TỐI ưu điều KIỆN SINH TỔNG hợp NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP lên MEN CHÌM ở QUY mô PHÒNG THÍ NGHIỆM

Luận văn tốt nghiệp PHẠM THỊ QUỲNH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== PHẠM THỊ QUỲNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHOÁ 2012B Hà Nội – 2014 Phạm Thị Quỳnh i Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Lan Hương - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo suốt trình thực luận văn xin cảm ơn TS Phạm Tuấn Anh giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thí nghiệm Phòng Kỹ thuật lên men, trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học (TTCNSH), thuộc Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu phòng Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014 Học viên Phạm Thị Quỳnh Phạm Thị Quỳnh ii Luận văn tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học mà thân trực tiếp thực Tất số liệu kết thu trình bày khóa luận hoàn toàn khách quan trung thực chưa công bố công trình khác Các tài liệu trích dẫn tác giả liệt kê đầy đủ, không chép tài liệu mà trích dẫn Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014 Học viên Phạm Thị Quỳnh Phạm Thị Quỳnh iii Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Khô đậu tương 1.2 Enzym nattokinase 1.2.1 Lịch sử 1.2.2 Tính chất 1.2.2.1 Cấu trúc 1.2.2.2 Cơ chất Nattokinase 1.2.2.3 Quá trình đông máu hòa tan cục máu 1.2.2.4 Cơ chế tác dụng nattokinase 1.2.3 Vi sinh vật tổng hợp nattokinase 1.3 Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase 1.3.1 Phương pháp lên men bề mặt 1.3.2 Phương pháp lên men chìm 1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men chìm sinh tổng hợp nattokinase 1.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 1.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 1.4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống 1.4.4 Ảnh hưởng pH ban đầu 1.4.5 Ảnh hưởng thời gian lên men 1.5 Kỹ thuật lên men có bổ sung chất (fed-batch) sinh tổng hợp nattokinase 1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase nước PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2.1 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 2.1.3 Hóa chất thiết bị 2.1.3.1 Các loại hóa chất dùng nghiên cứu 2.1.3.2 Các thiết bị sử dụng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt lực nattokinase 2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 2.3 Nội dung nghiên cứu Phạm Thị Quỳnh iv Luận văn tốt nghiệp 2.3.1 Hoạt hóa giống 2.3.2 Khảo sát số điều kiện lên men 2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện lên men quy hoạch thực nghiệm 2.3.4 Lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D thiết bị lên men quy mô PTN 3.1 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp nattokinase từ khô đậu tương 3.1.1 Nồng độ khô đậu tương 3.1.2 Nồng độ glucose bổ sung 3.1.3 Nồng độ pepton bổ sung 3.1.4 pH ban đầu 3.1.5 Thời gian lên men 3.2 Tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase 3.3 Nghiên cứu kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis 3.3.1 Lên men theo mẻ 3.3.2 Lên men theo mẻ có bổ sung chất (fed-batch) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ -TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Tài liệu tiếng Anh DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Số lượng tiêu thụ khô đậu tương Việt Nam [42] -Hình 1.2 Cấu trúc enzym nattokinase -Hình 1.3 Cơ chế tác dụng nattokinase Hình 1.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp nattokinase Hình 1.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp nattokinase Hình 1.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp nattokinase -Hình 1.