Tuyển chọn chủng và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase ứng dụng cho thu nhận n acetyl d=glucosamin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== ĐẶNG THỊ HƯỜNG TUYỂN CHỌN CHỦNG VÀ TỐI ƯU ĐIỂU KIỆN SINH TỔNG HỢP CHITINASE ỨNG DỤNG CHO THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMIN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== ĐẶNG THỊ HƯỜNG TUYỂN CHỌN CHỦNG VÀ TỐI ƯU ĐIỂU KIỆN SINH TỔNG HỢP CHITINASE ỨNG DỤNG CHO THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMIN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội – 2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường LỜI CAM ĐOAN Tôi Đặng Thị Hường xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài: “ Tuyển chọn chủng tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase ứng dụng cho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin” công trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác Cơng nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà, Th.S Dương Thị Ngọc Quỳnh - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Đặng Thị Hường Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 10 PHẦN I TỔNG QUAN 12 1.1 Chitinase 12 1.1.1 Cấu trúc 12 1.1.2 Cơ chế hoạt động chitinase 14 1.1.3 Các đặc tính hệ chitinase 15 1.1.4 Các nguồn thu nhận chitinase 17 1.1.5 Sơ lược nghiên cứu chitinase từ vi sinh vật 19 1.1.6 Ứng dụng chitinase 23 1.2 Đặc điểm sinh học chủng nấm mốc Penicillium 25 1.2.1 Vị trí phân loại Penicillium hệ thống phân loại nấm 25 1.2.2 Các chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp Penicillium 25 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitinase 26 1.3 Chitin 29 1.3.1 Nguồn gốc Chitin 29 1.3.2 Cấu tạo chitin 30 1.3.3 Các tính chất chitin 31 Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 1.4 N-Acetyl-D- glucosamin (GlcNAc) 33 1.4.1 Cấu tạo N-Acetyl-D- glucosamin 33 1.4.2 Tính chất N-Acetyl-D- glucosamin 34 1.4 Ứng dụng N-Acetyl-D- glucosamin 34 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36 2.1 Nguyên vật liệu 36 2.1.1 Giống vi sinh vật 36 2.1.2 Hóa chất 36 2.1.3 Dụng cụ 36 2.1.4 Các thiết bị 37 2.1.5 Môi trường 37 2.2 Các phương pháp 39 2.2.1 Phương pháp giữ giống 39 2.2.2 Phương pháp hoạt hóa giống 39 2.2.3 Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù 40 2.2.4 Phương pháp lên men chủng Penicillium oxalicum 20B 40 2.2.5 Xác định hàm lượng N-acetyl glucosamin 40 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ chitinase 41 2.2.7 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân tương đối 42 2.2.8 Phương pháp chạy sắc ký mỏng 42 2.2.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B 44 2.2.10 Phương pháp xác định sinh khối 46 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp chitinase 47 3.2 Ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh tổng chitinase chủng 48 Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 48 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian lên men 50 3.2.3 Kết khảo sát ảnh hưởng pH môi trường 52 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi bào tử 53 3.2.5 Ảnh hưởng nguồn nito 55 3.2.6 Ảnh hưởng hàm lượng chitin 60 3.2.7 Ảnh hưởng nguyên tố khoáng 61 3.3 So sánh hoạt độ hiệu suất thủy phân chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau tối ưu 65 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1 Kết luận 67 4.2 Kiến nghị 67 PHỤ LỤC 72 Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU GlcNAc, NAG TÊN ĐẦY ĐỦ N-acetyl-D-glucosamin (GlcNAc)2 Diacetyl chitobiose (GlcNAc)3 Chitooligomer VP1 Vibrio parahemolyticus DMAc N,N-dimetyl axetamindo LD50 Lethal Dose TP Thủy phân CMN Cao nấm men DNS 3,5-dinitrosalicylic