảo quản dịch enzyme chitinase
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện bảo quản đến
và khả năng thủy phân của chế phẩm chitinase
Điều kiện bảo quản enzyme có ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính của enzyme. Để bảo quản enzyme trong một thời gian dài mà khơng làm giảm hoạt tính của enzyme, có rất nhiều các phương pháp như: bổ sung chất bảo quản hoặc giữ enzyme ở các nhiệt độ thích hợp.
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản
Đề tài tiến hành nuôi cấy và lên men chủng Penicilium oxalicum 20B thu
dịch enzyme chitinase. Sau đó, tiến hành cơ đặc 4 lần dịch enzyme chitinase bằng phương pháp lọc dịng ngang và bảo quản dịch enzyme sau cơ đặc ở các ở các điều kiện đã chọn. Sự thay đổi của hoạt độ enzyme chitinase khi bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau được thể hiện qua biểu đồ hình 3.1.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 29
H 7Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến hoạt tính chitinase
Kết quả hình 3.1 cho thấy khi được giữ ở 40C và -200C, hoạt độ chitinase hầu như không đổi trong thời gian 39 ngày. Trong khi đó hoạt độ chitinase đã bắt đầu giảm chỉ sau 3 ngày (khoảng 10%) và giảm gần 60% ở nhiệt độ phòng chỉ sau 18 ngày bảo quản. Nếu so với enzyme chưa cơ đặc, hoạt tính chitinase chỉ cịn 50% sau 3 ngày bảo quản ở nhiệt độ phịng (kết quả khơng chỉ ra ở đây) thì việc cơ đặc chitianase đã làm tăng thời gian bảo quản của chitinase lên khá nhiều. Nguyên nhân là do sự giảm lượng nước trong dịch chitinase cơ đặc. Trong vịng 51 ngày bảo quản, hoạt độ chitinase là tương đương ở 2 mẫu bảo quản ở 40C và -200C, còn xấp xỉ hơn 80% hoạt độ ban đầu, trong khi mẫu bảo quản ở nhiệt độ phịng chỉ cịn giữ lại ít hơn 30% hoạt độ. Ở ngày 86, hoạt độ chitinase bắt đầu giảm đáng kể ở các mẫu bảo quản lạnh nhưng vẫn còn hơn 40-50% hoạt tính, hơn gấp đơi ở nhiệt độ thường. Hoạt tính enzyme chitinase ổn định hơn ở điều kiện lạnh so với nhiệt độ phòng là kết quả đã được kiểm chứng trong nhiều công bố. Sau 217 ngày (khoảng 7 tháng) thì hoạt độ chitinase giảm về 0 ở nhiệt độ phòng và -200C trong khi vẫn còn 20% ở nhiệt độ 40C. Nhiệt độ 40C dường như tốt nhất cho việc duy trì hoạt độ chitinase trong thời gian bảo quản dài. Ở nhiệt độ -200C sự tạo thành các tinh thể đã làm giảm hoạt tính chitinase. Các kết quả thu được nói trên khơng mới, tuy nhiên có
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 30
thể rút ra kết luận là ở điều kiện lạnh (nhiệt độ <4 C), hoạt tính chitinase của chế phẩm chitinase cơ đặc có thể ổn định trong vịng 50 ngày.
Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng GlcNAc thu được sau quá trình thủy phân 72h được thể hiện qua hình 3.2.
H 8Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến hàm lượng GlcNActhu được sau 72h thủy phân
Nhìn vào biểu đồ, ta có thể thấy khi bảo quản ở nhiệt độ phòng hàm lượng GlcNAc thu được sau 9 ngày chỉ còn 2% so với ban đầu. Trong khi đó, bảo quản ở 40C và -200C thì lượng GlcNAc bắt đầu giảm sau 18 ngày bảo quản tuy nhiên sau 174 ngày vẫn còn đến 70% so với ngày đầu. Tuy vậy sau 217 ngày (tương ứng hơn 7 tháng) bảo quản ở nhiệt độ thường và -200C thì lượng GlcNAc thu được gần như bằng 0. Trong khi đó ở 40C, lượng GlcNAc thu được vẫn bằng 70% so với ban đầu. Như vậy nhiệt độ 4oC tốt hơn cho bảo quản chitinase so với -200C. So với kết quả hình 3.1, mặc dù ở nhiệt độ thường sau 9 ngày bảo quản, hoạt tính chitinase vẫn cịn đến 75% nhưng hiệu suất thủy phân rất thấp chứng tỏ sự kém bền của chitinase bảo quản ở nhiệt độ phòng.
