Nghiên cứu phân lập và sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn trong ruột mối

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ VI KHUẨN TRONG RUỘT MỐI GV hƣớng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân SV thực hiện: Nguyễn Thị Hoa - 1152040520 Phan Thị Oanh - 1152043856 Lớp: 52K - CNTP Nghệ An - 5/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Hoa - 1152040520 Phan Thị Oanh - 1152043856 Khóa : 52K - CNTP Ngành : Công nghệ thực phẩm Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: Cán hƣớng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 201 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 201 : Ngày tháng năm 201 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) Chủ nhiệm môn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày i tháng năm 201 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Hoa - 1152040520 Phan Thị Oanh - 1152043856 Khóa : 52K - CNTP Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : Cán duyệt ThS Đào Thị Thanh Xuân : Nội dung nghiên cứu, thiết kế Nhận xét cán hƣớng dẫn Ngày tháng năm 201 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Hoa - 1152040520 Phan Thị Oanh - 1152043856 Khóa : 52K - CNTP Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : Cán duyệt ThS Đào Thị Thanh Xuân : Nội dung nghiên cứu, thiết kế Nhận xét cán hƣớng dẫn Ngày tháng năm 201 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) iii Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nhận đƣợc nhiều ủng hộ giúp đỡ ngƣời thân, bạn bè q thầy mơn Hóa thực phẩm, khoa Hóa học, trƣờng Đại học Vinh Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Cô Th.S Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học trƣờng Đại học Vinh tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức bổ ích, khơng để hoàn thành luận văn tốt nghiệp cách hiệu mà vốn kiến thức để làm việc sau tốt nghiệp Trân trọng cảm ơn thầy cố vấn học tập tất thầy cô mơn Hóa thực phẩm, khoa Hóa học tồn thể quý thầy cô trƣờng Đại học Vinh giảng dậy truyền thụ kiến thức vô quý báo suốt thời gian học tập trƣờng, hành trang giúp vững bƣớc nghề nghiệp sau Tôi không quên gửi lời cảm ơn đến cán bộ, bạn bè phịng thí nghiệm mơn Hóa thực phẩm, khoa Hóa học tập thể lớp Công nghệ thực phẩm K52 giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình làm thực nghiệm Cuối lời, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến gia đình, chỗ dựa vững chắc, tạo niềm tin, sức mạnh cho vƣợt qua khó khăn vấp ngã Xin chân thành cảm ơn ! SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh i Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU vi TÓM TẮT ĐỒ ÁN viii LỜI MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Vật liệu, phạm vi nôi dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát loài mối Việt Nam .4 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đời sống xã hội 1.1.4 Tập tính sinh hoạt .7 1.1.5 Thức ăn mối .7 1.1.6 Cơ chế tiêu hóa cellulose 1.2 Khái quát enzym 1.2.1 Khái niệm enzym 1.2.2 Nguồn thu nhận enzym .9 1.3 Giới thiệu enzym cellulase 10 1.3.1 Định nghĩa 10 1.3.2 Cấu tạo 11 1.3.3 Giới thiệu Cellulose 14 1.4 Giới thiệu chung nhóm vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase .16 1.5 Các phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh - phƣơng pháp lên men .18 1.5.1 Nuôi cấy bề mặt 19 1.5.2 Phƣơng pháp lên men chìm 20 1.6 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng tổng hợp cellulase 21 1.6.1 Ảnh hƣởng yếu tố vật lý 21 1.6.2 Ảnh hƣởng yếu tố hóa học .22 SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh ii Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 1.7 Ứng dụng 23 1.7.1 Cellulase với công nghệ thực phẩm .23 1.7.2 Trong công nghệ sản xuất giấy bột giấy 24 1.7.