axit OD Mật độ quang pHopt pH tối ưu TLC Thin Layer Chromatography Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Tỷ lệ chitin loài khác 29 Bảng Điều kiện lên men chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau khảo sát 65 Bảng Hoạt độ hiệu suất TP tương đối chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau khảo sát 66 Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 12 Hình Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 13 Hình Cơ chế hoạt động chitinase Trichoderma 14 Hình Cơng thức cấu tạo chitin 30 Hình Các kiểu xếp mạch đại phân tử chitin 31 Hình Cấu tạo N-Acetyl-D- glucosamin 33 Hình Hoạt độ chitinase chủng nghiên cứu 47 Hình Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch lên men thô chủng 48 Hình 3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống tới hoạt độ chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B 49 Hình Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống tới hiệu suất thủy phân 49 Hình Ảnh hưởng thời gian lên men tới hoạt độ chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B 50 Hình Ảnh hưởng thời gian lên men tới hiệu suất thủy phân 51 Hình Ảnh hưởng pH môi trường tới hoạt độ chitinase sinh trưởng chủng Penicillium oxalicum 20B 52 Hình Ảnh hưởng pH mơi trường tới hiệu suất thủy phân 53 Hình Ảnh hưởng thời gian ni bào tử tới hoạt độ chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B 54 Hình 10 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy bào tử tới hiệu suất thủy phân 55 Hình 11 Ảnh hưởng nguồn nito tới hoạt độ chitinase sinh trưởng chủng Penicillium oxalicum 20B 56 Hình 12 Ảnh hưởng nguồn nito tới hiệu suất thủy phân 57 Hình 13 Dịch lên men hàm lượng cao nấm men khác 58 Công nghệ sinh học 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường vật, chúng cần thiết cho trì cân sinh lý tế bào Mỗi ngun tố khống có chức riêng vi sinh vật 3.2.7.1 Ảnh hưởng nồng độ kali phosphat Tiến hành thí nghiệm nồng độ kali phosphat sau: K2HPO4 : KH2PO4 = khơng có kali photphat; 0,2:0,1; 0,4:0,2; 0,8:0,4 % (khối lượng/thể tích) Kết thu thể đồ thị 3.18 0.30 0.25 0.25 0.22 0.19 0.20 0.15 0.15 0.10 0.05 0.04 0.05 0.04 0.03 0.00 Ko 0,2:0,1 0,4:0,2 Hoạt tính chitinase x10 (U/ml) 0,8:0,4 Sinh khối (g/10mL) Hình 18 Ảnh hưởng nồng độ kali phosphat tới hoạt độ chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B Từ hình 3.18, kết cho ta thấy tỷ lệ K2HPO4:KH2PO4 = 0,2:0,1 % hoạt độ chitinase đạt cao đạt 0,025 U/ml cao khơng có hỗn hợp muối phosphate Nếu tiếp tục tăng hỗn hợp muối, hoạt độ chitinase giảm, kéo theo hiệu suất thủy phân giảm 5% Đặc biệt khơng có muối phosphate hiệu suất thủy phân tương đối cao tương đương với nồng độ phosphat 0,2 : 0,1 hoạt độ chitinase thấp đến 1,67 lần Kết pH sau lên men hai trường hợp tương đương chứng tỏ pH sau lên men yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân Kết cho thấy dùng muối kali phosphat tỉ lệ cao Công nghệ sinh học 62 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 0,2:0,1 có ảnh hưởng khơng tốt đến sinh trưởng, hoạt tính chitinase hiệu suất thủy phân Trên hình 3.19 sắc kí đồ sản phẩm thủy phân chitin dịch chitinase thu lên men môi trường với nồng độ kali phosphat khác Từ kết chọn tỷ lệ K2HPO4:KH2PO4 = 0,2:0,1 để tiến hành thí nghiệm Hình 19 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch lên men thô tỷ lệ kali phosphat NAG đường đơi (N-N’-Diacetylchitobiose), Ko có kali phosphat, K2HPO4 : KH2PO4 = 0,2 :0,1, K2HPO4 : KH2PO4 = 0,4 :0,2 ,5 K2HPO4 : KH2PO4 = 0,8 :0,4 ,6 ĐC Enzyme ( ĐC K2HPO4 : KH2PO4 = 0,8 :0,4) ,7 ĐC chất ( chitin 20%) 3.2.7.2 Ảnh hưởng hàm lượng magie sunfat Tiến hành thí nghiệm hàm lượng magie sunfat 0,07; 0,14; 