Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp CELLULASE từ vi khuẩn ruột mối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HIỀN TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thanh Hà Trưởng môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt thời gian qua Trong q trình thực đề tài, tơi nhận bảo chun mơn nhiệt tình thầy cô giáo môn Công nghệ Sinh học, động viên tinh thần tập thể cán nghiên cứu phịng thí nghiệm mơn, cán Trung tâm Sinh học Thực nghiệm Nhân dịp hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giúp đỡ quý báu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến người thân gia đình bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập làm việc vừaqua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2016 Nguyễn Thị Hiền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc thực đề tài cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồngốc Ký tên Nguyễn Thị Hiền MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulase 1.1.1 Phân loại enzyme cellulase 1.1.2 Nguồn thu nhận cellulase 1.1.3 Cơ chất cellulose 1.1.4 Cơ chế thủy phân cellulose 1.1.5Ứng dụng enzyme cellulase 1.2Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase từ ruột mối 11 1.2.1 Cấu tạo ruột mối hệ vi sinh vật ruột mối 11 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột mối 14 1.3.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 17 1.3.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến hoạt độ enzyme 20 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.1.1 Chủng vi khuẩn nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Môi trường muôi cấy 22 2.1.4 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 23 2.2Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 24 2.2.2Phương pháp thu enzyme thô 24 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase [27] 24 2.2.5 Bố trí thí nghiệm 27 2.3 Phân tích thống kê 29 3.1 Tối ưu hóa mơi trường lên men sinh tổng hợp cellulase chủng Bacillus subtilis G4 30 3.1.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 30 3.1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon 31 3.1.3 Ảnh hưởng nồng độ cacbon 32 3.1.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ 33 3.1.5 Ảnh hưởng nồng độ nitơ 34 3.2 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy 35 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 35 3.2.2Ảnh hưởng pH 36 3.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 37 3.3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc 38 3.3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 39 3.3 Nghiên cứu động thái trình lên men chủng Bacillus subtilis G4 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Sự xếp chuỗi cellulose thành tế bào thực vật [5] Hình 1.2 Hệ enzyme cellulase tham gia vào trình thủy phân sợi cellulose [46] Hình 1.3 Sơ đồ phân loại mối, số số lượng giống/loài họ mối khác [7] 11 Hình 1.4 Cấu tạo ruột mối, gồm có ruột trước (foregut), ruột (midgut) ruột sau (hindgut) [54] 12 Hình 3.1 A- Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ CMCase, B - Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng pH chủng G4 30 Hình 3.2 A- Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase; B - Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng pH 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến pH sinh trưởng G4 33 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ nitơ đên hoạt độ CMCase 34 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến hoạt độ CMCase 35 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ CMCase 36 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ CMCase 39 Hình 3.8 Hoạt độ enzyme FPU trước sau tối ưu 40 Hình 3.9 Động thái lên men chủng