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp nattokinase -Phạm Thị Quỳnh v Luận văn tốt nghiệp Hình 1.8 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến hoạt lực enzym Hình 1.9 Ảnh hưởng pH đến khả tổng hợp nattokinase Hình 1.10 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase Hình 1.11 Động học trình lên men fed-batch -Hình 2.1 Hệ thống lên men 2L (Biostat B, Sartorius, Đức) -Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ khô đậu tương đến hoạt lực nattokinase Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose bổ sung đến hoạt lực nattokinase Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ pepton bổ sung đến hoạt lực nattokinase Hình 3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt lực nattokinase Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase -Hình 3.6a Ảnh hưởng yếu tố đến hoạt lực nattokinase -Hình 3.6b Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ glucose (A) nồng độ peptone (B) -Hình 3.6c Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ glucose (A) pH (C) -Hình 3.6d Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ pepton (B) pH (C) Hình 3.7 Diễn biến thông số trình lên men theo mẻ Hình 3.8 Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men -Hình 3.9 Hàm lượng đường khử canh trường theo thời gian lên men Hình 3.10 Hoạt lực nattokinase canh trường lên men fed-batch -Hình 3.11 Diễn biến thông số trình lên men fed-batch Phạm Thị Quỳnh vi Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hoá học khô đậu tương Bảng 2.1 Miền biến thiên yếu tố Bảng 3.1 Giá trị mã hóa biến -Bảng 3.2 Ma trận thực nghiệm hoạt lực nattokinase canh trường -Bảng 3.3 Kết phân tích hồi quy Bảng 3.4 Một số điểm tối ưu xung quanh điểm trung tâm - Phạm Thị Quỳnh vii Luận văn tốt nghiệp GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT NK Nattokinase pI Point isoelectric t-PA tissue Plasminogen Activator FU Fibrin degradation unit Tris–HCl Tris (hydroxymethyl) aminomethane TCA Trichloacetic acid Fed–batch Fed–batch fermentation Phạm Thị Quỳnh viii Luận văn tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đột quy hay gọi tai biến mạch máu não (TBMMN) tình trạng bệnh lý biểu triệu chứng thần kinh xảy đột ngột, lý đó, mạch máu não bị bít tắc lại, phía sau vùng bị bít tắc, tế bào thần kinh bị hủy hoại cách nhanh chóng, khoảng phút triệu tế bào [20, 41] Điều tương ứng với tổn thương cục hệ thần kinh trung ương rối loạn tuần hoàn não Hàng năm, giới có khoảng triệu người bị TBMMN, Việt Nam có khoảng 200.000 người mắc – nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu cấp cứu thường gặp chuyên khoa thần kinh Tỉ lệ tử vong đột quỵ đứng hàng thứ sau tai biến tim mạch ung thư Một bệnh nhân bị đột quỵ dù không tử vong bị tàn phế suốt đời trở thành gánh nặng cho gia đình xã hội Những dấu hiệu bệnh thường người biết đến chúng khó để nhận biết biểu biện rõ rệt Chính lẽ đó, việc ngăn ngừa phòng bệnh giúp người thân tránh gặp trường hợp hậu đáng tiếc Quá trình nghiên cứu, sản xuất loại thuốc thực phẩm chức có tác dụng phòng ngừa TBMMN tiến hành nhiều thập niên qua Nattokinase enzym sử dụng nhiều chế phẩm sinh học, loại thực phẩm chức phòng ngừa TBMMN Đây loại enzym có tính an toàn cao, tìm thấy lên men đậu tương, có tác dụng làm tan cục máu đông giúp ngăn ngừa bệnh TBMMN Nattokinase sinh tổng hợp vi khuẩn Bacillus subtilis lên men đậu tương – loại hình lên men có truyền thống lâu đời Đậu tương từ xa xưa biết đến thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid vitamin Từ đậu tương chế biến nhiều sản phẩm giàu dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe Khô đậu tương phụ phẩm trình ép đậu tương thu dầu thường sử dụng làm thức ăn gia súc, nhiên, với hàm lượng protein cao giá thành rẻ so với đậu tương, khô đậu tương phụ phẩm có triển vọng lên men sinh tổng hợp nattokinase Quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase từ B subtilis ngày nghiên cứu hoàn thiện Hiện có phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase sử dụng Phương pháp lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, không đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị cao có nhược điểm khó khống chế điều kiện vô trùng tuyệt đối phòng lên men triển khai quy mô sản xuất Bên cạnh phương pháp lên men bề mặt, lên men chìm tiến hành nghiên cứu Ưu điểm bật công nghệ dễ dàng tự động hóa điều khiển trình lên men triển khai quy mô công nghiệp Công nghệ cho phép trình thu hồi enzym dễ dàng so với lên men bề mặt Với định hướng tận dụng nâng cao giá trị khô đậu tương sử dụng nguyên liệu làm nguồn chất cho lên men sinh tổng hợp nattokinase theo phương pháp lên men chìm Để làm chủ trình lên men quy mô phòng thí nghiệm tham gia nghiên cứu đề tài: “Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp nattokinase theo phương pháp lên men chìm quy mô phòng thí nghiệm” Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm: Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp nattokinase từ khô đậu tương Tối ưu điều kiện lên men chìm quy mô phòng thí nghiệm Lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Khô đậu tương Khô đậu tương, phụ phẩm trình ép dầu từ đậu tương Hầu hết khô đậu tương sản xuất nước nhập sử dụng ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi thủy sản Năm 2013, lượng tiêu thụ khô đậu tương ước tính 3,8 triệu tấn, tăng 7% so với vụ trước [42] Hình 1.1 Số lượng tiêu thụ khô đậu tương Việt Nam [42] Dù bắt đầu sản xuất khô đậu tương quy mô công nghiệp từ năm 2011, lượng khô đậu tương sử dụng nước ta phải nhập Ba triệu khô đậu tương nhập năm 2012-2013, tăng 13% so với kì năm trước Theo ước tính lượng khô đậu tương tiêu thụ nước ta tiếp tục tăng năm [42] Hiện khô đậu tương sản xuất phương pháp Phương pháp thứ chiết rút chất béo dung môi hexane Hạt đậu tương thường bỏ vỏ, hấp chín nước nóng cán thành mảnh dẹt, sau ngâm dung môi hexane để chiết rút dầu đậu tương Sau bã đậu tương ép xử lý nhiệt để loại bỏ hexane goi khô đậu tương Phương pháp coi phương pháp đại sử dụng rộng rãi nước tiên tiến Khô đậu tương sản xuất theo phương pháp có hàm lượng protein cao (46-48%) hàm lượng chất béo lại thấp (1%) Phương pháp thứ ép dầu phương pháp học Đậu tương hấp chín, nghiền nhỏ ép dầu thiết bị học Nhưng phương pháp ép dầu học tỷ lệ dầu thu thường không cao, lượng chất béo lại khô dầu tới 7-10% Từ năm 2011, hai nhà máy nghiền công nghiệp bắt đầu hoạt động làm thay đổi mạnh mẽ ngành hạt có dầu chăn nuôi gia súc Việt Nam Sản lượng khô đậu tương nước tiếp tục thay lượng đáng kể khô đậu tương nhập khẩu, ước tính đạt 732 nghìn năm 2013, giảm 6% so với năm 2012 [42] Thành phần hóa học khô đậu tương bảng 1.1 cho thấy hàm lượng protein khô đậu tương cao, hàm lượng chất béo thấp, bên cạnh giá thành 1/3 -1/2 lần so với giá thành đậu tương Chính khô đậu tương thay cho đậu tương số ứng dụng công nghiệp, đặc biệt thay đậu tương sử dụng làm môi trường lên men cho vi sinh vật Bảng 1.1 Thành phần hoá học khô đậu tương 10 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp kiểm tra có nghĩa hệ số tương thích mô hình thực nghiệm biểu diễn bảng 3.3 Sự có nghĩa mô hình hệ số hồi quy kiểm định chuẩn F giá trị p tương ứng nhỏ 0,05 Bảng 3.3 Kết phân tích hồi quy Thông số Mô hình A B C AB AC BC A2 B2 C2 Phương sai 5075,45 56,84 42,76 535,43 62,94 77,63 76,63 534,11 306,97 3834,02 Chuẩn F 183,74 18,52 13,93 174,46 20,51 25,29 24,97 174,02 100,02 1249,21 Mức có nghĩa prob (p) > F < 0,0001 0,0016 0,0039 < 0,0001 0,0011 0,0005 0,0005 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 Bảng phân tích hồi quy (bảng 3.3) cho biết chuẩn F mô hình 183,74 mức có nghĩa mô hình nhỏ 0,0001 điều có nghĩa mức độ tin cậy mô hình 99% Trong mô hình này, tất thông số có nghĩa Hệ số tương quan bội mô hình R2 0,994 cho thấy mô hình tương thích sát với thực nghiệm Chương trình quy hoạch thực nghiệm đưa phương trình bậc thể mối liên hệ yếu tố đầu vào hoạt lực nattokinase sau lên men (Y) Y = 79,52 + 2,04A – 1,77B + 6,26C + 2,81AB -3,12AC -3,10BC – 6,09A2 – 4,62B2 – 16,31C2 Sự ảnh hưởng yếu tố đến hoạt lực nattokinase sau lên men thể rõ nét qua hình 3.6a Hình 3.6a Ảnh hưởng yếu tố đến hoạt lực nattokinase Theo hình 3.6a, yếu tố C (pH ban đầu) có ảnh hưởng nhiều đến hoạt lực nattokinase, sau đến yếu tố A (nồng độ glucose), điều hoàn toàn hợp lý giá trị p yếu tố C nhỏ nhất, tiếp đố yếu tố A Nồng độ pepton (yếu tố B) ảnh hưởng không nhiều đến hoạt lực nattokinase Độ lêch trung bình 29 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp Cố định yếu tố cho hai yếu tố lại thay đổi khoảng cận chúng, ta thu hình ảnh không gian chiều bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase đường đồng mức Vùng màu đỏ bề mặt đáp ứng vùng mà cho giá trị hoạt lực nattokinase cao cả, vùng giá trị thấp nằm rìa có màu vàng, vàng nhạt, xanh (hình 3.6b, 3.6c, 3.6d) Hình 3.6b Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ glucose (A) nồng độ peptone (B) Hình 3.6c Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ glucose (A) pH (C) 30 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.6d Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ pepton (B) pH (C) Nhìn vào hình đồng mức ta thấy pH = 7,5 giá trị hoạt lực nattokinase cao nằm vùng có hàm lượng glucose bổ sung 