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 24 1.7.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 25 1.7.5 Trong công nghệ sản xuất dung môi hữu 25 1.7.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 25 1.8 Một số nghiên cứu cellulase .26 1.8.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 1.8.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 27 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Vật liệu 29 2.2 Hóa chất thiết bị, dụng cụ 29 2.2.1 Hóa chất 29 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ .30 2.3 Các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 30 2.3.1 Môi trƣờng hoạt hóa D2 30 2.3.2 Môi trƣờng giữ giống thử hoạt tính 30 2.3.3 Mơi trƣờng tiếp giống LB khơng có CMC .31 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy .31 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Thu mẫu 32 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn 32 2.4.3 Phƣơng pháp cấy chuyền giữ giống 33 2.4.4 Quan sát hình thái khuẩn lạc 33 2.4.5 Phƣơng pháp nhuộm gram .33 2.4.6 Định tính cellulase phƣơng pháp chấm điểm, thuốc thử congo red 34 2.4.7 Phƣơng pháp định lƣợng cellulase theo phƣơng pháp Miller 34 2.4.8 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp Dinitro Salicylic 35 2.4.9 Phƣơng pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết nghiên cứu phân lập vi khuẩn sinh cellulase 39 3.1.1 Quy trình phân lập 39 SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh iii Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 3.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc 40 3.1.3 Kết kiểm tra khả thủy phân CMC phƣơng pháp định tính 41 3.2 Đặc điểm chủng có hoạt tính cellulase mạnh 44 3.2.1 Đặc điểm hình thái tế bào nhuộm gram .44 3.2.2 Xác định khả sinh cellulase chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối phƣơng pháp định lƣợng 45 3.3 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase mơi trƣờng lỏng 47 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy .47 3.3.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ tiếp giống đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase 47 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase 48 3.3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase 49 3.4.5 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase 50 CHƢƠNG KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh iv Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC : Carboxylmetyl cellulase DNS : 3,5-Dinitro salicylic OD : Optical density SDS : Sodium Dodecyl Sulfat SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh v Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU Trang Hình Hình 1.1 Mối chúa nằm bất động đƣợc mối thợ chăm sóc Hình 1.2 Mối cánh [16] Hình 1.3 Mối lính [16] Hình 1.4 Mối thợ [16] Hình 1.5 Enzym cellulase 11 Hình 1.6 Cấu trúc khơng gian ba chiều enzym cellulase 12 Hình 1.7 Sự phối hợp hoạt động loại enzym [2] 14 Hình 1.8 Cấu trúc không gian phân tử cellulose [2] .15 Hình 1.9 Cấu trúc phân tử cellulose [2] .15 Hình 1.10 Vi khuẩn cellulomonase [12] 17 Hình 1.11 Vi khuẩn Cytophaga [13] 18 Hình 1.12 Vi khuẩn Clostridium [14] 18 Hình 3.1 Phân lập đƣợc khuẩn lạc khác .41 Hình 3.2 Ảnh chủng cấy chuyền để giữ giống 41 Hình 3.3 Vi khuẩn tạo vịng trịn thủy phân mơi trƣờng CMC nhuộm với congo đỏ 43 Hình 3.4 Tế bào số chủng vi khuẩn .44 Hình 3.5 Tế bào nhuộm gram số chủng vi khuẩn 44 Bảng Bảng 2.1 Pha dãy nồng độ chuẩn glucose 35 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập đƣợc 40 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính, đặc