Bacillus subtilis G4 40 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Lớp Bacilli phân lập từ ruột mối [35] 15 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ cám gạo đến hoạt độ CMCase 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase 33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến hoạt độ CMCase 37 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ CMCase 38 DANH MỤC VIẾT TẮT CFU: Colony Forming Unit CMCase: Carboxymethyl Cellulase FPU: Filter Paper Units rpm: revolutions per minute MỞ ĐẦU Việt Nam nước nông nghiệp với khối lượng phế phụ phẩm nơng nghiệp rơm, rạ, bã mía ước tính năm lên đến 80 - 100 triệu Cellulose từ phế phụ phẩm nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất lượng tái sinh Tuy nhiên, nguồn sinh khối lớn nông dân xử lý cách đốt, gây lãng phí lớn nguồn sinh khối có sẵn cịn ảnh hưởng tiêu cực đến mơi trường sống [16] Vì vậy, việc chuyển hóa chúng thành cồn chất có giá trị khác khơng có ý nghĩa lớn việc bảo vệ môi trường sống mà cịn góp phần giải nhu cầu lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập chỗ cho nông dân Ưu điểm cồn sinh học hệ thứ hai hay hệ (được sản xuất từ nguồn lignocellulose phế phụ phẩm nông lâm nghiệp) bền vững, không gây ảnh hưởng tới an ninh lương thực cồn sinh học hệ thứ (được sản xuất từ việc lên men dịch đường tinhbột) Mối nhóm trùng sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn để sinh sống phát triển Sở dĩ nhóm trùng thủy phân gỗ nhờ hệ vi sinh vật cộng sinh đường ruột chúng, trình phát triển chúng sinh hệ enzym cellulase để thủy phân thành phần gỗ cellulose, hemicellulose thành loại đường thành phần có phân tử lượng thấp làm nguồn thức ăn Theo Ohkuma (2003), mối có khả tiêu hóa 74 - 99% cellulose 65 - 87% hemicellulose.Mốiđóng vai trị sinh thái quan trọng trình phân giải cellulose từ thực vật nhờ hỗ trợ tích cực nhóm vi sinh vật cộng sinh ruột mối Nhóm vi sinh vật có khả tiết enzym thủy phân cellulose hiệu Do đó, hệ vi sinh vật ruột mối coi nguồn dự trữ phong phú đa dạng enzym tham gia vào phân hủy cellulose Các kết nghiên cứu cho thấy chủng phân lập từ ruột mối có khả sinh cellulase cao Tuy nhiên để thu hoạt tính sinh học cao từ chủng phân lập cần phải tạo môi trường thuận lợi để vi sinh vật phát triển sinh tổng hợp cellulase cao Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase gồm pH, nhiệt độ, nồng độ chấtbổ sung vào môi trường Mỗi loài sinh trưởng phát triển điều kiện khác nhau, lựa chọn điều kiện tối ưu để vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao cần thiết, sở nghiên cứu thơng số phịng thí nghiệm đưa quy trình sản xuất cellulase từ vi khuẩn ruột mối quy mô công nghiệp Việc thực đề tài “Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối” cho phép lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp để sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối nhằm mục tiêu tạo chế phẩm cellulase để ứng dụng sống Hoạt độ CMCase tối đa B.subtilis G4 đạt 3,25 ± 0,22 U/ml 37°C giảm dần 45ºC 55°C (lần lượt 3,12 ± 0,19 U/ml 2,78 ± 0,2 U/ml) (Hình 3.5) Khi nhiệt độ nuôi cấy thấp cao so với nhiệt độ tối ưu s tác động lên khả chuyển hóa hợp chất, làm ức chế hoạt động hệ enzyme, làm thay đổi khả trao đổi chất vi khuẩn làm giảm khả phát triển sinh trưởng dến đến khả sinh tổng hợp enzyme CMCase giảm Bacillus pumilus EWBCM1 sinh tổng hợp cellulase đạt 0,5851 ± 0,006 U/ml sau 72 giờ, ủ 37°C [55] Kết tương tự thể nghiên cứu Yogita Lugani cộng (2015) [65] 3.2.2Ảnh hƣởng pH pH yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng vi sinh vật sản xuất enzyme Do đó, nghiên cứu thực tối ưu hóa giá trị pH khác 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 để nghiên cứu ảnh hưởng đến