1,2 ÷ 1,8%, pepton bổ sung 1,0 ÷1,8% Như vậy, kết phân tích đường đồng mức bề mặt đáp ứng cho thấy, hoạt lực nattokinase đạt giá trị cao 80,40 FU/ml điểm có pH = 7,76, hàm lượng glucose bổ sung 1,5%, hàm lượng pepton bổ sung 1,36% Phần mềm đưa số điểm tối ưu khác cho trình sinh tổng hợp nattokinase, điểm đưa bảng 3.4 Bảng 3.4 Một số điểm tối ưu xung quanh điểm trung tâm TT 10 Glucose (%wt/v) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,45 1,55 1,63 1,55 1,59 Pepton (%wt/v) 1,5 1,4 1,36 1,25 1,18 1,50 1,50 1,50 1,48 1,40 pH 7,5 8,1 7,76 7,59 7,87 7,65 7,81 7,59 7,50 7,50 Hoạt lực nattokinase (FU/ml) 79,55 79,83 80,40 79,65 79,79 79,75 80,20 79,79 79,72 79,75 Theo kết bảng 3.4 có nhiều phương án lựa chọn điểm tối ưu, nhiên để dễ dàng điều chỉnh thông số tiến hành thí nghiệm, lựa chọn phương án có nồng độ glucose 1,5%, nồng độ pepton 15% pH ban đầu 7,5 phương án tối ưu Hoạt lực nattokinase xác định theo mô hình 79,55FU/ml Kết hoàn toàn tương thích với kết kiểm tra lại thực nghiệm điểm tối ưu Trong nghiên cứu Deepak cộng (2008) tối ưu thành phần môi trường sinh tổng hợp nattokinase bình tam giác chủng B subtilis phương pháp bề mặt đáp ứng sau: pH môi trường 7,5; hàm lượng glucose 1%; pepton 5,5%; MgSO4 0,2%; CaCl2 0,5%; hoạt lực nattokinase điểm tối ưu cao gấp lần so với trước tối ưu [14] 3.3 Nghiên cứu kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase chủng 31 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp B subtilis Với mong muốn nâng cao quy mô lên men hoạt lực nattokinase canh trường sau lên men, tiến hành lên men thiết bị lên men (2L 10L) sử dụng kỹ thuật lên men theo mẻ lên men có bổ sung chất nhằm lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp cho sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D 3.3.1 Lên men theo mẻ Quá trình lên men thực thiết bị lên men 2L với thể tích môi trường lít Các điều kiện sử dụng tối ưu quy mô bình tam giác, nhiên có sử dụng cánh khuấy bơm nén không khí vào suốt trình lên men để trì hàm lượng oxy hòa tan đạt 30% Diễn biến trình lên men thể hình 3.7 Hình 3.7 Diễn biến thông số trình lên men theo mẻ thiết bị lên men 2L Theo hình 3.7 cho thấy pH trì suốt trình lên men 7,5, việc dung dịch HCl 2N tự động bơm vào thiết bị lên men sau 7h lên men Hàm lượng oxy hòa tan canh trường (pO2) giảm nhanh sau 5h lên men, hàm lượng oxy hòa tan canh trường thiết bị tự động tăng khuấy trộn từ 200 rpm đến 800 rpm khoảng thời gian lên men từ 5-18h Dựa vào biến động hàm lượng oxy hòa tan cho thấy, khoảng thời gian bắt đầu lên men chủng vi khuẩn sử dụng oxy cho phát triển sinh khối, sau 5h lên men lượng oxy cung cấp vào canh trường sử dụng hết Sau 18 lên men chủng vi khuẩn phát triển chậm lại, hàm lượng pO2 canh trường dễ dàng khống chế 30% thiết bị lên men Sau 34h lên men hàm lượng oxy hòa tan canh trường có xu hướng tăng lên 40% Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men thể hình sau 32 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.8 Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men Hoạt lực nattokinase có xu hướng tăng dần sau 12 lên men đạt cực đại sau 24 lên men với hoạt lực nattokinase 112,17 FU/ml Các lên men dù chủng có phát triển mạnh (thể qua lượng axít bổ sung liên tục vào bình lên men để đưa pH canh trường pH 7,5 hàm lượng oxy hòa tan trở 0) hoạt lực nattokinase giảm nhẹ sau 24 lên men Như thấy lên men theo mẻ thiết bị lên men 2L hoạt lực nattokinase canh trường cao so với lên men bình tam giác 1,4 l ần, ều cho th vi ệc trì pH 7,5 hàm lượng oxy hòa tan canh trường lên men 30% suốt trình lên men yếu tố làm tăng hoạt lực nattokinase thu nh ận Hàm lượng đường khử canh trường theo thời gian lên men xác định hình 3.9 Hình 3.9 Hàm lượng đường khử canh trường theo thời gian lên men Theo kết hình 3.9 cho thấy, hàm lượng đường khử giảm nhanh 6h đầu trình lên men (từ 14,94 xuống 5,24 g/L), tiếp tục giảm chậm sau 6h không đổi từ 12- 24h lên men (2,17- 1,99 g/L), sau 30h lên men hàm lượng đường khử giảm đáng kể 33 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp 0,84 g/L Như thấy 12h đầu giai đoạn vi khuẩn phát triển sinh khối mạnh mẽ, từ 12-24h lên men giai đoạn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzym, đến 30h lên men hàm lượng đường khử giảm đáng kể nguyên nhân làm cho hoạt lực nattokinase