tính chủng vi khuẩn .42 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn .44 Bảng 3.4 Khả sinh tổng hợp cellulase chủng Bacillus 46 Bảng 3.5 hoạt tính cellulase theo mơi trƣờng nuôi cấy lỏng 47 Bảng 3.6 Hoạt tính cellulase theo tỉ lệ tiếp giống mơi trƣờng LB khơng có CMC 48 Bảng 3.7 Hoạt tính cellulase theo thời gian ni cấy mơi trƣờng M3 49 SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh vi Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân a) Chủng có hoạt tính mạnh b) Chủng có hoạt tính yếu Hình 3.3 Vi khuẩn tạo vịng trịn thủy phân môi trường CMC nhuộm với congo đỏ SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 43 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 3.2 Đặc điểm chủng có hoạt tính cellulase mạnh 3.2.1 Đặc điểm hình thái tế bào nhuộm gram Từ kết định tính chúng tơi chọn chủng có hoạt tính mạnh: F2, H2.1, G4, G5, G3.1 để tiến hành nhuộm gram, soi tƣơi chủng dƣới kính hiển vi Sau kiểm tra hình dạng vi khuẩn dƣới kính hiển vi cho thấy: tế bào vi khuẩn gram dƣơng (+), có hình dạng cầu khuẩn Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn Stt Tên chủng F2 G4 G5 H2.1 G3.1 Hình dạng Cầu khuẩn Cầu khuẩn Cầu khuẩn Hình que Cầu khuẩn Nhuộm gram + + + + + a) Chủng F2 dạng hình cầu b) Chủng H2.1 dạng hình que Hình 3.4 Tế bào số chủng vi khuẩn Kết nhuộm gram: phần lớn tế bào vi khuẩn gram dƣơng (+) a) Chủng F2 nhuộm gram b) Chủng H2.1 nhuộm gram Hình 3.5 Tế bào nhuộm gram số chủng vi khuẩn SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 44 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 3.2.2 Xác định khả sinh cellulase chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối phương pháp định lượng Các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ ruột mối đƣợc nuôi môi trƣờng LB, 37C tốc độ lắc 150 vòng/phút Sau ngày nuôi cấy đem xác định hoạt độ enzym phƣơng pháp Miller Để xác định hoạt độ enzym sử dụng đƣờng chuẩn glucose Kết thu đƣợc nhƣ sau: a) Kết xác định đƣờng chuẩn Dãy chuẩn glucose có nồng độ đƣợc pha theo bảng 1.1, phƣơng trình hồi quy đồ thị đƣợc xác định vẽ phần mềm Microsof Excel 2010 Kết đo đƣợc: Nồng độ (g/l) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Mật độ quang OD 0,057 0,2288 0,4002 0,572 0,743 Đồ thị 3.1 Đường chuẩn glucose Từ đồ thị thể qua hình trên, ta có phƣơng trình đƣờng thẳng hồi quy y = 0,8576x - 0,1144 với hệ số tƣơng quan R2 = 0,999 b) Tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp cellulase Các chủng đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB tiến hành nuôi 37˚C, lắc với tốc độ 150 vòng/phút, tiến hành lấy mẫu thời điểm 2, 3, 4, ngày Dịch nuôi cấy đƣợc xác định hoạt độ cellulase theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử DNS (Dinitro salycylic) SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 45 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Lƣợng đƣờng khử dung dịch thủy phân enzym tỷ lệ thuận với cƣờng độ màu bƣớc sóng 540 nm Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.4 Khả sinh tổng hợp cellulase chủng Bacillus Chủng Hoạt tính cellulase (µmol/g/phút) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ F2 0,977 1,46 1,098 0,884 G4 1,046 1,63 1,482 0.985 G5 0,883 1,017 0,865 0,8 G3.1 0,753 0,896 0,754 0,65 H2.1 0,894 1,04 0,873 0,63 Đồ thị 3.2 Hoạt tính enzym cellulase số chủng Từ kết cho thấy khả sinh tổng hợp cellulsae chủng không giống thời điểm ngày ni cấy thứ hoạt tính enzym thu đƣợc cao Từ tập hợp chủng tìm đƣợc chủng có hoạt tính cao chúng tơi chọn chủng Bacillus F2 để tiến hành nghiên cứu SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 46 