hoạtđộ enzyme Sau 72 Hoạt độ CMCase U/ml đánh giá hoạt độ CMCase 3.5 2.5 1.5 0.5 5.5 6.5 7.5 pH Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ CMCase Hình 3.6, cho thấy B.subtilis G4 sinh tổng hợp CMCase tốt môi trường pH trung tính, hoạt độ CMCase đạt 3,25 ± 0,18 U/ml Khi tăng giảm pH, hoạt độ enzyme bắt đầu có chiều hướng giảm, nguyên nhân pH cao thấp s làm ức chế trình trao đổi chất, ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme vi khuẩn Nghiên cứu Sharma, Bacillus sp S3B8 phân lập từ ruột mối hoạt độ CMCase cao pH [19], Bacillus 36 subtilis hoạt động tối ưu pH (0.382 U/ml) [49] Ngồi pH cịn thực nghiên cứu Egwim cs (2013) phân lập Bacillus subtilis từ ruột mối [21] 3.3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống Chủng B.subtilis G4 sau 48 nuôi cấy môi trường LB lỏng (OD6001,5 - 2) bổ sung tỷ lệ 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10% (v/v) vào môi trường nuôi cấy để đánh giá đến hoạt động cellulase sau 72 ủ Bảng 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến hoạt độ CMCase Tỷ lệ cấp giống (%) Hoạt độ CMCase (U/ml) 0,5 2,01 ± 0,19 3,25 ± 0,22 4,01± 0,16 3,18 ± 0,25 10 2,88 ± 0,11 Tỷ lệ cấp giống ban đầu khác s ảnh hưởng đến hoạt độ CMCase sinh môi nuôi cấy vi khuẩn: với tỷ lệ cấp giống 1% -5% hoạt độ CMCase trung bình cao 3,25 ± 0,22U/ml, 4,01± 0,16 U/ml; 3,18 ± 0,25 U/ml (Bảng 3.3) Hoạt độ CMCase cao bổ sung tỷ lệ cấp giống 2% (v/v) Khi tăng tỷ lệ giống cấp lên 10%, hoạt độ enzyme có chiều hướng giảm nguyên nhân vi khuẩn phát triển nhanh cạnh tranh không gian môi trương sống làm nguồn thức ăn cạn kiệt chúng sinh số sản phấm gây ức chế trình sinh trưởng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ cấp giống 2% để thực nghiên cứu Kết tương tự sản xuất cellulase tối đa tỷ lệ cấp giống 2% (v/v) tìm thấy nghiên cứu Acharya Chaudhary [8] Hoạt độ FPU CMCase vi khuẩn Bacillus licheniformis WBS1 tương ứng môi trường 37 chứa CMC 0,338 ± 0,021 U/ml 0,118 ± 0,009 U/ml Trong nghiên cứu khác Shankar Isaiarasu [55] sản xuất cellulase Bacillus pumilus với tỷ lệ giống 2% (v/v) tối ưu cho sản xuất cellulase Bacillus sp.Y3 cho hoạt độ CMCase 5,36 U/ml [65] 3.3.4 Ảnh hƣởng tốc độ lắc Chế độ lắc lên men yếu tố thúc đẩy nhanh trình lên men Ưu điểm rút ngắn thời gian lên men, nhiên làm tăng chi phí sản xuất cịn phụ thuộc vào đặc điểm vi khuẩn nghiên cứu Bacillus subtilis G4 thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện nên nghiên cứu lựa chọn tốc độ lắc 0, 100, 150, 200 250 rpm để đánh giá hoạt độ CMCase sau 72 ủ Kết thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ CMCase Tốc độ lắc (rpm) Hoạt độ CMCase (U/ml) 1,22 ± 0,11 100 2,34 ± 0,17 150 4,02 ± 0,15 200 4,11 ± 0,09 250 3,92 ± 0,27 Khi nuôi cấy điều kiện tĩnh, hoạt độ CMCase thấp 1,22 ± 0,11 U/ml Khi thay đổi tốc độ lắc chế độ khác cho thấy ảnh hưởng rõ rệt lên hoạt độ CMCase Với tốc độ 150 rpm 200 rpm hoạt độ CMCase đạt cao 4,02 ± 0,15 U/ml 4,11 ± 0,21 U/ml Tuy nhiên tăng tốc độ lên 200 rpm hoạt độ tăng khơng đáng kể, s làm tăng thêm chi phí sản xuất nên nghiên cứu lựa chọn tốc độ 150 rpm thích hợp cho sinh tổng hợp CMCase 38 3.3.5 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 108 120 lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme CMCase B.subtilis G4 Hoạt độ CMCase U/ml 24 36 48 72 84 96 108 120 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến hoạt độ CMCase Kết Hình 3.7 cho thấy hoạt độ CMCase cao thời điểm 96 lên men B.subtilis G4 đạt 5,21 ± 0,23 U/ml Khi thời gian lên men tăng hoạt độ enzyme có chiều hướng giảm dần Nguyên nhân thời gian kéo dài sản phẩm trình lên men ức chế vi khuẩn sinh trưởng, phát triển làm enzyme bất hoạt theo Haq cộng (2005) [28] Kết Das cộng cho thấy 96 lên