t Tên mẫu Bƣớc tinh sạch GlcNAc (mg/ml) V (ml) Khối lƣợng (g) GlcNAc (mg/g) GlcNAc (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Thủy phân 6,7 1800 12065,29 Sau lọc than 20g/l 6,28 1500 9425,31 100 1 Cặn sau kết tủa cồn 3,72 5,85 0,59 36,88 21,75 0,23 2 Hạt kết tinh to, vàng trong dịch sau kết tủa cồn và ly tâm loại cặn, để lạnh 2 ngày 10,05 10 0,95 105,79 100,50 1,07 3 Hạt kết tinh nhỏ, trắng trên thành bình trong dịch sau kết tủa cồn và ly tâm loại cặn, để lạnh 2 ngày 9,73 20 1,45 134,21 194,60 2,07 4 Cặn trắng bám trên bình hình thành ngay khi cô
quay
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 42 5 Dịch bám trên thành bình sau cơ quay 22,91 10 229,10 2,43 6 Dịch sau kết tinh, cô đặc 14,73 571,33 8415,69 89,34
Sấy đông khô 11,56 728 8415,68 89,34
Tổng cộng (1-6) 97,96
Kết quả bảng 3.4 cho thấy quá trình lọc than hoạt tính làm sáng màu dung dịch nhưng làm thất thốt gần 22% lượng GlcNAc. Q trình kết tinh có loại được một số các hạt kết tinh hình thành trong quá trình để lạnh và cơ quay. Các mẫu kết tinh đều có hàm lượng GlcNAc (mg/g) nhỏ hơn nhiều lần so với sản phẩm và do vậy làm tăng độ tinh sạch của sản phẩm. Mẫu 6 là sản phẩm dạng paste có độ ẩm 21,5%, tổng lượng mẫu thu được là 14,73g. Hiệu suất thu hồi của sản phẩm đạt 89,34%. Lượng GlcNAc trong các mẫu kết tinh và cặn loại đi vào khoảng 8% chứng tỏ khoảng 2% thất thoát chưa thu hồi được. Độ tinh sạch của mẫu thu được theo qui trình đạt 73,26%, tăng khoảng 16 % so với nghiên cứu trước do 1 lượng muối kết tinh đã được loại bỏ.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 43
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết luận
1. Dịch enzyme chitinase thô lên men từ chủng Penicilium oxalicum 20B được cô đặc 4 lần với hiệu suất thu hồi enzyme là 69,12%, mức độ tinh sạch là 0,79%. Ở điều kiện nhiệt độ 4oC có bổ sung chất bảo quản là NaCl, hoạt tính enzyme chitinase giữ được là ổn định nhất và cịn giữ được 50% hoạt tính sau 217 ngày bảo quản. Hàm lượng GlcNAc thu được khi thủy phân bằng chitinase sau 217 ngày bảo quản giảm 20%.
2. Điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin của enzyme chitinase từ chủng Penicilium oxalicum 20B là nhiệt độ 400C, pH=5 và thời gian 72h.
3. Quá trình sấy phun và sấy đơng khơ đều có thể ứng dụng thu sản phẩm nhưng sấy đông khơ cho sản phẩm có độ tinh sạch cao hơn. Tinh sạch GlcNAc theo qui trình đề xuất đạt hiệu suất thu hồi 89,34% và độ tinh sạch của sản phẩm đạt được là 73,26%.
Kiến nghị
1. Xác định đặc tính chế phẩm chitinase cơ đặc
2. Tiếp tục nghiên cứu quy trình tinh sạch để thu GlcNAc với độ tinh sạch cao hơn.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Aizi Nor Mazila Ramli, Nor Muhammad Mahadi, Amir Rabu, Abdul Munir Abdul Murad, Farad Diba Abu Bakar and Rosli Md lllias (2011), "Molecular cloning, expression and biochemical characterization of a cold-adapted novel recombinant chitinase from Glaciozyma antarctia Pl12".Microbial Cell
Factories, 10(94).