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 3.3 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase môi trƣờng lỏng 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Để nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy lên hoạt độ enzym cellulase Chúng tiến hành nuôi chúng F2 môi trƣờng khác nhau: môi trƣờng M3, môi trƣờng LB, môi trƣờng D6, môi trƣờng CMC broth tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.5 hoạt tính cellulase theo môi trƣờng nuôi cấy lỏng Môi trƣờng M3 LB CMC broth D6 Mật độ quang (OD) 0,263 0,172 0,098 0.078 Hoạt độ cellulase (µmol/g/phút) 1,631 1,132 0,857 0,783 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng môi trường lên hoạt độ enzym cellulase Từ việc khảo sát ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp cellulase ta thấy chủng F2 sinh tổng hợp cellulase cao môi trƣờng M3 Lựa chọn môi trƣờng M3 để tiến hành nghiên cứu 3.3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase Mục đích: khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase theo tỷ lệ tiếp giống khác môi trƣờng nhằm xác định tỷ lệ tiếp giống phù hợp để thu nhận đƣợc enzym cellulase có hoạt tính cao SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 47 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ tiếp giống lên hoạt độ enzym cellulase Chúng tiến hành nuôi chủng Bacillus F2 mơi trƣờng LB khơng có CMC nồng độ khác khoảng 18 đến 24 sau đổ vào mơi trƣờng M3 để ni cấy tiến hành lấy mẫu ngày thứ đem xác định hoạt độ Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.6 Hoạt tính cellulase theo tỉ lệ tiếp giống mơi trƣờng LB khơng có CMC Tỉ lệ tiếp giống (%) 2,5 10 15 Mật độ quang (OD) 0,102 0,235 0.081 0,05 Hoạt tính cellulase ( mol/g/phút) 0,935 1,508 0,843 0,709 Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống lên hoạt độ enzym cellulase Kết cho thấy hoạt tính cellulase cao tỉ lệ tiếp giống 5%, hoạt tính đạt 1,508 ( mol/g/phút) Hoạt tính enzym giảm dần tỉ lệ tiếp giống tăng lên 10% 15% 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase Mục đích: khảo sát thời gian tối ƣu để trình sinh tổng hợp enzym cellulase đạt cao Vi sinh vật sau trải qua giai đoạn sinh trƣởng phát triển ta tiến hành thu nhận enzym Thời gian thích hợp để thu nhận enzym hoạt độ enzym đạt SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 48 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân cao nhất, chủng bacillus F2 đƣợc nuôi môi trƣờng lỏng nhiệt độ 37˚C với tốc độ lắc 150 vịng/phút Sau lấy mẫu thời điểm 1, 2, 3, 4, ngày để xác định hoạt độ enzym Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.7 Hoạt tính cellulase theo thời gian ni cấy môi trƣờng M3 Thời gian (ngày) Mật độ quang (OD) 0,105 0,112 0,235 0,163 0,09 Hoạt độ cellulase (µmol/g/phút) 0,946 0,977 1,508 1,197 0,882 Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hoạt độ enzym cellulase Từ kết cho thấy hoạt tính cellulase cao ngày ni cấy thứ 3, hoạt tính đạt 1,508 (µmol/g/phút) 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase Mục đích: xác định nhiệt độ ni cấy tối ƣu để trình sinh tổng hợp enzym cellulase đạt cao Để nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ lên trình sinh tổng hợp enzym cellulase thực chủng Bacillus F2 môi trƣờng nhiệt độ khác nhau, tốc độ lắc 150 vịng/phút Sau tiến hành xác định hoạt độ sau ngày nuôi cấy SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 49 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.8 Hoạt tính cellulase theo nhiệt độ ni cấy mơi trƣờng lỏng Nhiệt độ (C) 30 37 45 Mật độ quang (OD) 0,082 0,235 0,056 Hoạt tính cellulase ( mol/g/phút) 0,849 1,508 0,736 Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase Nhiệt độ thích hợp cho tăng trƣởng phát triển hầu hết chủng bacillus khoảng 37C Ở nhiệt độ cao thấp trình sinh trƣởng Tuy nhiên, nhiệt độ phát triển tốt chƣa trình sinh trƣởng enzym tốt 3.4.5 Ảnh hưởng pH đến q trình sinh tổng hợp enzym cellulase Mục đích: khảo sát khả tổng hợp enzym cellulase theo pH khác môi trƣờng nuôi cấy M3, thời gian nuôi cấy tối ƣu, nhiệt độ tối ƣu nhằm xác định pH mơi trƣờng ni cấy thích hợp để thu nhận đƣợc enzym cellulase với hoạt tính cao pH ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa chất, ngồi cịn ảnh hƣởng tới q trình sinh tổng hợp enzym SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 50 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzym cellulase Chúng tiến hành nuôi chủng Bacillus F2 môi trƣờng M3 pH khác tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.9 Hoạt tính cellulase theo pH ni cấy môi trƣờng lỏng pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mật độ quang (OD) 0,006 0,0062 0,371 0,227 0,086 0,042 Hoạt tính cellulase 0,517 0,519 2,096 1,474 0,864 0,674 ( mol/g/phút) Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzym cellulase Từ kết cho thấy: PH có ảnh hƣởng lớn đến khả sinh tổng hợp cellulase Sự thay đổi pH làm cho hoạt tính enzym thay đổi Từ việc khảo sát ảnh hƣởng pH đến khả sinh tổng hợp cellulase ta thấy Bacillus F2 sinh tổng hợp cellulase tốt pH = 5,0 3.4.6 Ảnh hưởng chất cám gạo đến trình sinh tổng hợp enzym cellulase Cám gạo vừa chất kích thích sinh tổng hợp, vừa chất kích thích sinh trƣởng SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 51 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng cám gạo lên hoạt độ enzym cellulase Chúng tiến hành nuôi chủng Bacillus F2 môi trƣờng M3 có thay đổi nồng độ cám gạo là: 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20% tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.10 Hoạt tính cellulase theo thành phần cám gạo ni cấy môi trƣờng lỏng Cám gạo (%) 2,5 10 15 20 Mật độ quang (OD) 0,118 0,133 0,166 0,306 0,216 0,126 Hoạt tính cellulase 1,002 1,067 1,212 1,815 1,428 1,038 (mol/g/phút) Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng nồng độ cám gạo lên hoạt tính enzym cellulase Từ kết cho thấy: Nồng độ cám gạo có ảnh hƣởng lớn đến khả sinh tổng hợp cellulase Sự thay đổi phần trăm cám gạo làm cho hoạt tính enzym thay đổi Từ kết nghiên cứu cho thấy cám gạo nồng độ 10% có hoạt tính mạnh đạt 1,815 (mol/g/phút) 3.4.7 Ảnh hưởng nguồn chất đến trình sinh tổng hợp cellulas Cơ chất với nồng độ định thƣờng đóng vai trị chất cảm ứng cho q trình sinh tổng hợp enzym SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 52 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn chất lên q trình sinh tổng hợp enzym cellulase chúng tơi tiến hành ni chủng Bacillus F2 mơi trƣờng có chứa nguồn chất khác nhƣ sắn, mía, CMC, giấy lọc Sau tiến hành xác định hoạt độ sau ngày nuôi cấy Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.11 Hoạt tính cellulase theo nguồn chất môi trƣờng lỏng Nguồn chất Lá sắn Lá ngô CMC Giấy lọc Mật độ quang (OD) 0,223 0,1222 0,071 0,042 Hoạt độ enzym (mol/g/phút) 1,460 1,022 0,806 0,676 Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng nguồn chất lên hoạt độ enzym cellulase Từ kết cho thấy: Hoạt tính enzym cellulase nguồn chất khác khác Dựa vào kết ta thấy hoạt tính enzym cellulase mơi trƣờng có chứa sắn cao SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 53 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân CHƢƠNG KẾT LUẬN Phân lập đƣợc 22 chủng, phần lớn vi khuẩn gram dƣơng Các chủng vi khuẩn có tế bào hình cầu Số chủng vi khuẩn có khả thủy phân mạnh CMC chủng khơng thủy phân