Nghiên cứu phân lập một số chất đối chiếu từ thân hành trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l , amaryllidaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -*** NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy PGS TS Võ Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Thị Ngọc Hà Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016 -2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã ngành: 8720210 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Nguyễn Thị Ngọc Hà Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy, PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Từ khóa: Thân hành, Trinh nữ hồng cung (TNHC), Crinum latifolium, kaempferol, daucosterol Mở đầu: Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) thuốc quý lưu truyền y học dân gian, với tác dụng kháng viêm, kháng khối u, chống oxi hóa, giảm đau… Alcaloid flavonoid hai nhóm hợp chất nghiên cứu nhiều TNHC Ở Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần flavonoid thân hành TNHC Đề tài thực với mục tiêu phân lập hợp chất tinh khiết thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm cao ethyl acetat chiết từ thân hành TNHC Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nguyên liệu: Thân hành TNHC Phương pháp nghiên cứu: Xác định hàm lượng polyphenol thân hành TNHC thuốc thử Folin-ciocalteu Khảo sát quy trình chiết flavonoid tồn phần Từ cao flavonoid tồn phần, kỹ thuật sắc ký cột, kỹ thuật tinh chế để phân lập hợp chất tinh khiết Xác định cấu trúc phổ UV, NMR, MS Sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm xác định MIC cao chiết từ thân hành TNHC Kết quả: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng polyphenol thân hành TNHC thuốc thử Folin – ciocalteu Phân lập hợp chất daucosterol kaempferol từ thân hành TNHC Cao ethyl acetat chiết từ thân hành có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Kết luận: Phân lập hai hợp chất từ thân hành TNHC, nhiên hàm lượng flavonoid thân hành Cao ethyl acetat từ thân hành TNHC cho tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Master’s Thesis – Academic course: 2016 -2018 Specialty: Drug Quality control & Toxicology - Code: 8720210 ISOLATION OF REFERENCE SUBSTANCES FORM THE BULBS OF CRINUM LATIFOLIUM (L.) Nguyen Thi Ngoc Ha Supervisor: Dr Nguyen Huu Lac Thuy, Assoc Prof Dr Vo Thi Bach Hue Keywords: bulbs, Crinum latifolium, kaempferol, daucosterol Introduction: Crinum latifolium is a widely used traditional herb in Viet Nam, which has a number of other valuable biological effects such as antitumor, antioxidant, antiinflammatory, detoxification… Most studies have been focused on alkaloids and flavonoids in C latifolium However in Vietnam, there is no study about flavonoids in the bulbs of C.latifolium The aim of this study to isolate pure compounds and test for antibacterial and antifungal Materials and methods: Material: bulbs of C.latifolium Methods: determination of the total phenolic content from the bulbs of C latifolium by Folin-ciocalteu reagent Investigation of flavonoid extraction process By column chromatography, purification techniques isolate pure compounds from ethyl acetate extract Identification of structure by UV, NMR and MS Screen for antibacterial, antifungal activity and determine the MIC of the extract from the bulbs of C latifolium Results: Develop and validate procedure to determine the total phenolic content from the bulbs of C latifolium (L.) by Folin-ciocalteu reagent Daucosterol and kaempferol were isolated from the ethyl acetate extract The ethyl acetate extract showed slight activity against bacterial and fungal Conclusion: Two compounds were isolated from the bulbs of C latifolium, the results showed the content of flavonoids in the bulbs was low The ethyl acetate extract showed slight activity against bacterial and fungal i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG BIỂU x DANH MỤC SƠ ĐỒ x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) 1.2 Tổng quan flavonoid chi Crinum TNHC 1.3 Phương pháp Folin–ciocalteu xác định hàm lượng polyphenol toàn phần 1.4 Phương pháp khảo sát tác dụng kháng khuẩn kháng nấm 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên liệu 12 2.2 Vi sinh vật môi trường thử nghiệm 12 2.3 Dung mơi hóa chất 13 2.4 Thiết bị dụng cụ 13 2.5 Phương pháp nghiên cứu 14 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Xác định hàm lượng polyphenol thân hành TNHC 22 3.3 Khảo sát quy trình chiết tách flavonoid 34 3.4 Khảo sát cấu trúc phương pháp phổ nghiệm 48 3.5 Khảo sát tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 52 CHƯƠNG BÀN LUẬN 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 67 i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên Ý nghĩa tiếng Việt 13 13 Cộng hưởng từ hạt nhân C13 C-NMR H-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl acetat FC Folin-Ciocalteu HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại MeOH Methanol Methanol MHA Mueller Hinton Agar MHB Mueller Hinton Broth MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MS Mass spectrum Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu s singlet Đỉnh đơn SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng TNHC Trinh nữ Hoàng cung UV- Vis Ultraviolet - visible Tử ngoại – khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký cột chân không VS Vanilline- sulfuric acid Ethyl acetat ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nhóm flavon, flavan, chalcon Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo Euflavonoid, Isoflavonoid Neoflavonoid Hình 1.3 Cấu trúc hóa học hợp chất flavonoid TNHC Hình 2.1 Quy trình xác định MIC phương pháp pha lỗng đĩa thạch 21 Hình 3.1 Phổ UV - Vis mẫu chuẩn mẫu thử 23 Hình 3.2 Động học phản ứng mẫu chuẩn mẫu thử .24 Hình 3.3 Kết phân tích ANOVA quy trình tối ưu hóa 26 Hình 3.4 Kết đánh giá hệ số phương trình hời quy tuyến tính .26 Hình 3.5 Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hàm lượng polyphenol 27 Hình 3.6 Các thơng số tối ưu dự đoán MODDE 5.0 28 Hình 3.7 Động học phản ứng quy trình tối ưu 29 Hình 3.8 Phổ UV-Vis đánh giá độ đặc hiệu .30 Hình 3.9 Sự phụ thuộc độ hấp thu nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml) 31 Hình 3.10 Sắc ký đờ so sánh điều kiện chiết flavonoid cao n-hexan 34 Hình 3.11 Sắc ký đờ so sánh điều kiện chiết flavonoid cao cloroform 35 Hình 3.12 Sắc ký đồ so sánh điều kiện chiết flavonoid cao ethyl acetat 35 Hình 3.13 Sắc ký đờ so sánh phân đoạn EtOAc quy trình chiết flavonoid 39 Hình 3.14 Sắc ký đờ kiểm tra phân đoạn thu từ cột chân không (VLC) .41 Hình 3.15 Sắc ký đờ kiểm tra phân đoạn rửa giải than hoạt 42 Hình 3.16 Các phân đoạn sắc ký cột 45 Hình 3.17 Sắc ký đồ kiểm tra PĐ F2.6 tinh chế cột pha đảo 46 Hình 3.18 Sắc ký đờ hợp chất (1) 46 Hình 3.19 Sắc ký đờ HC-2 .46 Hình 3.20 Sắc ký đờ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất (1) (2) 47 Hình 3.21 Phổ MS hợp chất (1) .48 Hình 3.22 Phổ UV – Vis hợp chất (1) 48 Hình 3.23 Sắc ký đờ so sánh HC-1 với kaempferol chuẩn 49 Hình 3.24 Phổ MS hợp chất (2) .50 Hình 3.25 Cấu trúc daucosterol 52 Hình 3.26 Kết sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao F1 53 Hình 3.27 Kết sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phân đoạn 54 Hình 3.28 Mẫu chứng âm xác định MIC vi khuẩn (1) vi nấm (2) 55 Hình 3.29 Kết thử MIC vi khuẩn cao F1 55 Hình 3.30 Kết thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.4 56 Hình 3.31 Kết thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.5 56 Hình 3.32 Kết thử MIC vi nấm cao phân đoạn F1 56 Hình 3.33 Kết thử MIC vi nấm cao phân đoạn F1.6 56 Hình 3.34 Kết thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.7 57 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Kết khảo sát sơ thành phần hóa thực vật 22 Bảng 3.2 Pha mẫu xác định bước sóng cực đại .23 Bảng 3.3 Pha mẫu đo động học phản ứng 24 Bảng 3.4 Xác định mức giới hạn yếu tố khảo sát .25 Bảng 3.5 Kết 15 thí nghiệm thiết kế tối ưu hóa .25 Bảng 3.6 Kết lặp lại lần quy trình tối ưu 28 Bảng 3.7 Độ hấp thu động học phản ứng quy trình tối ưu 29 Bảng 3.8 Pha mẫu đo độ đặc hiệu 29 Bảng 3.9 Kết đánh giá tính tuyến tính mẫu chuẩn 30 Bảng 3.10 Kết độ lặp lại 32 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ xác trung gian 32 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ .33 Bảng 3.13 Hiệu suất chiết (%) 36 Bảng 3.14 So sánh cao ethyl acetat quy trình chiết flavonoid .39 Bảng 3.15 Các phân đoạn qua VLC 41 Bảng 3.16 Các phân đoạn rửa giải than hoạt 42 Bảng 3.17 Các phân đoạn qua sắc ký cột 44 Bảng 3.18 So sánh phổ 13C- NMR hợp chất (2) tài liệu 51 Bảng 3.19 Kết định tính kháng khuẩn kháng nấm .52 Bảng 3.20 Kết xác định MIC mẫu có hoạt tính 55 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng quát quy trình chiết flavonoid (khơng tách alcaloid) 17 Sơ đờ 3.1 Quy trình chiết flavonoid khơng tách alkaloid 37 Sơ đờ 3.2 Quy trình chiết cao flavonoid tồn phần (có tách alcaloid) .38 Sơ đờ 3.3 Quy trình chiết cao ethyl acetat F1 40 Sơ đờ 3.4 Quy trình tinh chế cao F1 (loại tạp than hoạt) 43 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-2 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-3 Phụ lục Dữ liệu đo độ hấp thu quy trình tối ưu Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-4 Phụ lục Dữ liệu thử tính tuyến tính mẫu chuẩn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-5 Phụ lục Dữ liệu thử độ lặp lại Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Dữ liệu thử độ PL-6 Phụ lục Dữ liệu thử độ xác trung gian Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-7 Phụ lục Phân tích kết thực tế kết tối ưu hóa dự đốn t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances Variable Variable Mean 457,38292 464,321 Variance 160,17646 4,85E-27 Observations 3 Hypothesized Mean Difference df t Stat -0,949513 P(T