giảm so với hoạt lực nattokinase sau 24h lên men Từ kết hoạt lực nattokinase hàm lượng đường khử canh trường cho thấy nên trì hàm lượng đường canh trường nồng độ định chủng vi khuẩn tiếp tục tăng sinh khối kéo dài thời gian sinh tổng hợp nattokinase Vì sử dụng kỹ thuật lên men fed-batch với việc trì pH lên men 7,5 dung dịch đường glucose (15%) 3.3.2 Lên men theo mẻ có bổ sung chất (fed-batch) Đã tiến hành lên men fed-batch thiết bị lên men 2L, diễn biến trình lên men cho kết tương tự lên men theo mẻ (hình 3.7), nhiên lượng dịch đường bổ sung vào thiết bị lên men gấp khoảng 7,5 lần so với sử dụng axít để trì pH 7,5 (xem hình – phụ lục) Hoạt lực nattokinase dịch canh trường theo thời gian lên men biểu diễn hình 3.10 Hình 3.10 Hoạt lực nattokinase canh trường lên men fed-batch theo thời gian lên men Kết hình 3.10 cho thấy hoạt lực nattokinase canh trường lên men tăng từ thứ đến thứ 24, sau tăng mạnh đạt cực đại sau 30 lên men Như thấy tiến hành bổ sung glucose vào trình lên men, hoạt lực nattokinase tăng mạnh, đồng thời thời gian đạt cực đại kéo dài so với lên men theo mẻ (từ 24 lên 30 giờ), hoạt lưc nattokinase đạt cực đại cao gấp 3,8 lần so với hoạt lực nattokinase lên men theo mẻ Sau 30 lên men hoạt lực nattokinase canh trường lại có xu hướng giảm Để khẳng định khả nâng cao hoạt lực nattokinase canh trường sử dụng kỹ thuật lên men có bổ sung chất, tiếp tục tăng quy mô lên men từ lít (trong thiết bị lên men 2L) lên quy mô lít (trong thiết bị lên men 10 L) Diễn biến thông số trình lên men fed – batch thiết bị lên men 10 L thể hình sau 34 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.11 Diễn biến thông số trình lên men fed-batch thiết bị lên men 10L Hình 3.11 cho ta thấy, đầu trình lên men tiến hành lên men theo mẻ, thứ 5, pH canh trường giảm xuống pH 7, bơm tự động bật đưa dung dịch glucose vào thiết bị lên men để trì ổn định pH 7,5 Do lượng đường glucose bổ sung nên chủng vi khuẩn phát triển mạnh, pO2 trì mức sau 20 lên men, sau chủng vi khuẩn phát triển chậm lại, thể hàm lượng oxy hòa tan tăng lên 5-15%, trí có lúc tăng đến 40% sau 33 lên men Lượng glucose bổ sung vào thể tích dịch canh trường lên men tương tự lên men fed-batch quy mô 2L, nhiên thời gian bổ sung chất sớm so với lên men quy mô 2L Bước đầu thấy chủng vi khuẩn phát triển tốt quy mô lít /mẻ Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men thể hình 3.10 Như vậy, tăng quy mô lên men từ lít tới lít, hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men khác tương đồng Ở quy mô lít/mẻ, hoạt lực nattokinase đạt cực đại sau 30 lên men 431±8,5FU/ml Kết nghiên cứu với với hàm lượng bột khô đậu tương 15%, glucose 1,5%, peptone 1,5% trình lên men có bổ sung chất (glucose 15%) cho hoạt lực nattokinase cao gấp 3,8 lần so với hoạt lực nattokinase thu lên men theo mẻ Vì kỹ thuật lên men có bổ sung chất để trì pH 7,5 kỹ thuật phù hợp cho lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D Trong nghiên cứu Cho cộng (2010) sử dụng kỹ thuật lên men có bổ sung chất để ổn định pH 7,0, môi trường khô đậu tương chủng B subtilus, hoạt lực nattokinase thu tăng 2,1 lần so với lên men theo mẻ [12] Kwon cộng (2011) sử dụng lên men có bổ sung chất glucose pepton đồng thời đưa vào canh trường lên men với tỉ lệ thay đổi từ 0,2 đến g glucose/g pepton Tác giả nhận thấy tỉ lệ 0,33 glucose pepton cung cấp vào canh trường lên men để trì pH 7,0 hoạt lực nattokinase thu tăng 4,3 lần so với hoạt lực lên men theo mẻ [19] Năm 2012, Unrean cộng sử dụng phương pháp bổ sung chất để lên men chủng B subtilis K-C3, glycerol đưa vào môi trường theo hàm số mũ, hoạt lực nattokinase thu tăng 20 lần so với trình lên men theo mẻ [38] 35 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Khô đậu tương sử dụng làm nguyên liệu cho lên men chìm sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis D Đã khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp nattokinase Đã tối ưu điều kiện lên men quy hoạch thực nghiệm cho thấy quy mô bình tam giác (50 ml canh trường/ thể tích bình 250 ml), hàm lượng khô đậu sử dụng 15%, glucose bổ sung 1,5%, pepton bổ sung 1,5% pH ban đầu 7,5 hoạt lực nattokinase canh trường đạt cực đại 79,55 FU/ml Đã lên men theo mẻ thiết bị lên men 2L với điều kiện tối ưu đồng thời trì pH lên men 7,5 hàm lượng oxy hòa tan (pO 