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của chất bảo quản
Trong nghiên cứu này, chế phẩm chitinase được giữ ở nhiệt độ 40C là nhiệt độ tốt nhất cho bảo quản chitinase. Song song với nhiệt độ, các chất phụ gia khác
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 31
nhau như glycerol, manitol, muối dùng riêng rẽ hay kết hợp đã được sử dụng với mục đích tăng thời gian bảo quản cho enzyme chitinase. Sự thay đổi của hoạt độ chitinase trong q trình bảo quản có bổ sung các chất phụ gia khác nhau được thể hiện qua biểu đồ hình 3.3.
H 9Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt tính chitinase
Nhìn vào hình 3.3, ta thấy việc sử dụng chất bảo quản glyxerol, hỗn hợp glyxerol với NaCl hay mannitol với NaCl không đem lại hiệu quả cho việc ổn định hoạt tính chitinase. Chỉ khi sử dụng chất bảo quản NaCl một mình có thể làm tăng tính ổn định của chitinase trong thời gian dài hơn, sau 86, 174 hay 217 ngày hoạt tính chitinase cao hơn gần 2 lần so với khi không sử dụng chất bảo quản hay các chất bảo quản khác.
Đề tài cũng tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chất bảo quản đến hiệu suất thu hồi GlcNAc bằng cách thủy phân cơ chất chitin 20% trong 72h, 400C (hình 3.4). Nhìn vào hình 3.4, ta có thể thấy khi bảo quản dịch enzyme thô bằng NaCl ở 40C thu được hàm lượng GlcNAc cao nhất và ổn định nhất sau đó là đến hỗn hợp manitol và NaCl. Tuy sự chênh lệch về hoạt tính chitinase trong các mẫu khác nhau khá cao (hình 3.3) sự chênh lệch về hiệu suất thủy phân là tương đối ít. Sau 217
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 32
ngày bảo quản bằng NaCl, hàm lượng GlcNAc thu được còn 80% so với ban đầu, trong các mẫu còn lại là 68-75%.
H
10Hình 3.4. Ảnh hưởng của các chất bảo quản bổ sung đến hàm lượng GlcNAc thu được sau 72h thủy phân
11Hình 3.5. Hình ảnh TLC sản phẩm thủy phân chitinhuyền phù 20% bởi chitinase với các điều kiện bảo quản (18 ngày)
1. GlcNAc; 2.Nhiệt độ phòng; 3.40C; 4.-200C; 5.ĐC 40C; 6.Glycerol; 7.ĐC Glycerol; 8.Glycerol+NaCl; 9.ĐC Glycerol+NaCl; 10.NaCl+Mannitol; 11.ĐC
NaCl+Mannitol; 12.NaCl; 13.ĐC NaCl; 14.ĐC cơ chất chitinase 20%
Nhìn vào hình ảnh sắc ký 3.5, ta có thể thấy sản phẩm tạo thành sau q trình thủy phân chitin huyền phù trong 72 giờ của chitinase thô thu từ Penicillium
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 33
oxalicum 20B với các điều kiện bảo quản khác nhau sau 18 ngày thủy phân đều tạo
thành GlcNAc đơn phân trừ với trường hợp bảo quản ở nhiệt độ phòng. Kết quả này phù hợp với kết quả hiệu suất thủy phân tương đối hình 3.2 và 3.4. Sản phẩm thủy phân GlcNAc trên bản sắc kí khơng được sắc nét khi bảo quản trong glycerol hay manitol, nguyên nhân có thể do ảnh hưởng của chúng đến sự phân bố sản phẩm trên bản sắc kí.
H 12Hình 3.6. Hình ảnh TLC sản phẩm thủy phân chitin huyền phù 20% bởi chitinase với các điều kiện bảo quản (217 ngày)
1. GlcNAc;2. 40C; 3.ĐC 40
C. 4. Glycerol; 5. ĐC Glycerol ; 6. Glycerol+NaCl; 7.ĐC Glycerol+NaCl; 8.NaCl+Mannitol; 9.ĐC NaCl+Mannitol; 10.NaCl; 11.ĐC
NaCl; 12. ĐC cơ chất chitinase 20%
Kết quả sản phẩm thủy phân trên hình 3.6 phù hợp với kết quả hình 3.5. Sản phẩm GlcNAc rõ nét đối với trường hợp không chất bảo quản và có NaCl hay NaCl với mannitol. Tuy vậy so với bản sắc kí hình 3.5 thì lượng sản phẩm đã giảm phù hợp với kết quả hình 3.2và 3.4. Như vậy, muốn bảo quản enzyme chitinase thô trong một thời gian dài thì lựa chọn tốt nhất là bổ sung NaCl.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 34