0,28 % (khối lượng/ thể tích) khơng bổ sung magie sunfat Kết thu thể đồ thị 3.20 Công nghệ sinh học 63 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 0.28 0.30 0.25 0.20 0.15 0.16 0.15 0.13 0.10 0.05 0.04 0.05 0.05 0.04 0.00 Ko 0.07 0.14 Hoạt tính chitinase x10 (U/ml) 0.28 Sinh khối (g/10mL) Hình 20 Ảnh hưởng hàm lượng magie sunfat tới hoạt độ chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B Kết từ hình 3.20 cho ta thấy hàm lượng magie sunfat 0,07 % hoạt độ chitinase cao đạt 0,028 U/ml tăng xấp xỉ gấp 1,87 lần so với không bổ sung magie sunfat Nếu tiếp tục tăng hàm lượng magie sunfat hoạt độ giảm Tại hàm lượng magie sunfat 0,28 % hoạt độ chitinase 0,013 U/ml giảm gấp đôi so với hàm lượng magie 0,07 % Hiệu suất thủy phân chủng Penicillium oxalicum 20B đạt cao hàm lượng magie sunfat 0,07 %, cao % không bổ sung magie sunfat cao 10 % so với hàm lượng magie sunfat 0,14 hay 0,28% Từ kết chọn hàm lượng MgSO4 0,07% để tiến hành tiếp thí nghiệm Công nghệ sinh học 64 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường Hình 21 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch lên men thô hàm lượng MgSO4 NAG, Ko có MgSO4 ,3 0.28% MgSO4, 0.14% MgSO4 ,5 0.07% MgSO4 ,6 ĐC Enzyme 0.07% MgSO4 ,7 ĐC chất chitin 20% Các kết thí nghiệm cho thấy để có hiệu suất thủy phân cao cần hoạt tính chitinase cao ion khoáng phải nồng độ vừa phải 3.3 So sánh hoạt độ hiệu suất thủy phân chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau tối ưu Sau khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B, tiến hành lên men điều kiện trước sau khảo sát bảng 3.1 Bảng Điều kiện lên men chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau khảo sát Các yếu tố ảnh hưởng Trước khảo sát Sau khảo sát Chitin 0,4 % 0,2 % Cao nấm men 1% 1% K2HPO4: KH2PO4 0,4 :0,2 (%) 0,2:0,1(%) MgSO4 0,14 % 0.07 % NaCl 0,1 % 0,1 % KCl 0,1 % 0,1 % CaCl2 0,01 % 0,01% Nồng độ giống 3% 7% Công nghệ sinh học 65 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường pH Thời gian lên men 144h 96h Kết thu thể bảng 3.2 Bảng Hoạt độ hiệu suất TP tương đối chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau khảo sát Trước khảo sát Sau khảo sát Hoạt độ chitinase (U/ml) 0,0230 ± 0,0009 0,0425 ± 0,0077 Hiệu suất TP tương đối (%) 92,77 ± 2,12 100 Kết cho ta thấy hoạt độ chitinase sau tối ưu tăng xấp xỉ 1,85 lần từ 0,023 đến 0,043 U/ml Tuy nhiên hiệu suất thủy phân trước khảo sát thấp % so với sau khảo sát Nguyên nhân điều kiện thủy phân, tỷ lệ E/S chưa thật tối ưu nên chưa đạt hiệu suất thủy phân cao Công nghệ sinh học 66 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong trình làm thí nghiệm chúng tơi rút số kết luận sau; - Đã chọn lọc chủng Penicillium oxalicum 20B chủng Bacillus licheniformis 213, Bacillus licheniformis 23, Penicillium oxalicum 20B, Trichoderma harzianum 34A có hoạt tính chitinase cao - Đã nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp cho q trình sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B môi trường MS-chitin thay đổi yếu tố là: nguồn nito cao nấm men, hàm lượng cao nấm men 1%, hàm lượng chitin 0,2%, tỷ lệ muối K2HPO4:KH2PO4= 0,2:0,1, hàm lượng MgSO4 0,07 % - Đã nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho q trình sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B pH= 5,tỷ lệ cấp giống 7%, thời gian lên men 96h, thời gian nuôi bào tử 72h 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng khác thời gian hoạt hóa, nhiệt độ nuôi cấy, chế độ lắc lên men - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chitinase nguồn ngun liệu khác cua lồi tơm khác với vỏ tôm nghiên cứu - Tiếp tục nghiên cứu kết hợp hai loại endo chitinase hexosaminidase - Xác định