2) 30% Hoạt lực nattokinase canh trường đạt cực đại 112 ±2,4FU/ml sau 24 h lên men Khi thực lên men có bổ sung chất sử dụng glucose 15% cấp vào thiết bị lên men theo phương pháp lên men ổn định pH 7,5 cho hoạt lực nattokinase cao gấp 3,8 lần so với lên men theo mẻ Kỹ thuật lên men có bổ sung chất kỹ thuật phù hợp cho lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D Kiến nghị Tiếp tục hoàn thiện công nghệ lên men sinh tổng hợp nattokinase quy mô pilot 36 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thu Hương (2006), Nghiên cứu đặc điểm enzyme fibrinase sinh chủng Bacillus subtilis NT5 quy trình thu hồi Luận văn thạc sĩ khoa học; Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Lan Hương, Hà Thị Phương, Phạm Quốc Luân (2011) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzym nattokinase từ số thực phẩm đậu tương lên men Tạp chí khoa học & công nghệ trường đại học kỹ thuật, 81, 175179 Nguyen Thi Hong Ngan, Nguyen Lan Huong (2011) Factors affecting on nattokinase production by isolates from fermented soybean products Tạp chí Khoa học Công nghệ, 49 (1A) Nguyễn Lan Hương, Phạm Tuấn Anh, Lã Thị Quỳnh Như, Dương Văn Hà, Tô Kim Anh (2013) Nâng cao khả sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis phương pháp lên men fed-batch Tạp chí khoa học công nghệ trường đại học kỹ thuật 92: 147-151 Nguyễn Lan Hương (2014) Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm nattokinase làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc thực phẩm chức Báo cáo tổng kêt dự án sản xuất thử nghiệm cấp Bộ Giáo dục Đào tạo Lê Thị Bích Phương, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012) Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase Tạp chí sinh học 34(3se), 99 - 104 Tài liệu tiếng Anh Al-Juamily E F., Al-Zaidy B H (2012), Optimizitation conditions of production fibrinolytic enzym from Bacillus lichniformis B4 local isolate British Journal of Pharmacology and Toxicology, 3(6), 289 - 295 Banaszkiewicz T (2011), Soybean and nutrition Siedlce University, Natural Faculty, Poland, 1, Chang C.T., Wang P.M., Hung Y.F., Chung Y.C., (2012), Purification and biochemical properties of a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis-fermented red 37 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp bean Food Chemistry, 133, 1611 - 1617 10 Chen P T , Chiang C J., Chao Y P., (2007), Medium optimization for the production of recombinant nattokinase by Bacillus subtilis using response surface methodology Biotechnol Prog., 23(6):1327-1332 11 Chen P.T., Chao Y P, (2006), Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors Biotechnol Lett, 28(19):15951600 12 Cho Y H., Song J Y., Kim K M., Kim M K., Lee I Y., Kim S B., Kim H S., Han N S., Lee B H., Kim B S., Production of nattokinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis N Biotechnol 2010, 27(4):341-346 13 Collen D., Lijnen H.R (1991), Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombosis Blood, 78, 3114 - 3124 14 Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu S.V., Senthilkumar S R , Sangiliyandi G., (2008), Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology Bioresour Technol, 99(17):8170-8174 15 Fujita M., Hong K., Ito Y., Fujii R., Kariya K., Nishimuro S., (1995), Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat Bio Pharm Bull, 10, 1387 - 1391 16 Hahn B.S., Cho S.J., Wu I.M., Chang K.H., Beak Y.C., Halkier T., (1991), Mechanisms in blood coagulation, fibrinolysis and the complement system Cambridge university press, 13, 978 - 980 17 Kim W., Choi K., Park H., Choi J., Lee Y., (1996), Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Applied and Environmental, Microbiology, 62, 2482 - 2488 18 Ku T.W., Tsai R.L., Pan T.M., (2009), A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto J Agric Food Chem, 57(1), 292 - 298 19 Kwon E.Y., Kim K.M., Kim M.K., Lee I.Y., Kim B.S., (2011), Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis Bioprocess and Biosystems Engineering, 34(7), 789 - 793 20 Lawrence R., Wechsler M.D (2004), Stem cell transplantation for stroke Cleveland clinic journal of medicine, 71(1), 40 - 41 38 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp 21 Li H L., Jun L., Feng Z.U., Zhi Y.W., (2011), Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Nattokinase