2. Anton P. Busink, Dave Speijer, Johannes M. F. G. Aerts and Rolf G. Boot (2007), "Evolution of Mammalian Chitinase (-Like) Members of Family 18 Glycosyl Hydrolases".Genetics Society of America (107.075846).
3. Ausa Chandumpai, Narongsak Singhpibulporn, Damrongsak Faroongsarng, Prasart Sornprasit (2004), "Preparation and physic-chemical characterization of chitin and chitosan from the pens of the squid species, Loligo lessoniana and Loligo formosana".Carbohydrate Polymers, 58(467-474).
4. Barnhill, J.G.; Fye, C.L.; Reda, D.J.; Harris, C.L.; Clegg, D.O (2009), "Is All Glucosamine Alike? Clarifying the Controversies for Product Selection and Clinical Research".J. Compl. Integr. Med, 6, 17.
5. Berglund, L, J. Brunstedt, K.K.Nielsen, Z.Chen. J.D.Mikkelsen and K.A.Marcker, (1995), "A proline-rich chitinase from Beta vulgaris".Plant
Mol. Biol, 27, 211-216.
6. Bohlman, J.A.; Schisler, D.O.; Hwang, K.O.; Hennling. J.P.; Trinkle, J.R.; Anderson, T.B.; Steinke, J.D.; Vanderhoff, A (2004), "N-Acetyl-D- glucosamine and Process for Producing N-Acetyl-D-glucosamine".US
Patent NO, 6693188B2.
7. C. Sandhya, Leela Krishna Adapa, K. Madhavan Nampoothiri, P.Binod, George Szakacs and Ashok Pandey (2004), "Extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in submerged fermentation".FJournal
of Basic Microbiology, 44(1), 49-58.
8. Chao-Jen KUO, Li-Chun HUANG, Yi-Chun LIAO, Chen-Tien CHANG and Hsien-Yi SUNG (2009), "Biochemical characterization of a novel chitotriosidase from suspension-cultured bamboo (Bambusa oldhamii) cells".Botanical Studies, 50, 281-289.
9. Cheba, Ben Amar (2011), "Chitin and Chitosan: Marine Biopolymers with Unique Properties and Versatile Applications".Global Journal of
Biotechnology & Biochemistry 6(3), 149-153.
10. Cohen-Kupiec, R.; Chet, I (1998), "The Molecular Biology of Chitin Digestion".Curr. Opin. Biotechnol, 9, 270–277.
11. Darmanto, Y. S. (2003), "Effect of chitin and chitosan derived from crab shell and shrimp head on the unfrozen water and denaturation of lizard fish
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 45
myofibrils during frozen storage".Journal of Coastal development, 6(2), 97- 105.
12. David B. Collinge, Karsten M. Kragh, Jorn D. Mikkelsen, Klaus K. Nielsen, Ulla Rasmussen and Knud Vad (1993), "Plant chitinases".The Plant Journal, 3(1), 31-40.
13. Felse, P. A., & Panda, T. (2000). (2000), "Submerged culture production of chitinase by Trichoderma harzianum in stirred tank bioreactors - the
influence of agitator speed".Biochemical engineering journal, 4(2), 115 - 120.
14. Garg N, Gupta H (2010), "Isolation and purification of fungal pathogen(Macrophomina Phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius)".J Pharm Bioall Sci, 2, 38-43.
15. Gooday, G.W (1990), "The Ecology of Chitin Degradation".Adv. Microb.
Ecol, 11, 387–430.
16. Gupta R, Saxena R, Chaturvedi P, Virdi J (1995), "Chitinase production by
Streptomyces viridificans: Its potential in fungal cell wall lysis.
1995;78:378–83".J Appl Bacteriol, 78, 378-83.
17. Hitoshi Sashiwa, Shizu Fujishima, Naoko Yamano, Norioki Kawasaki, Atsuyoshi Nakayama, Einosuke Muraki, Kazumi Hiraga, Kohei Oda, Sei- ichi Aiba (2002), "Production of N-acetyl-D-glucosamine from α-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330"., Elsevier Science,
Carbohydrate Research 761-763.