men hoạt độ enzyme thu cao 2,828 µg/mg/phút [17], Yogita Lugani cộng (2015) hoạt độ CMCase Bacillus sp.Y3 96 đạt 7,82 U/ml [65] Nghiên cứu lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy với thành phần: cám gạo 1%, casein 0,5%, bột đậu tương 1% NaCl 1%; điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp CMCase chủngB.subtilis G4 37ºC, pH7, tỷ lệ cấp giống 2%, tốc độ lắc 150rpm thời gian lên men 96 cho hoạt độ CMCase cao đạt 5,21 U/ml cao gấp 18,6 lần so với trước tối ưu (0,28 U/ml) Cùng điều kiện nuôi cấy nghiên xác định hoạt độ FPU chủng B.sutilis G4 đạt 0,47 U/ml cao gấp 18 lần so với trước tối ưu (0,026 U/ml) 39 0.47 0.5 Hoạt độ FPU U/ml 0.4 0.3 0.2 0.1 0.026 Trước Sau Hình 3.8 Hoạt độ enzyme FPU trước sau tối ưu 3.3 Nghiên cứu động thái trình lên men chủng Bacillus subtilis G4 pH CMCase (U/ml) 12h 7.16 0.91 24h 5.4 1.38 48h 3.19 72h 7.7 4.02 96h 8.2 5.21 120h 4.3 Hình 3.9 Động thái lên men chủng Bacillus subtilis G4 Nghiên cứu sau lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp, tiến hành nghiên cứu động thái lên men chủng G4 từ 12 đến 96 để đánh giá pH lên hoạt độ enzyme CMCase Kết thể Hình 3.7 cho thấy, hoạt độ enzyme CMCase tăng từ 12 đến 96 (0,91 U/ml lên 5,21 U/ml), pH môi trường ban đầu 7, bổ sung giống sau 12 pH tăng lên 7,16, nhiên 24 pH lại bắt đầu giảm đến 48 Đến 72 96 pH lại tăng lên từ 7,7 đến 40 8,2 Có thể kết luận Bacillus subtilis G4 trình sinh trưởng sinh axit làm giảm pH môi trường giai đoạn sinh trưởng Khi trình sinh trưởng ngừng, pH tăng trở lại bắt đầu sinh tổng hợp CMCase 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu q trình thực đề tài, chúng tơi xin đưa số kết luậnsau: Lựa chọn môi trường lên men tối ưu cho B.subtilis G4 sinh tổng hợp CMCase gồm: cám gạo 1%, casein 0,5%, bột đậu tương 1% NaCl 1% Lựa chọn điều kiện lên men tối ưu sinh tổng hợp CMCase: nhiệt độ nuôi cấy 37ºC, pH môi trường ban đầu 7, tỷ lệ cấp giống 2%, tốc độ lắc 150rpm thời gian lên men 96 cho hoạt độ CMCase cao đạt 5,21 U/ml, FPU đạt 0,47 U/ml KIẾN NGHỊ Từ kết đạt được, xin đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học khác chủng Bacillus subtilis G4 hoạt tính lignocellulase, xylanase… Đánh giá ảnh hưởng nguồn chất rơm rạ, bã mía, giấy… đến hoạt độ enzyme để sản xuất enzyme quy mô công nghiệp 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thùy Dương (2002), Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn ni", Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, 2, tr 34-36 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đức Khảm, Nguyễn Tân Vương, Trịnh Văn Hạnh, Nguyễn Văn Quảng, Lê Văn Triển, Nguyễn Thúy Hiền, Vũ Văn Nghiên, Ngô Trường Sơn Võ Thu Hiền (2007), Động vật chí Việt Nam Mối: cánh – Isoptera, NXB Khoa học Kỹthuật) Nguyễn Lan Hương, Hồng Đình Hịa (2003), Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, cellulose dầu liu q trình phân hủy chất thải hữu cơ, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 288-291 Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), Tinh sơ đánh giá tính chất hoá lý cellulase từ chủng Penicillium sp DTQHK1, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5, tr 47-54 Võ Thị Xuyến (2006), Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ số chủng VSV khả thủy phân cellulose, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM TIẾNG ANH Abe, T., Bignell, D.E., and Higashi, M (2000), Termites: Evolution, Sociality, Symbioses, Ecology(Springer) 43 Acharya ,S., Chaudhary , A (2011),Effect of nutritional and environmental factors on cellulases activity by thermophilicbacteria isolated from hot spring J SciInd Res 70, pp 142-148 Amtul, J S., (1989) Purification and Characterization of Microbial Cellulolytic