thủy phân yếu CMC Khả sinh tổng hợp cellulase chủng không giống Chọn chủng Bacillus F2 có khả sinh tổng hợp enzym cellulase cao để tiến hành nghiên cứu Chủng Bacillus F2 có hoạt tính mạnh ni cấy lên mơi trƣờng M3 Chủng Bacillus F2 có hoạt tính cao sau ngày ni cấy, hoạt tính đạt 1,508  mol/g/phút Nghiên cứu đƣợc số yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp cellulase từ Bacillus F2 nhƣ pH, tỉ lệ tiếng giống,… Nghiên cứu đặc tính cellulase chủng Bacillus F2 thu đƣợc kết nhƣ sau: Nhiệt độ tối ƣu: 37˚C pH tối ƣu: pH = Tỉ lệ tiếp giống: 5% Nồng độ cám gạo thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzym cellulase: 10% Cơ chất sắn cho cho hoạt tính enzym cellulase cao SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 54 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzym, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose Nguyễn Khắc Tuấn (1996) Vi sinh vật học NXB Nông Nghiệp Hà Nội Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999), Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt nông nghiệp, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551 Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339 Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng Thí nghiệm cơng nghệ sinh học Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Trần Thị Ánh Tuyết, Trƣơng Quốc Huy Khảo sát điều kiện nuôi cấy 10 11 12 phương pháp tách chiết enzym cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis Tuyển tập Báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ7 Nguyễn Đức Lƣợng Nuyễn Hữa Phúc, 1996 Công nghệ vi sinh vật tập sinh học công nghiệp NSB Đại Học bách khoa TP Hồ Chí Minh, trang 189 Nguyến Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục, 2003 Phan Thị Mộng Tuyền, 2012 Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ dịch rác thải Trƣờng Đại học Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng, 2007 Vi sinh vật học NSB giáo dục, trang 45 - 47 Trần Non Nƣớc, Võ Văn Song Toàn, Dƣơng thị Hƣơng Giang Trần Nhân Dũng, 2012 Tuyển chọn tối ƣu hóa vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp enzym cellulase chất bột giấy Tạp chí khoa học 2012: 22b 43-53 Viện NC PTCNSH, Trƣờng Đại học Cần Thơ, trang 45-46 13 http://www.standardsingenomics.org/index.php/sigen/article/view/sigs/ SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 55 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân 14 Nguyễn Văn Tuân Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo -β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo -β-1,4Glucanase Luận văn thạc sĩ khoa học Viện khoa học công nghệ Việt Nam 2009 15 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bovine_Rumen/ 16 http://www.dost-bentre.gov.vn/hoi-dap-khoa-hoc/3037-phan-lap-vi-sinh-vat.html 17 http://doanthanhnien.hce.edu.vn/index.php/KIEN-THUC/KHOA-HOC/ Tim-hieuve-loai-moi.html 18 http://www.chongmoi.vn/kien-thuc-loai-moi/58-cac-kien-thuc-chung-vemoi-.html/ loai- 19 http://www.khoahoc.com.vn/bandoc/ban-doc/36851_Tim-hieu-ve loaimoi.aspx 20 http://www.dietmoi.net/nguon-nang-luong-thay-the-duoc-san-xuat-tu- moi/ 21 Nguyễn Hoài Hƣơng 2009 Bài giảng thực hành vi sinh ứng dụng Khoa môi trƣờng công nghệ sinh học Trƣờng Đại Kỹ Thuật Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh 22 Võ Văn Phƣớc Quệ Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Tạp chí khoa học 2011: 18 a 177-184 Viện NC PTCNSH Trƣờng Đại học Cần Thơ, trang 179-180 23 Nguyễn Thị Diệu Hiền, 2009 Phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose trấu hoai mục Luận văn tốt nghiệp, chuyên nghành công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Cần Thơ Tài liệu tiếng Anh 24 Nema, N., 2Alamir, L Mohammad, M Production of cellulase from Bacillus cereus by submerged fermentation using corn husks as substrates International Food Research Journal 22(5): 1831-1836 (2015) 25 M Moosavi-Nasab and M Majdi-Nasab Cellulase Production by Trichoderma reesei using Sugar Beet Pulp Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, I R Iran 26 Conghlan M.P and Folan M.A (1979), “Ceelulose and cellulase: Food for thought, food for future”Int.T.biochem 27 P.G Department of Biochemistry and Biotechnology, S.S.V College, Valayanchirangara, Ernakulam, Kerala- 683556, India Cellulase production optimization using cellulolytic bacteria International journal of pharmaceutical, Chemical and Biological sciences Ijpcbs 2015, 5(1), 262-266 28 Richa Gautam1, Jitender Sharma2 department of Biotehnology Kurakshetra University Kurakshetra Optimization, Purification of Cellulase Produced From Bacillus Subtilis Subsp Inaquosorum Under Solid State Fermentation And Its SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 56 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đào Thị Thanh Xuân Potential Applications in Denim Industry ISSN (online): 2319-7064 Impact Factor (2012): 3.358 29 Jae Ho Do and Sang Dal Kim Enzymatic properties of a cellulase from Ganoderma lucidum Korea Ginseng and Tobaco Reasearch Institute, Daejeon 300-31, Korea 30 T Vinotha, N Uma Maheswari PG and Research Department of Microbiology, Sengamala Thaayar Educational Trust Women’s College, Mannargudi, Tamilnadu, India Optimization of Cellulolytic Bacteria from Cellulose Waste Materials and its Activity Accepted on: 10-04-2014; Finalized on: 31-05-2014 31 Muhammad Irfan1, Asma Safdar2, Quratulain Syed1, Muhammad Nadeem1 1Food and Biotechnology Research Centre (FBRC), PCSIR Laboratories Complex, Ferozpure road Lahore, 2Department of Zoology, Lahore College for Women University Lahore, Pakistan Isolation and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of cellulase production and activity Registered: December 2011; Accepted: 18 July 2012], [Kayıt Tarihi: Aralık 2011; Kabul Tarihi: 18 Temmuz 2012] 32 ALI, Nagham1, YAZAJI, SABAH, HAJALI, A.2 and AZMEH, M.F Optimization of cellulase production by submerged fermentation of agriculture wastes by Trichoderma spp Department of Food Science, faculty of Agriculture, Damascus University 33 M.K Bakare1, I.O.Adewale, A Ajayi3, O.O.Shonukan3 Purification and characterization of cellulase from the wild-type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens Department of Biochemistry and Microbiology, Obafemi Awolowo University, Ile-Ife, Nigeria, 10 August, 2005 34 T K GHOSE Measurement of cellulase activities Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, New Delhi-110016, India 35 Saloheimo, M., et al (1997) cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast European Journal of Biochemistry, 249(2), pp 584-591 SVTH: Nguyễn Thị Hoa - Phan Thị Oanh 57 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm ... Xuân TÓM TẮT ĐỒ ÁN Nghiên cứu phân lập sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối  Nội dung nghiên cứu: - Phân lập mô tả đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn thu đƣợc từ ruột mối - Kiểm tra định... mối khai thác enzym cellulase từ hệ vi sinh vật tƣơng ứng sống cộng sinh ruột mối hiệu quả, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ruột mối? ?? Đƣợc thực nhằm... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu phân lập vi khuẩn sinh cellulase 3.1.1 Quy trình phân lập Sau lấy mẫu mối thực trình phân lập, lựa chọn 22 chủng vi khuẩn phát triển mạnh, từ khuẩn lạc