18. Hitoshi Sashiwa, Shizu Fujishima, Naoko Yamano, Norioki Kawasaki, Atsuyoshi Nakayama, Einosuke Muraki, Mongkol Sukwattanasinitt, Rath Pichyangkura, Sei-ichi Aiba (2003), "Enzymeatic production of N-acetyl-D- glucosamine from chitin. Degradation study of N-acetylchitooligosaccharide and the effect of mixing of crude enzymes".Elsevier Science, 391-395. 19. Immaculada Aranaz, Marian Mengibar, Ruth Harris, Ines Panos, Beatriz
Miralles, Niuris Acosta, Gemma Galed and Angeles Heras (2009), "Functional Characterization of Chitin and Chitosan".Current Chemical
Biology, 3, 203-230.
20. J. H. Kuk, W. J. Jung, G. H. Jo, Y. C. Kim, K. Y. Kim, R. D. Park (2005), "Production of N-acetyl-β-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp. GJ - 18 crude enzyme".Applied Microbiology and Biotechnology, 68(3), 384 - 389.
21. Jaime Monreal, Elwyn T. Reese (1969), "The chitinase of Serratia marcescens".Canadian Journal of Microbiology, 15(7), 689-696.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 46
22. Jeen-Kuan Chen, Chia-Rui Shen and Chao-Lin Liu (2010), "N- acetylglucosamine: Production and Applications".Marine Drugs, 8(1660- 3397), 2493-2516.
23. Jennifer L. Guthrie, Sagal Khalif, Alan J. Castle (2005) (2005), "An improved method for detection and quantification of chitinase activities".Canadian Fournal of Microbiology, 51(6), 491 - 495.
24. Jonlanta Kumirska, Mirko X. Weinhold, Jorg Thoming and Piotr Stepnowski (2011), "Biomedical Activity of Chitin/Chitosan Based Materials-Influence of Physicochemical Properties Apart from Monecular Weight and Degree of N-Acetylation".Polymers, 3(1875-1901, ISSN 2073-4360).
25. K. Jami al Ahmadi, M. Tabatabaei Yazdi, M.Fathi Najafi, A.R. Shahverdi, M. A. Faramarzi, Gh. Zarrini and J. Behravan (2008), "Isolation and Characterization of a Chitionolytic Enzyme Prodiucing Microorganism, Paenibacillus chitinolyticus JK2 from Iran".Research Journal of
Microbiology 3(6), 395-404.
26. K. Jamialahmadi, J. Behravan, M. Fathi Najafi, M. Tabatabaei Yazdi, A.R. Shahverdi and M.A. Faramarzi (2011), "Enzymatic Production of N-acetyl- D-glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp. PTCC1691".Biotechnology, 10(3), 292-297.
27. Kasprzewska, Anna (2003), "Plant chitinase-Regulation and function". 8, 809-824.
28. Kim-Chi Hoang, Tzu-Hsuan Lai, Chung-Sheng Lin, Ying-Tsong Chen and Chun-Yi Liau (2011), "The Chitinolytic Activities of Streptomyces sp. TH- 11".International Journal of Molecular Sciences, 12(ISSN 1422-0067), 56- 65.
29. Laura Ramirez-Coutino, Maria del Carmen Marin-Cervantes, Sergio Huerta, Sergio Revah, Keiko Shirai (2006), "Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases".Process Biochemistry, 41(5), 1106-1110.
30. Lee, E.A.; Pan, C.H.; Son, J.M.; Kim, S.I. (1999), "Isolation and Characterization of Basic Exochitinase from Leaf Extract of Rehmannia glutinosa".Biosci. Biotechnol. Biochem, 63, 1781–1783.
31. Lerner, D.R and N.V.Raikhel (1992), "The gene for stinging nettle lectin (Urtica dioica agglutinin) encodes both a lectin and a chitinase".J. Biol.
Chem, 267, 11085-11091.