Chemistry & Bioengineering, 01 22 Liu J.G., Xing J.M., Ma Z., Liu H., (2005), Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods Process biochemistry, 40, 2757 - 2762 23 Liu J.G., Xing J.M., Shen R., Yang C.L., Liu H.Z., (2004), Reverse micelles extraction of nattokinase from fermentation broth Biochemical Engineering Journal 21, 273 - 278 24 Long L.U et al (2011), Studies on Conditions for Solid and Liquid Fermentation of Natto Journal of Anhui Agricultural Sciences, 26 25 Manhajan P M., Gokhale S V., Lele S S., Production of Nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: media optimization, sacle up kinetic modling Food Sci Biotechnol 2010, 19(6):1593-1603 26 Meruvu H., Vangalapati M (2011), Nattokinase: A Review on Fibrionlytic Enzyme Internationl Journal of Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1), 61 - 66 27 Mine Y., Wong A.H.K., Jiang B., (2005), Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods Food research international, 38, 243 - 250 28 Patrick P.S., Antonios G.M (2010), Fibrin glue as a drug delivery system Journal of Controlled Release, 148, 49 - 55 29 Peng Y., Huang Q., Zhang R., (2003), Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amiloliquefaciens DC-4 screened from douche, a traditional Chinese soybean food Chomparative biochemistry and physiology part, 134, 45 - 52 30 Peng, Y., X Yang, and Y Zhang, (2005), Microbial fibrinolytic enzim: an overview of source, production, properties, and thrombolytic in vivo, Microbiol Biotechnol, 69, 126 – 132 31 Samruan W., Oonsivilai A., Onsivilai R., (2012), Soybean and fermented soybean extract antioxidant activities World academy of science, engineering and technology, 72, 1135 - 1138 32 Saxena R., Singh R (2010), Statistical optimization of conditions for protease production from Bacillus sp Acta Biologica szegediensis, 54(2), 135 - 141 33 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H., (1990), Enhancement of the 39 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nttokinase Acta Haematl, 3, 139 - 143 34 Swick R.A (2002), Soybean meal quality The Advocate, 48 35 Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G., (2009), Purification and Characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12 Journal of agricultural and food chemistry article, 57, 9722 - 9729 36 Wang J K., Chiu H H., Hsieh C S., (2009), Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhace nattokinase activity Food in J health Sci 1(1), 21 - 27 37 Wang S.L., Wu Y.Y., Liang T.W., (2011), Purification and biochemical characterization of a nattokinase by conversion of shrimp shell with Bacillus subtilis TKU007 N Biotechnol, 28(2), 196 - 202 38 Zhou F Z., Jia Y L., Chen G C., Xie B E., Wang H.Y., (2008), Study on strains selection and liquid fermentation conditions of fibrinolytic enzyme Henan Science, 39 Unrean P., Nguyen H A N., Visessanguan W., and P Kitsubun, (2012), Improvement of nattokinase production by Bacillus subtilis K-C3 using an exponential feeding fed-batch strategy KKU Res J., 17(5), 769-777 Tài liệu internet 40 World Health Organization (2012), Steps stroke manual http://www.who.int/ncd_surveillance/en/steps_stroke_manual_v1.2.pdf, 1(2) 41 www.stroke.org (2010), Stroke 101 fact sheet 42 http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/4289-nganh-hang-kho-du-u-tng-vit-nam2014-va-d-bao.html 40 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC Bảng Giá trị OD dung dịch tyzosine nồng độ khác Nồng độ tyzosine (µg/ml) 10 Giá trị OD670nm 0,030 0,057 0,069 0,086 0,107 0,123 0,140 0,171 0,181 0,193 Hình Đồ thị đường chuần nồng độ tyrosine y = Giá trị độ hấp thụ ánh sáng bước 275 nm x = nồng độ tyrosine Bảng Thành phần hỗn hợp phản ứng DNS 41 Nồng độ glucose (mg/L) Thể tích glucose g/L (ml) Thể tích nước (ml) Thể tích DNS (µl) 0,2 100 900 600 0,4 200 800 600 Phạm Thị Quỳnh A540 0.324 0.504 Luận văn tốt nghiệp 0,6 300 700 600 0.704 0,8 400 600 600 0.902 1,0 500 500 600 1.117 1,2 600 400 600 1.373 1,4 700 300 600 1.549 1,6 800 200 600 1.859 Hình Đồ thị đường chuần nồng độ glucose y = Giá trị độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 540 nm x = nồng độ glucose 42 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp Hình Sự biến thiên thông số trình lên men fed-batch thiết bị lên men 2L 43 Phạm Thị Quỳnh [...]