loại enzyme tạo chiếm đa số - Chủng cần nghiên cứu tiếp tục để làm tăng hiệu suất để đưa vào ứng dụng thực tiễn Công nghệ sinh học 67 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 Diễn đàn Webtretho, truy cập ngày 28/11-2013, trang web http://www.webtretho.com/forum/register.php Bùi Xuân Đồng Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 154-160; 184-198 Nguyễn Thị Hà, "Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng nấm sợi Penicillium oxalicum sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ đất", Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr 1001-1007 Nguyễn Thị Hà (2012), Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Tạp chí khoa học 2012 : 22b 26- 35 Trường Đại Học Cần Thơ Nguyễn Thị Hà (2012), Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Penicillium citrinum sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Tạp chí khoa học : 27(2013): 32- 39 Trường Đại Học Cần Thơ Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh Đinh Minh Hiệp (2010), Nghiên cứu enzyme chitinase β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới, TP Hồ Chí Minh Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ, Trường ĐHSP Tp HCM Tô Duy Khương (2004), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh Nguyễn Quang Nhân (2011), Nghiên cứu thu nhận, tinh xác định tính chất chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis, Ngành sinh học thực phẩm, trường đại học Cần Thơ Dương Thị Ngọc Quỳnh, Đồng Thị Hương Trầm Lê Thanh Hà (2013), Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin keo thu N- axetyl- D- glucosamine chitinase thô từ Penicillium oxalicum 20B, Hội nghị khoa học công nghệ sinh học tồn quốc 2013., Viện cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Siêu thực phẩm chức (2009), Vuishopping.com, truy cập ngày 28/2/-2014, trang web http://vuishopping.com/n-acetyl-glucosamine-1000mg-giam-dau-khop-gap3-lan-id947.html Đặng Trung Thành (2008), " Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitinase khoai lang (Ipomoea batatas) Khánh Hịa", Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản - số 03/2008 Công nghệ sinh học 68 2012-2014 Luận văn thạc sỹ 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Đặng Thị Hường Lưu thị lệ Thủy Trần Thị Tuyết (2007), Nghiên cứu tận dụng chế phẩm nguyên liệu thủy sản (vỏ tôm, cua )để chiết rút chitin-chitosan sử dụng công nghiệp, Báo cáo đề tài phân viện công nghệ thực phẩm thành phố HCM, Trang 11-16 Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ rừng ngập mặn cần TP Hồ Chí Minh, Trường đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh A Shubakov P.S kucheryavykh (2004), "Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi", Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40(No 5), tr 445-447 Wi SG Chung K-C Lee YG, Lee JC, and Bae H-J, (2009), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704", Protein Expression and Purification 65(2), tr 244-250 N Dahiya, Tewari,R., Tiwari, R P., & Hoondal, G S., (2005), " Production of an antifungal chitinase from Enterobacter sp NRG$ and its application in protoplast production", World Journal of Microbiology and Biotechnology 21(8), tr 16111616 DaizoKoga (2005), " Application of Chitinase in Agriculture", Journal of Metals, Materials and Minerals Vol 15(1), tr 33-36 J Schnurer Frandberg E (1994)), "Chitinolytic properties of Bacillus pabuli K1", J Appl Bacteriol 76((4):361-7) Hearn G M Escott, V M., & Adams, D.J, (1998), Inducible chitinolytic system of Asppergillus fumigatus, Microbiology, Tập 144, 1575 Varlamov I A Stoyachenko, V P., & Davankov, V A, (1994), "Chitinases of Streptoomyces kurssanovii: purification