32. Li, Y.L.; Wu, S.T.; Yu, S.T.; Too, J.R (2005), "Screening of a Microbe to Degrade Chitin". Taiwanese J. Agric. Chem. Food Sci, 43, 410-418.
33. Louise, C.A.; Pedro, A.; Charles, A.H. (1999), "Process for Producing N- Acetyl-D-glucosamine".US Patent NO. 5998173.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 47
34. Maria Cecillia Gortari, Roque Alberto Hours (2013), "Biotechnological processes for chitin recovery out of crustacean waste: A mini- review".Electronic Journal of Biotechnology,(ISSN: 0717-3458).
35. Marina Duarte Pinto Lobo, Fredy Davi Albuquerque Silva, Patricia Gadelha de Castro Landim, Paloma Ribeiro da Cruz, Thais Lima de Brito, Suelen Carneiro de Medeiros, Jose Tadeu Abreu Oliveria, Ilka Maria Vasconcelos, Humberto D’Muniz Pereira and Thalles Barbosa Grangeiro (2013), "Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli".BMC Biotechnology (1472-6750/13/46).
36. May Bente Brurberg, Bjornar Synstad, Sonja Sletner Klemsdal, Daan M.F. van Aalten Leif Sundheim and Vincent G.H. Eijsink (2000), "Chitinases from Serratia marcescens".
37. Merina Paul Das, L. Jeyanthi Rebecca, S. Sharmila, Anu, Ankita Banerjee and Dhiraj Kumar (2012), "Identification and optimization of cultural conditions for chitinase production by Bacillus amyloliquefaciens
SM3".Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 4(11), 4816-4821. 38. Nielsen, K.K, Mikkelsen, J.D.Kragh, K.M and Bojsen, K (1993), "An acidic class III chitinase in sugar beet: Induction by Cercospora beticola, characterization, and expression in transgenic tobacco plants".Mol. Plant
Microbe Interact, 6, 495-506.
39. Pankaj Patidar, Deepti Agrawal, Tushar Banerjee, Shridhar Patil (2005), "Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation".Process Biochemistry, 40, 2962-2967.
40. Paolo Senin, Monza (Milano) (IT); Antonino Santoro; Luigi Angelo Rovati (2010), "Compositions containing N-acetylglucosamine for use in dermo- cosmetology and aesthetic medicine".United States; Patent Application
Publication, US 20100028395A1.
41. Pradip Kumar Dutta, Joydeep Dutta and V.S Tripathi (2004), "Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications".Journal of Scientific &
Industrial Rếarch, 63, pp 20-31.
42. Qiwang Xu, Junkang Liu, Zetao Yuan (2006), "Use of N-acetyl-D- glucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for suppressing side-effect of radiotherapy and chemotherapy".United States Patent No. US
7,037,904 B2.
43. Qlwang Xu, Funkang Liu, Zetao Yuan (2006), "Use of N-acetyl-D- glucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for suppressing side-effect of radiotherapy and chemotherapy".United States Patent (No. US 7,037,904 B2).
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 48
44. Rath Pichyangkura, Sanya Kudan, Kamontip Kuttuyawong, Mongkol Sukwattanasinitt, Sei-ichi Aiba (2002), "Quantitative production of 2- acetamido-2-deoxy-D-glucose from crystalline chitin by bacterial chitinase".Elsevier Science, Carbohydrate Research 337, 557-559.
45. Reetarani S. Patil, Vandana Ghormade, Mukund V. Deshpande (2000), "Chitinolytic enzymes: an exploration".Enzyme and microbial technology, 473-483.
46. Rifat Hamid, Minhaj. A. Khan, Mahboob Ahmad, Malik Mobeen Ahmad, Malik Zainul Abdin, Javend Musarrat and Saleem Javed (2013), "An update: Chitinase".J Pharm Bioallied Science, 5(1), 21-29.
47. Rifat Hamid, Minhaj. A. Khan, Mahboob Ahmad, Malik Mobeen Ahmad, Malik Zainul Abdin, Javend Musarrat and Saleem Javed (2013), "An update: Chitinase".Journal of Pharmacy Bioallied Sciences, 5(1), 21-29.