Enzymes Ph.D Thesis, Institute of Chemistry, University of the Punjab Lahore – 1, Pakistan, pp: 176 10 Annamalai N., Rajeswari M V., Elayaraja, S., Thavasi, R., Vijayalakshmi, S and Balasubramanian, T (2012), Purification and Characterization of Thermostable Alkaline Cellulase from Marine Bacterium Bacillus licheniformis AU01 by Utilizing Cellulosic Wastes Waste and Biomass Valorization 3, pp 305-310 11 Ariffin H., Hassan M.A., Shah U.K.M., Abdullah N., Ghazali F.M., and Shirai Y., (2008), Production of bacterial endoglucanase from pretreated oil palm empty fruit bunch by Bacillus pumilus EB3, Journal of Bioscience and Bioengineering, 106(3), pp 231–236, 2008 12 Azzaz, H.H., (2009) Effect of cellulolytic enzymes addition to diets on the productive performance of lactating goats M.Sc Thesis, Faculty of Agriculture, Cario University, Egypt, pp: 141 13 Bignell D, (2010), Morphology, Physiology, Biochemistry and Functional Design of the Termite Gut: An Evolutionary Wonderland In: Biology of Termites: a Modern Synthesis edn Edited by Bignell D, Roisin Y, Lo N New York: Springer 14 Brune, A (2011), Microbial Symbioses in the Digestive Tract of Lower Termites In Beneficial Microorganisms in Multicellular Life Forms, E Rosenberg, and U Gophna, eds (Springer Berlin Heidelberg), pp.3–25 15 Chen, X.H., Koumoutsi, A., Scholz R., (2007), Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 Nat Biotechnol 25, pp.1007-1014 16 Danutawat, T., and Nguyen, T.K.O (2007) Effects from Open Rice Straw 44 Burning Emission on Air Quality in the Bangkok Metropolitan Region ScienceAsia 33, pp 339–345 17 Das, A., Bhattacharya, S., Murali, L.,(2010), Production of cellulase from thermophilicBacillus sp isolated from cow dung AM Eurasian J AgricEnviron Sci 8,pp 685-691 18 Deepmoni Deka, Saprativ P Das,Naresh Sahoo, Debasish Das, Mohammad Jawed, Dinesh Goyal, and Arun Goyal (2013) Enhanced Cellulase Production from Bacillus subtilis by Optimizing Physical Parameters for Bioethanol Production ISRN Biotechnology,2013 Article ID 965310, 11 pages 19 Dinita Sharma, Bishnu Joshi, Megh Raj Bhatt, Jarina Joshi, Rajani Malla, Tribikram Bhattarai, Lakshmaiah Sreerama, (2015) Isolation of Cellulolytic Organisms from the Gut Contents of Termites Native to Nepal and Their Utility in Saccharification and Fermentation of Lignocellulosic Biomass Journal of Biomass to Biofuel, 2, pp 11-19 20 Dolan, M.F (2001) Speciation of termite gut protists: the role of bacterial symbionts Int Microbiol Off J Span Soc Microbiol 4,pp.203–208 21 Egwim E C, Gani Habiba and Ogunmolasuyi Adewoyin M, (2013) Isolation and characterization of cellulase and protease producing microorganism from termite gut J Food Process Technol 2013, pp 4-10 22 Eman Zakaria Gomaa, (2013) Optimization and characterization of alkaline protease and carboxymethyl-cellulase produced by Bacillus pumillus grown on Ficus nitida wastes Braz J Microbiol, 44(2), pp.529–537 23 Eriksen J., Goksoyr J (1977), Cellulases from Chaetomium thermophile var dissitum, Eur J Biochem., 77, pp 445-450 24 Fisher, M.L (2006) Comparison of Subterranean Termite (Rhinotermitidae:Reticulitermes) Gut Bacterial Diversity Within and Between Colonies and to Other 25 Gajju H, Bhalla TC, Agarwal HO, (1996) Thermostable alkaline protease from thermophilic Bacillus coagulansPB-77 Ind J Microbiol 1996;36:153–155 45 26 Gao J., Weng H., Xi Y., Zhu D., Han S (2008), Purification and characterization of a novel endo-b-1,4-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett., 30, pp 323–327 27 Ghose T.K., (1987) Measurement of cellulase activities, Pure & Appl Chem., 59(2), pp 257 – 268 28 Haq IU, Hameed K, Shahzadi MM, Javed SA, Qadeer MA (2005) Cotton Saccharifying activity of cellulases byTrichoderma harzianum UM-11 in shake flask Int J Bot 1, pp 19-22 29 Hurst P L., Sullivan P A (1978), Substrate specificity and wode of action of cellulase from Aspergillus niger, Biochem J., 169, pp 389-396 30 Husseneder, C., Wise, B.R., and Higashiguchi, D (2005) microbial diversity in the termite gut (Malaysia: P&Y DesignNetwork), 31 Immanuel, G., R Dhanusa, P Prema and A Palavesam, 2006 Effect of different growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment Int J Environ Sci Tech 3(1), pp.25-34 32 Inoue T., Kitade, O., Yoshimura T., and Yamaoka I (2000) Symbiotic associations with protists In Termites: Evolution, Sociality, Symbiosis, Ecology, (Dordrecht:Kluwer), 33 Jagdish Singhand Pawandeep Kaur (2012) Optimization of Process Parameters for Cellulase Production from Bacillus sp JS14 in Solid Substrate Fermentation Using Response Surface Methodology Braz Arch Biol Technol .55 (4), pp 505-512 34 Jo K.I., Lee Y.J., Kim B.K., (2008) Pilot-scale production of carboxymethylcellulase from rice hull byBacillus amyloliquefaciens DL3, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 13(2), pp 182–188, 35 König, H (2006) Bacillus species in the intestine of termites and other soil invertebrates J Appl Microbiol 101,pp 620–627 46 36 Kuhad R C., Gupta R., Singh A (2011), Microbial cellulases and their Industrial applications, Enzyme res., Doi: 10.4061/2011/280696, 10 pages 37 Li-Jung Y Hsin-Hung L (2000) Purification and characterization of a cellulose from Bacillus subtilisYJ1 Journal of Marine Science and Technology, 18(3), pp 466-471 38 O’sullivan, A.C (1997) Cellulose: the structure slowly unravels 4, pp 173– 207 39 Ohkuma M., (2003) Termite symbiotic systems: efficient bio-recycling of lignocelluloses, Applied microbiology and biotechnology, 61(1), pp 1-9, 40 Omogbenigun F O., Nyachoti C M., Slominski B A (2004), Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs, J Anim Sci., 82, pp 1053-1061 41 Pourramezan Z, Ghezelbash GR, Romani B, Ziaei S, Hedayatkhah A.,(2012)Screening and identification of newly isolated cellulose-degrading bacteria from the gut of xylophagous termite Microcerotermes diversus (Silvestri) Mikrobiologiia.81(6), pp 796-802 42 Prajna Mishra, (2013) Production of lignocellulosic ethanol from Lantana camara by bacterial cellulase of termite symbionts Department of life science national institute of technology Rourkela-769008, Orissa 43 Rajoka M.K, (2004) Influence of various fermentation variables on exoglucanase production in Cellulomonas flavigena,Electronic Journal of Biotechnology, vol 7(3), pp 256–263 44 Ramachandran S, Patel AK, Nampoothiri KM, Francis F , Nagy V, Szakacs G, Pandey A (2004) Coconut oil cake––a potential raw material for the production of amylase Biores Technol 93, pp 169–174 45 Ramin, M., Alimon, A.R., Abdullah, N., Panandam, J.M., and Sijam, K (2008) Isolation and Identification of Three Species of Bacteria from the Termite Coptotermes curvignathus (Holmgren) Present in the Vicinity of University Putra Malaysia Res J Microbiol 3,pp 288–292 47 46 Ratanakhanokchai, K., Waeonukul, R., Pason, P., Tachaapaikoon, C., Lay, K., Sakka, K., Kosugi, A., and Mori, Y (2013) Paenibacillus curdlanolyticus Strain B-6 Multienzyme Complex: A Novel System for Biomass Utilization In Biomass Now - Cultivation and Utilization, M.D Matovic, ed.