... cứu của Al-Juamily và cộng sự (2012) khi lên men với chủng B lichniformis B4 hay của Long và cộng sự (2011) lên men với chủng Bacillus nato BN4 cho thấy thời gian lên men thích hợp sinh tổng hợp nattokinase là 48h 3.2 Tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase Để có thể lựa chọn điều kiện tối ưu cho lên men sinh tổng hợp nattokinase ở quy mô phòng thí nghiệm, các yếu tố được lựa chọn để nghiên... dần ở các ngày tiếp theo 1.5 Kỹ thuật lên men có bổ sung cơ chất (fed-batch) trong sinh tổng hợp nattokinase 18 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp Bên cạnh những phương pháp tối ưu điều kiện môi trường theo quy hoạch thực nghiệm, một số nghiên cứu đã đi theo hướng lựa chọn kỹ thuật lên men Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) là phương thức lên men trung gian giữa lên men theo mẻ và lên men. .. 2.3.4 Lên men sinh tổng hợp nattokinase của chủng B subtilis D trong thiết bị lên men quy mô PTN  Lên men theo mẻ trên thiết bị lên men 2L Quá trình lên men theo mẻ được thực hiện trong hệ thống lên men 2L (hình 2.1) với 1L môi trường lên men Giống được cấp 10% so với thể tích dịch lên men Hình 2.1 Hệ thống lên men 2L (Biostat B, Sartorius, Đức) Các thông số được điều kiển như sau: nhiệt độ lên men. .. với lên men ở quy mô 2L Bước đầu có thể thấy chủng vi khuẩn phát triển tốt ở quy mô 6 lít /mẻ Hoạt lực nattokinase trong canh trường theo thời gian lên men được thể hiện ở hình 3.10 Như vậy, khi tăng quy mô lên men từ 1 lít tới 6 lít, hoạt lực nattokinase trong canh trường theo các thời gian lên men khác nhau là khá tương đồng Ở quy mô 6 lít/mẻ, hoạt lực nattokinase đạt cực đại sau 30 giờ lên men là... hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng 1.3 Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase Để thu nhận được nattokinase, người ta thường sử dụng hai phương pháp lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm, mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm khác nhau 1.3.1 Phương pháp lên men bề mặt Samruan và công sự (2012) lên men rắn đậu tương Đậu tương được rửa sạch và làm ẩm bằng cách ngâm trong... phù hợp sinh tổng hợp nattokinase của chủng 31 Phạm Thị Quỳnh Luận văn tốt nghiệp B subtilis Với mong muốn nâng cao quy mô lên men và hoạt lực nattokinase trong canh trường sau lên men, chúng tôi đã tiến hành lên men trong các thiết bị lên men (2L và 10L) và sử dụng kỹ thuật lên men theo mẻ và lên men có bổ sung cơ chất nhằm có thể lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp cho sinh tổng hợp nattokinase của chủng... thấy pH thích hợp nhất để vi khuẩn B lichniformis B4 tổng hợp NK cho hoạt lực cao là pH = 7,2 3.1.5 Thời gian lên men Với mong muốn xác định thời gian lên men thích hợp khi tiến hành lên men ở quy mô phòng thí nghiệm trong các bình tam giác (250ml) với 50 ml môi trường, đã tiến hành lên men trong thời gian 1 – 4 ngày Hoạt lực nattokinase của canh trường sau mỗi ngày lên men được biểu diễn ở hình 3.5... điểm tối ưu Trong một nghiên cứu của Deepak và cộng sự (2008) đã tối ưu thành phần môi trường sinh tổng hợp nattokinase ở bình tam giác bởi chủng B subtilis bằng phương pháp bề mặt đáp ứng như sau: pH môi trường 7,5; hàm lượng glucose 1%; pepton 5,5%; MgSO4 0,2%; và CaCl2 0,5%; hoạt lực nattokinase tại điểm tối ưu cao gấp 2 lần so với trước khi tối ưu [14] 3.3 Nghiên cứu kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng. .. liệu cho lên men chìm sinh tổng hợp nattokinase của chủng Bacillus subtilis D Đã khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp nattokinase 2 Đã tối ưu điều kiện lên men bằng quy hoạch thực nghiệm cho thấy ở quy mô bình tam giác (50 ml canh trường/ thể tích bình 250 ml), hàm lượng khô đậu sử dụng là 15%, glucose bổ sung 1,5%, pepton bổ sung 1,5% và pH ban đầu 7,5 thì hoạt lực nattokinase. .. 79,55 FU/ml 3 Đã lên men theo mẻ trên thiết bị lên men 2L với các điều kiện tối ưu như trên đồng thời duy trì pH lên men là 7,5 và hàm lượng oxy hòa tan (pO 2) 30% Hoạt lực nattokinase trong canh trường đạt cực đại 112 ±2,4FU/ml sau 24 h lên men Khi thực hiện lên men có bổ sung cơ chất sử dụng glucose 15% cấp vào thiết bị lên men theo phương pháp lên men ổn định pH 7,5 đã cho hoạt lực nattokinase cao