48. Roberts WA, Selitrennikoff CP (1998), "Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity".J Gen Microbiol, 134(169-76).
49. Saboki Ebrahim, K.Usha and Bhupinder Singh (2011), "Pathogenesis Related (PR) Proteins in Plant Defense Mechanism".Science against
microbial pathogens: communicating current research and technological advances.
50. Sakai, K (1995), " In Chitin, Chitosan Handbook".Japanese Society of Chitin
and Chitosan, Ed.; Gihodo, Tokyo, , pp 209–218.
51. Sanjeev Kumar, Rohit Sharma, Rupinder Tewari (2011), "Production of N- Acetylglucosamine Using Recombinant Chitinolytic Enzymes".Indian J
Microbiol 319-325.
52. Sashiwa, H.; Fujishima, S.; Yamano, N.; Kawasaki, N.; Nakayama, A.; Muraki, E.; Aiba, S. (2001), "Production of N-Acetyl-D-glucosamine from β-Chitin by Enzymatic Hydrolysis".Chem. Lett, 31, 308–309.
53. Shishi H, Neuhaus J.M, Ryals J and Meins F. Jr (1990), "Structure of a tobacco chitinase gene: evidence that different chitinase genes can arise by transposition of sequences encoding a cysteine-rich domein".Plant Mol. Biol, 14, 357-368.
54. Speck, Ulrich Prof Dr (1989), "N-acetylglucosamine for buccal application". DE3927723 A1.
55. T., Neuhaus J.M. Sticher L. Meins F.Jr and Boller (1991), "A short C- terminal sequence is necessary and sufficient for the targeting of chitinases to the plant vacuole".Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 88, 1062-1066.
56. Takeshi Watanabe, Ryo Kanai, Tomokaru Kawase, Toshiaki Tanabe, Masaru Mitsutomi, Shohei Sakuda and Kiyotaka Miyashita (1999), "Family 19
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 49
chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution".Microbiology 145, 3353-3363.
57. Tomokaru Kawase, Akihiro Saito, Toshiya Sato, Ryo Kanai, Takeshi Fujii, Naoki Nikaido, Kiyotaka Miyashita and Takeshi Watanabe (2004), "Distribution and Phylogenetic Analysis of Family 19 Chitinase in Actinobacteria".Applied and Environmental Microbiology, 70(2), 1135. 58. Tsuyoshi Ohno, Sylvie Armand, Toshinao Hata, Naoki Nikaidou, Bernard
Henrissat, Masaru Mitsutomi and Takeshi Watanabe (1996), "A Modular Family 19 Chitinase Found in the Prokaryotic Organism Streptomyces griseus HUT 6037".Journal of Bacteriology, 5065-5070.
59. V. Shanmugaiah, N. Mathivanan, N. Balasubramanian and P. T. Manoharan (2008), "Optimization of cultural conditions for production of chitinase by Bacillus laterosporous MML2270 isolated from rice rhizosphere soil".African Journal of Biotechnology, 7(15), 2562-2568.
60. Xu, Qiwang, Liu Junkang, Yuan Zetao (2002), "The use of N-acetyl-D- glucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for preventing and treating sexual disorder".EUROPEAN PATENT APPLICATION, 371.
61. Yamabhai, Feisal Khoushab and Montarop (2010), "Chitin Research Revisited".Marine rugs ISSN 1660-3397.
62. Yoon Gyo Lee, Ki-Chul Chung, Seung Gon Wi, Jae Chang Lee, Hyeun-Fong Bea (2009), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp. LYG 0704".Protein Expression and purification, 65, 244-250.
Học viên: Đồng Thị Hương Trầm Trang 50
PHỤ LỤC
1. Xây dựng đƣờng chuẩn N-acetyl-D-glucosaminetheo phƣơng pháp DNS
Thí nghiệm tiến hành với các nồng độ đường khác nhau ở cùng một thể tích và phản ứng với DNS, so màu ở bước sóng 540nm. Kết quả thể hiện qua bảng PL1