and some properties", Carbohydratte polymers 24(1), tr 47-54 Fujieda I Kawachi, T., Ujita, M., Ishii, Y., Yamagishi, K., Sato, H., et al., (2001), "Purification and properties of extracellular chitinase from the parasitic fungus Isaria japonica", Journal of bioscience and bioengineering 92(6), tr 544-549 Copa Patinõ J Rodriguez, J L., & Pérez Leblic, M I., (1995), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolystates", Letters in applied microbiology 20(1), tr 46-49 Sagal Khalif Alan J.Castle Jennifer L.Guthrie (2005), "An improved method for detection anh quantification of chitinase activities", Canadian Journal of Microbiology Vol.51(Iss 6), tr 491 -495 Mamma K Gkargkas, D., Nedev, G., Topakas, E., Christakopoulos, P., Kekos, D., et al., (2004), "Studies on a N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidase produced by Fusarium oxysporum F3 grown in solid-state fermentation", Process Biochemistry 39(11), tr 1599-1605 Al-Garni K M Ghanem, S M., & Al-Makishah,N H, (2010), "Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus", African Journal of Biotechnology 9(32), tr 5135-5146 Al—Fassi K M Ghanem, F.A., & Farsi, R M., (2011), "Statiscal optimization of cultural condition for chitinase production from shellfish waste by Alternaria alternata", African Journal of Microbiology Research 5(13), tr 1649-1659 Công nghệ sinh học 69 2012-2014 Luận văn thạc sỹ 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Đặng Thị Hường Kim S.H Lee Y.M Kim S.S (1996), "Preparation, Characterization, and Properties of β - chitin and N-acetylated β - chitin", J.Polymer Sci.:Part B: Polymer Physics Vol 34, tr 2367-2374 J A T & panda Kumari (1994), "Intergeneric hybridiazation of Trichoderma reesei QM9414 and Saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion", Enzyme and microbital technology 16(10), tr 870-882 E Lalke-Porczyk M Swiontek-Brzezinska, & Donderski, W , (2007), "Chitinolytic acticity of bacteria and fungi isolated from shirmp exoskeletons", Oceanological and Hydrobiological Studies 3(36), tr 101-111 Di Giambattista M Fenice, R., Raetz, E., Leuba, J L., & Federici, F, (1998), "Repeated-batch and continuous production of chitinolytic enzymes by Penicillium janthinellum immobilised on chemically-modifies macroporous cellulose", Journal of biotechnology 62(2), tr 119-131 Gudelj M H El-Katany, M., Robra, K H., Elnaghy, M A., & Gubitz, G M., (2001), "Characterization of a chitinase and an endo-b-1, 3-glucanase from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii", Applied microbiology and biotechnology 56(1), tr 137-143 & Lopez-Romero M Pedraza-Reyes, E., (1989), "Purification and some properties of two forms of chitinase from myceliial cells of Mucor rouxii", Journal of general microbiology 135(1), tr 211 Tsukiyama M Takahashi, T., & Suzuki, T., (1993), "Purifiication and some properties of chitinase produced by Vibrio sp", Journal of fermentation and bioengineering 75(6), tr 457-459 El-Shayeb M.A Abdel-Naby, N M A., & Sherrief, A A., (1992), "Purification and some properties of chitinase from Aspergillus carneus", Applied biochemistry and biotechnology 37(2), tr 141-154 Tewari N Dahiya, R., & Hoondal, G S., (2006), "Biotechnologicanl aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied microbiology and biotechnology" 71(6), tr 773-782 B P Kapadnis N N Nawani (2005), "Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs", Process Biochemistry 40, tr 651-660 Plikomol N Rattanakit, A., Yano, S., Wakayama, M., & Tachiki, T, (2002), "Utilization of shirmp shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp S1-13: Evaluation of a culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation", Journal of bioscience and bioengineering 93(6), tr 550-556 Yano N Rattanakit, S., Plikomol, A., Wakayama, M., & Tachiki, T., (2007), "Purification of Aspergillus sp S1-13 chitinases and their role in sacchaification of chitin in mash of solid-state culture with shellfish waste", Journal of bioscience and bioengineering 103(6), tr 535-541 Puztahelyi P Binod, T., Nagy, V., Sandhya, C., Szakacs, G., Pocsi, I., et al., (2005), "Production and purification of extracellular chitinase from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solid-state fermentation", Enzyme and microbital technology 36(7), tr 880-887 Công nghệ sinh học 70 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 42 Agrawal P Patidar, D., Banerjee, T., & Patil, S , (2005), "Optimistion of process parameters for chitinase production by soil isolates of Pencillium chrysogenum under solid substrate fermentation", Process Biochemistry 40(9), tr 2962-2967 43 P.Pochanavanich W.Suntornsuk (2002), "Fungal chitosan production and its characterization", Letters in Applied Microbiology 35(17-21) 44 Chandran Sandhya Parameswaran Binod, Pradeep Suma, George Szakacs, Ashok Pandey, (2006), "Fungal biosynthesis of endochitinase and chitobiase in soild state fermentation and thei application for the production of N-acetyl-D-glucosamine from colloidal chitin", Bioresounrce Technology 98(2007), tr 2742-2748 45 & Hwang S L Wang, J R., (2001), "Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of chitinases", Enzyme and microbial technology 28(4-5), tr 376-382 46 Kawada S Murao, T., Itoh, H., Oyama, H., & Shin, T , (1992), "Purification and characterization of a novel type of chitinase from Vibrio alginolyticus TK-22", Bioscience, biotechnology, and biochemistry 56(2), tr 368-369 47 K Shimahara, Y Takiguchi, and Y Nagano, (1992), Degradation pathway of chitin by a thermophilic bacterium, Bacillus licheniformis x-7u Advances in chitin and chitosan, edited by C J Brine, P A Sandford, J P Zikakis, Elsever Science Publishers Ltd England 48 park Y S Lee, I H., Yoo, J S., Chung, S Y., Lee, Y C., Cho,Y S., et al., (2007), "Cloning, purification, and characterization of chitinase from Bacillus sp DAU101", Bioresource technology 98(14), tr 2734-2741 49 Long Y Tao, Z., Xie, J., Jin, H., Ran, H., Tao, K., et al., (2005), "Indentification of a chitinase producing bacterium C4 and histopathologic study on locusts", Pest management science 61(2), tr 159-165 Công nghệ sinh học 71 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường PHỤ LỤC Xây dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamin • Tỷ lệ DNS : mẫu = 2:1 OD 540 nm 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 1.6793x - 0.0386 R² = 0.9992 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ NAG(mg/ml) 1.2 • Tỷ lệ DNS : mẫu = 1:1 1.2 y = 1.2527x + 0.0031 R² = 0.9913 OD 540nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 Nồng độ NAG (mg/ml) 0.8 Hình PL1: Phương trình đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamin Cơng nghệ sinh học 72 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp chitinase PL2: Các chủng cho hoạt độ chitinase cao Chủng giống Chitinase (U/ml) 20B 0,023 ± 0,0002 34A 0,002 ± 0,0006 B.li 23 0,014 ± 0,0001 B.li.213 0,012 ± 0,0005 Các yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện lên men cho trình sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B Bảng PL3: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống tới hoạt độ chitinase hiệu suất TP chủng Penicillium oxalicum 20B Tỷ lệ cấp giống (%) Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối (%) 0,011 ± 0,0021 63,30 ± 5,11 0,013 ± 0,0026 72,13 ± 10,88 0,013 ± 0,0011 72,26 ± 7,74 0,023 ± 0,0016 100 ± 0,0 10 0.020 ± 0,0028 98,73 ± 6,65 Bảng PL4: Ảnh hưởng thời gian lên men tới hoạt độ chitinase hiệu suất TP chủng Penicillium oxalicum 20B Thời gian (ngày) Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối (%) 0,006 ± 0,0017 - 0,1 ± 0,94 0,006 ± 0,0034 35 ± 0,06 Công nghệ sinh học 73 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 0,020 ± 0,002 100 ± 0,0 0,018 ± 0,0004 95,59 ± 2,52 0,018 ± 0,0001 94, 74 ±3,66 0,016 ± 0,0026 94,09 ± 1,22 Bảng PL5: Ảnh hưởng pH môi trường tới hoạt độ chitinase hiệu suất TP chủng Penicillium oxalicum 20B pH ban đầu Sinh khối Hiệu suất TP Chitinase (U/ml) tương đối (%) (g/100ml) 1,03 0,012 ± 0,0002 70,78 ± 5,03 0,98 0,014 ± 0,0011 82,25 ± 11,09 1,07 0,021 ± 0,0012 100 ± 0,0 1,26 0,019 ± 0,0014 97,83 ± 1,11 1,13 0,012 ± 0,0002 92,55 ±2 ,03 Bảng PL6: Ảnh hưởng thời gian nuôi bào tử tới hoạt độ chitinase hiệu suất TP chủng Penicillium oxalicum 20B Thời gian (ngày) Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối (%) 0,005 ± 0,001 87,89 ± 3,18 0,016 ± 0,0016 100 ± 0,0 0,012 ± 0,0001 97,51 ± 4,5 Các yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện dinh dưỡng cho trình sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B Công nghệ sinh học 74 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường Bảng PL7: Ảnh hưởng nguồn nito Nguồn nito Sinh khối Hiệu suất TP Chitinase (U/ml) tương đối (%) (g/100ml) NaNO3 1,52 0,009 ± 0,0016 89,48 ± 3,53 NM + NaNO3 0,94 0,017 ± 0,0005 100 ± 0,0 (NH4)2SO4 1,23 0,006 ± 0,0005 8,56 ± 0,10 (NH4)2SO4 + NM 0,71 0,017 ± 0,0004 87,12 ± 0,099 NM 1,21 0,025 ± 0.0019 95,91 ± 4,76 NaNO3 +(NH4)2SO4 0,8 0,007 ± 0,0014 9,77 ± 0,69 Bảng PL8: Ảnh hưởng hàm lượng nấm men tới hoạt độ chitinase hiệu suất TP chủng Penicillium oxalicum 20B Hàm lượng NM (%) Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối (%) 0,5 0,011 ± 0,0007 56,87 ± 4,65 0,029 ± 0,002 100 ± 0,0 1,5 0,005 ± 0,0025 7,25 ± 1,31 Bảng PL9: Ảnh hưởng hàm lượng chitin tới hoạt độ chitinase hiệu suất TP chủng Penicillium oxalicum 20B Hàm lượng chitin (%) Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối ((%) 0,1 0,023 ± 0,0003 71,18 ±6,18 0,2 0,026 ±0,0024 100 ± 0,0 0,3 0,024 ±0,0018 96,92 ± 2,17 0,4 0,022 ± 0,0034 90,47 ± 9,59 Công nghệ sinh học 75 2012-2014 Luận văn thạc sỹ Đặng Thị Hường 0,5 0,003 ± 0,0006 -16,40 ± 2,65 Bảng PL10: Ảnh hưởng hàm lượng kali photphat Tỷ lệ kali Sinh khối photphat (%) (g/100ml) Ko 0,4 0,015 ± 0,0033 99,87 ± 2,19 0,2:0,1 0,45 0,025 ± 0,0043 100 ± 0,0 0,4:0,2 0,38 0,022 ± 0,0062 95,98 ± 3,45 0,8:0,4 0,31 0,003 ± 0,0048 95,81 ± 0,54 Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối ((%) Bảng PL11: Ảnh hưởng hàm lượng magie sunfat Hàm lượng magie Sinh khối sunfat (%) (g/100ml) Ko 0,41 0,015 ± 0,0005 94,17 ± 1,99 0,07 0,52 0,028 ± 0,0008 100 ± 0,0 0,14 0,47 0,016 ± 0,0005 90,42 ± 3,39 0,28 0,43 0,013 ± 0,0005 90,29 ± 1,11 Công nghệ sinh học Chitinase (U/ml) Hiệu suất TP tương đối ((%) 76 2012-2014 ... đề ti? ?n hành đề tài: “ Tuy? ?n ch? ?n chủng tối ưu điều ki? ?n sinh tồng hợp chitinase ứng dụng cho thu nh? ?n N- acetyl- D-glucosamin” Mục tiêu đề tài: - Lựa ch? ?n chủng có khả sinh tổng hợp chitinase cao... lu? ?n v? ?n với đề tài: “ Tuy? ?n ch? ?n chủng tối ưu điều ki? ?n sinh tổng hợp chitinase ứng dụng cho thu nh? ?n N- acetyl- D-glucosamin” cơng trình nghi? ?n cứu sáng tạo tơi thực hướng d? ?n PGS.TS Lê Thanh... cao - Tối ưu điều ki? ?n sinh tổng hợp chitinase thu nh? ?n N- acetyl- D-glucosamin Nhiệm vụ đề tài: - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase số chủng vi sinh vật Từ ch? ?n chủng có khả sinh tổng hợp cao