(InTech) 47 Ray A.K., Bairagi A., Sarkar Ghosh K., and Sen S.K., (2007) Optimization of fermentation conditions for cellulase production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut,Acta Ichthyologica et Piscatoria, 37(1), pp 47–53 48 Reese E T., Siu R G H., Levinson S H (1950), The biological degradation of solube cellulose derivatives and relationship to the mechenism of cellulose hydrolysis", J Biotechnol., 59, pp 485-479 49 Reka V and Ananthi T., (2013) Isolation and characterization of extracellular cellulase using Bacilluls subtilis from mangrove soil Asian J Environ Sci., 8(2), pp 67 -71 50 Rosengaus, R.B., Zecher, C.N., Schultheis, K.F., Brucker, R.M., and Bordenstein,S.R (2011) Disruption of the Termite Gut Microbiota and Its Prolonged Consequences for Fitness Appl Environ Microbiol 77, pp 4303– 4312 51 Sakon, J., Irwin, D., Wilson, D.B., and Karplus, P.A (1997) Structure and mechanism of endo/exocellulase E4 from Thermomonospora fusca Nat Struct Mol Biol 4,pp 810–818 52 Saranraj P., Stella D., Reetha D (2012), Microbial cellulases and its applications: a review, Int J Biochem & Biotech Sci., 1, pp 1-12 53 Sasidharan Sreedevi, Sreedharan Sajith, Sailas Benjamin (2013) Cellulase Producing Bacteria from the Wood-Yards on Kallai River Bank Advances in Microbiology, 3, pp 326-332 54 Scharf, M.E., and Tartar, A (2008) Termite digestomes as sources for novel lignocellulases Biofuels Bioprod Biorefining, 2,pp 540–552 48 55 Shankar T and Isaiarasu L., (2011) Cellulase Production by Bacillus pumilus EWBCM1 under Varying Cultural Conditions Middle-East Journal of Scientific Research, (1), pp 40-45 56 Sharma V K., Hagen J C (1995), Isolation and characterization of Clostridium hobsonii comb nov, Bio Technol., 51, pp 61-74 57 Siddiqui K.S., Shemsi A.M., Anwar M.A., Rashid M.H., and Rajoka M.I.,(1999) Partial and complete alteration of surface charges of carboxymethylcellulase by chemical modification: thermostabilization in water miscible organic solvent, Enzyme and Microbial Technology, 24(8-9), pp 599608 58 Sohail M., Siddiqi R., Ahmad A., and Khan S.A., (2009) Cellulase production from Aspergillus niger MS82: effect of temperature and pH,New Biotechnology, 25(6), pp 437–441 59 Sreena, C.P., Resna, N.K., Denoj Sebastian (2015) Isolation and Characterization of Cellulase Producing Bacteria from the Gut of Termites (Odontotermes and Heterotermes Species).British Biotechnology Journal, 9(1), pp 1-10 60 Vinay K Singh and Anil Kumar, (1998) Production and purification of an extracellular cellulase from Bacillus brevis VS-1, Biochemistry and Molecular biology international, 45(3), pp.443-452 61 Vos ,P.D., Garrity, G.M., Jones, D., (2009) Bergey's manual of systematic bacteriology Springer Science 62 Wachinger G., Bronnenmeier K., Staudenbauer W L., Schrempf H (1989), Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli, Appl Environ Microbiol., 55, pp 2653-2657 63 Watanabe H., Tokuda G (2001), Animal cellulases, Cell Mol Life Sci., 58, pp 1167-1178 49 64 Wenzel M, Schonig I, Berchtold M, Kampfer P, Konig H., (2002).Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis J Appl Microbiol, 92, pp 32-40 65 Yogita Lugani, Rajesh Singla and Balwinder Singh Sooch Optimization of cellulase production from Newly isolated Bacillus sp Y3.J Bioprocess Biotech 5:264 50 ... xuất cellulase từ vi khuẩn ruột mối quy mô công nghiệp Vi? ??c thực đề tài ? ?Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối? ?? cho phép lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp để sinh tổng hợp. .. dụng enzyme cellulase 1. 2Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase từ ruột mối 11 1.2.1 Cấu tạo ruột mối hệ vi sinh vật ruột mối 11 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột mối ... khả sinh tổng hợp cellulase gồm pH, nhiệt độ, nồng độ chấtbổ sung vào mơi trường Mỗi lồi sinh trưởng phát triển điều kiện khác nhau, lựa chọn điều kiện tối ưu để vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase