Nghiên cứu phân lập và tinh chế notoginsennosid r1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT THÚY NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT THÚY NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin cảm ơn PGS.TS Đồn Cao Sơn- Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo sau đại học, mơn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập trường trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, ThS Trần Thị Thu Trang người giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách thuận lợi Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ động viên suốt trình học tập vừa qua Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Việt Thúy DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril 13 C-NMR 13-Carbon nuclear magnetic resonance C18 Octadecyl silance silica CC Column Chromatography DAD Diod Array Detector Detector chuỗi (dãy) diốt phát quang DĐVN Dược điển Việt Nam ESI Electro Spray Ionisation Ion phun hóa điện tử FTIR Fourier Transform Infrared Spectrophotometry Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier G Ginsenosid Proton nuclear magnetic resonance H-NMR HPLC High Performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IR Infrared Spectrophotometry Phổ hấp thụ hồng ngoại PHPLC Preparative high performanceliquid chromatography Sắc ký lỏng điều chế LC-MS Liquid chromatography - Mass Spectometry Sắc ký lỏng – khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Mass Spectometry Phổ khối NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân N-R1 Notoginsenosid R1 PA Pure Analysis Đạt tinh khiết phân tích RP Reversed phase Pha đảo Rf Giá trị Rf RSD Realative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SĐK Số đăng ký SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng UFLC Ultra Fast Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu USP Dược điển Mỹ UV-VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc TW VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .3 1.1 Vài nét chất đối chiếu 1.1.1 Vài nét chất chuẩn 1.1.2 Khái quát thiết lập chất chuẩn từ dược liệu 1.2 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.2.1 Dược liệu Tam thất 1.2.2 Nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất: 1.2.3 Tổng quan nhóm hoạt chất saponin triterpenoid nhóm Damaran 1.2.4 Tổng quan notoginsengnosid R1 1.2.4.1 Đặc điểm tính chất 1.2.4.2 Tác dụng dược lý notoginsenosid R1: 1.2.5 Vài nét Rg1 1.2.6 Vài nét Rb1 1.3 Tổng quan phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế 11 1.3.1 Vài nét chiết xuất dược liệu 11 1.3.2 Vài nét phân lập tinh chế 11 1.4 Tổng quan số phƣơng pháp hoá lý sử dụng nghiên cứu đề tài .12 1.4.1 Sắc ký lớp mỏng .12 1.4.1.1 Nguyên tắc 12 1.4.1.2 Các đại lượng đặc trưng 12 1.4.1.3 Ứng dụng 13 1.4.2 Sắc ký lỏng hiệu cao 14 1.4.2.1 Nguyên tắc 14 1.4.2.2 Một số đại lượng đặc trưng trình sắc ký 14 1.4.2.3 Ứng dụng 15 1.4.3 Phổ khối) 16 1.4.3.1 Nguyên tắc 16 1.4.3.2 Ứng dụng 16 1.4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 17 1.4.4.1 Nguyên tắc 17 1.4.4.2 Các đại lượng đặc trưng 17 1.4.4.3 Ứng dụng 18 1.4.5 Sắc ký cột 18 1.4.5.1 Cột 18 1.4.5.2 Hóa chất dùng làm cột .18 1.4.5.3 Dung môi 19 1.4.5.4 Ứng dụng: 19 1.4.6 Đo nhiệt độ nóng chảy 19 1.4.7 Quang phổ tử ngoại khả kiến 20 1.4.8 Phương pháp đo phổ hồng ngoại .20 1.4.8.1 Nguyên tắc 20 1.4.8.2 Ứng dụng 21 1.5 Tình hình chiết xuất, phân lập tinh chế notoginsenosid R1 21 1.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 21 1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước: 22 1.6.Vài nét phân tích định lƣợng notoginsenosid R1: .26 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƢƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .30 2.1 Nguyên liệu .30 2.2 Phƣơng tiện .30 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 30 2.2.2 Dung mơi, hóa chất, chất chuẩn 31 2.3 Nội dung nghiên cứu 31 2.3.1 Phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu saponin toàn phần tam thất 31 2.3.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng đánh giá độ tinh khiết chất chiết 32 2.3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC định lượng notoginsenosid R1 tinh chế 32 2.3.4 Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC xác định giới hạn tạp chất liên quan notoginsenosid R1 tinh chế .32 2.3.5 Đưa dự thảo tiêu chuẩn cho chất chuẩn phòng thí nghiệm notoginsenosid R1 32 2.3.6 Áp dụng định tính, định lượng notoginsenosid R1 dược liệu tam thất lưu hành thị trường 32 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .32 2.4.1 Phương pháp phân lập tinh chế notoginsenosid R1từ nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất 32 2.4.1.1.Phân lập:…………………………………………………………….30 2.4.1.2 Tinh chế: 33 2.4.2 Xác định cấu trúc chất notoginsenosid R1 tinh chế 34 2.4.3 Định tính đánh giá độ tinh khiết chất notoginsenosid R1 tinh chế 34 2.4.4 Xác định hàm lượng notoginsenosid R1 tinh chế .34 2.4.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 34 2.4.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích 34 2.4.5 Sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế làm chuẩn làm việc tiến hành định tính định lượng notoginsenosid R1 dược liệu tam thất theo DĐTQ 2010 .36 2.4.5.1 Định tính notoginsenosid R1 dược liệu tam thất 36 2.4.5.2 Định lượng notoginsenosid R1 dược liệu tam thất phương pháp HPLC .37 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 37 2.4.7 Phương pháp đánh giá kết 37 CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 38 3.1 Xây dựng qui trình phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất 38 3.1.1 Định lượng hàm lượng notoginsenosid R1 nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất .38 3.1.2 Xây dựng quy trình phân lập notoginsenosid R1 .39 3.1.2.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân lập 39 3.1.2.2 Quy trình phân lập notoginsenosid R1 cột silicagel 42 3.1.2.3 Kiểm tra độ lặp lại quy trình phân lập .51 3.1.3 Tinh chế 51 3.1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh chế 51 3.1.3.2 Quy trình tinh chế 52 3.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế đƣợc 57 3.2.1 Tính chất: Sản phẩm dạng bột vơ định hình, màu trắng 57 3.2.2 Nhiệt độ nóng chảy: Chất tinh chế sấy khô 50C đến khối lượng 63 3.2.3 Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến: 57 3.2.4 Phổ hồng ngoại 57 3.2.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 59 3.2.6 Phổ khối 62 3.3 Đánh giá độ tinh khiết notoginsenoside R1 tinh chế đƣợc 63 3.3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp để định tính, định lượng otoginsenosid R1 tinh chế HPLC với detector DAD 63 3.3.1.1 Lựa chọn phương pháp 63 3.3.1.2.Thẩm định phương pháp phân tích .64 3.3.1.3 Định tính, định lượng notoginsenosid R1 chất tinh chế phương pháp HPLC thẩm định 70 3.4 Xác định giới hạn tổng cộng tạp chất liên quan notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc 72 3.4.1 Xây dựng phương pháp 72 3.4.2 Thẩm định phương pháp 73 3.4.3 Kết .77 3.5 Áp dụng định tính, định lƣợng notoginsenosid R1 dƣợc liệu tam thất 78 3.5.1 Định tính phương pháp SKLM 78 3.5.1.1 Điều kiện sắc ký 78 3.5.1.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử .78 3.5.1.3 Tiến hành 78 3.5.1.4 Kết .79 3.5.2 Định tính, định lượng phương pháp HPLC với detector DAD .79 3.5.2.1 Điều kiện sắc ký 79 3.5.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử .80 3.5.2.3 Kết .80 3.6.1 Phân lập tinh chế ginsenosid Rg1 .83 3.6.1.1.Quá trình phân lập tinh chế ginsenosid Rg1 84 3.6.1.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 cắn E .85 3.6.2 Phân lập tinh chế ginsenosid Rb1 .86 3.6.2.1.Quá trình phân lập tinh chế G-Rg1 .86 3.6.2.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 cắn F .87 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 89 4.1 Về quy trình phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất 89 4.2 Về xác định cấu trúc nhận dạng chất tinh chế đƣợc 89 4.3 Về định tính, định lƣợng, giới hạn tạp chất liên quan notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc phƣơng pháp HPLC 89 4.4 Về việc sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lƣợng notoginsenosid R1 dƣợc liệu tam thất 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Tam thất Tam thất Tam thất Tam thất Tam thất 10 0,6082 401926 0,984 6,357 0,6092 411797 1,007 0,6050 402507 0,991 6,446 0,5967 302257 0,755 7,085 0,6066 308190 0,757 0,6020 307436 0,761 7,142 0,5989 559787 1,392 6,148 0,6003 572768 1,421 0,5992 572693 1,424 6,220 0,6090 463867 1,135 5,826 0,5861 441378 1,122 0,5979 463876 1,156 5,956 0,5913 548461 1,382 6,365 0,6037 562095 1,387 0,5941 568257 1,425 0,994 0,757 1,413 1,137 1,398 6,543 7,163 6,267 5,824 6,368 6,449 7,130 6,211 5,869 6,393 6,446 Nhận xét: - Hàm lượng N-R1 tìm thấy mẫu phân tích khác nhau, mẫu chứa nhiều R1 mẫu (1,413%) mẫu chứa R1 mẫu (0,306%) - Hàm lượng ginsenoside tồn phần (tổng R1+Rg1+Rb1) mẫu (5,424%) nhiều mẫu (7,990%) 3.6 Các kết khác 3.6.1 Phân lập tinh chế ginsenosid Rg1 Sản phẩm phụ sau trình phân lập thô N-R1 thu phân đoạn CH2Cl2 methanol - nước ( 80 : 10 : ) đem tinh chế cột pha đảo C-18, dung môi aceton - nước với tỷ lệ khác thu sản phẩm cắn E với hàm lượng 95% Cắn E có thời gian lưu, phổ UV-VIS trùng với G-Rg1 (xác định HPLC) 83 3.6.1.1.Quá trình phân lập tinh chế ginsenosid Rg1 - Quy trình Nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất (25g) Cột SiO2 (63-200µm), CH2Cl2 – MeOH - H20 ; (150 : 10 : 1; 100 : 10 : 1; 80 : 10 : 1; 60 : 10 : 1; 40 : 10 : 1; 20 : 10 : 1) Phân đoạn 80 : 10 : Thu hồi dung môi cắn (13,64g) Cột Silicagel RP-18 (Merck) (140 µm) Aceton – H2O Phân đoạn có chứa Rg1 Thu hồi dung mơi Cắn E (Rg1 tinh khiết, m= 8,32 g, hàm lượng 98,13%) Hình 3.37: Sơ đồ phân lập tinh chế ginsenosid Rg1 đề tài - Phát có mặt G-Rg1 bình hứng SKLM, điều kiện sắc ký mô tả mục 2.4.1, sắc ký pha đảo, hệ dung môi Dung dịch đối chiếu : G-Rg1 methanol nồng độ mg/ml Kết quả: Phân đoạn xác định có mặt G-Rg1 aceton 30% Từ bình đến khơng có vết G-Rg1 Bình 10 đến bình 13 có vết G-Rg1 đậm vết tạp mờ Từ bình 14 đến bình 36 có vết G-Rg1 đậm Từ bình 37 trở khơng vó vết G-Rg1 Gộp dung dịch bình từ 14 đến 36, cất thu hồi dung mơi cắn E (chính G-Rg1 tinh khiết) 84 Hình 3.38: Sắc ký đồ xác định có mặt G-Rg1 bình hứng trình tinh chế 3.6.1.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 cắn E Hàm lượng G-Rg1 cắn E xác định phương pháp HPLC mô tả mục 2.4.1 Kết quả: Hàm lượng G-Rg1 cắn E xác định 98,19% tính theo nguyên trạng, thể bảng 3.20 Bảng 3.20: Kết xác định hàm lượng Rg1 cắn E Chuẩn G-Rg1 rT S C mg/ml 26,44 1289588 0,297 Mẫu thử m, mg % G-Rg1 T1 26,409 1285122 0,295971 12,08 98,00 T2 26,475 1200194 0,276412 11,24 98,37 TB 98,19 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử: 85 50 25 25 0 10 20 30 40 50 0.0 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp Rg1/26.409/1285122 50 mAU 203nm4nm (1.00) 75 Rb1/44.835/820662 R1/23.963/613633 Rg1/26.440/1289588 mAU 75 203nm4nm (1.00) 25.0 50.0 Sắc ký đồ mẫu thử cắn E Hình 3.39: Sắc ký đồ định lượng Rg1 cắn E 3.6.2 Phân lập tinh chế ginsenosid Rb1 Sản phẩm phụ sau trình phân lập thô N-R1 thu phân đoạn CH2Cl2 methanol - nước ( 20 : 10 : ) đem tinh chế cột pha đảo C-18, dung môi aceton - nước với tỷ lệ khác thu sản phẩm cắn F với hàm lượng 95% Cắn F có thời gian lưu trùng với G-Rb1 (xác định HPLC) 3.6.2.1.Quá trình phân lập tinh chế G-Rg1 - Quy trình Ngun liệu Saponin tồn phần tam thất (25g) Cột SiO2 (63-200µm), CH2Cl2 – MeOH - H20 ; 150 : 10 : 1; 100 : 10 : 1; 80 : 10 : 1; 60 : 10 : 1; 40 : 10 : 1; 20 : 10 : 1) Phân đoạn 20 : 10 : Thu hồi dung môi cắn (18,33g) Cột Silicagel RP-18 (Merck) (140 µm), Aceton – H2O Phân đoạn có chứa Rb1 Thu hồi dung môi Cắn F (Rb1 tinh khiết, m= 10,23 g, hàm lượng 96,49%) Hình 3.40: Sơ đồ phân lập tinh chế ginsenosid Rb1 đề tài 86 - Phát có mặt G-Rb1 bình hứng SKLM, điều kiện sắc ký mô tả mục 2.4.1, sắc ký pha đảo hệ dung môi Dung dịch đối chiếu: G-Rb1 methanol nồng độ mg/ml Kết quả: Phân đoạn xác định có mặt G-Rb1 aceton 50% Từ bình đến 40 khơng có vết G-Rb1 Bình 41 đến bình 43 có vết G-Rb1 đậm vết tạp mờ Từ bình 44 đến bình 59 có vết G-Rb1 đậm Từ bình 60 trở có vết G-Rb1 mờ vết tạp mờ Gộp dung dịch bình từ 44 đến 59, cất thu hồi dung mơi cắn F (chính G-Rb1 tinh khiết Hình 3.41: Sắc ký đồ xác định có mặt G-Rb1 bình hứng giai đoạn tinh chế 3.6.2.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 cắn F Hàm lượng G-Rb1 cắn F xác định phương pháp HPLC mô tả mục 2.4.1 Kết quả: Hàm lượng G-Rb1 cắn E xác định 96,49% tính theo nguyên trạng, thể bảng 3.19 Bảng 3.21: Kết định lượng G-Rb1 cắn F Chuẩn G-Rb1 rT S C mg/ml 44,835 820662 0,27966 Mẫu thử m, mg % G-Rb1 T1 44,893 793856 0,270525 11,21 96,53 T2 44,875 839227 0,285986 11,86 96,45 TB 96,49 87 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử thể hình sau : Rb1/44.893/793856 50 mAU 60 203nm4nm (1.00) Rb1/44.835/820662 R1/23.963/613633 Rg1/26.440/1289588 mAU 75 203nm4nm (1.00) 50 40 30 25 20 10 0 -10 10 20 30 40 50 0.0 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp 25.0 50.0 Sắc ký đồ mẫu thử cắn F Hình 3.42: Sắc ký đồ định lượng Rb1 cắn F 88 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 4.1 Về quy trình phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất Notoginsenosid R1 thành phần nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất nhiên hàm lượng thấp (chỉ khoảng 5%) thành phần khác G-Rg1, Rb1 cao nhiều (trên 35%) trình phân lập N-R1 từ nguyên liệu ban đầu không dễ dàng Tuy nhiên quy trình phân lập tinh chế mà đề tài đưa tương đối đơn giản với hóa chất dung mơi phổ biến, sẵn có, dễ dàng áp dụng phòng thí nghiệm Với ngun liệu ban đầu dễ kiếm (mua thị trường), với giá thành thấp khối lượng (50g), chúng tơi tinh chế lượng chất N-R1 tinh khiết 2,05g (hiệu suất tồn q trình phân lập tinh chế 57%) với hàm lượng 97,32% tính theo nguyên trạng Đây nguồn cung cấp chuẩn N-R1 cho thị trường nước quốc tế vốn khan chất chuẩn N-R1, góp phần nâng cao cơng tác kiểm nghiệm quản lý chất lượng dược liệu tam thất chế phẩm đơng dược có chứa tam thất thị trường Trong trình phân lập tinh chế N-R1 thu sản phẩm phụ G-Rg1, Rb1 Các sản phẩm phụ đem tinh chế để thu chất tinh khiết có hàm lượng cao (trên 95%) khối lượng lớn Hai chất chuẩn khơng góp phần kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu tam thất mà kiểm tra, đánh giá lồi dược liệu khác thuộc họ Nhân sâm vốn phong phú, đa dạng dễ gây nhầm lẫn cho người dùng 4.2 Về xác định cấu trúc nhận dạng chất tinh chế đƣợc Bằng phương pháp phân tích kỹ thuật cao với phương tiện máy móc đại, xác phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối (MS) phân tích thơng số phổ đặc trưng cho chất chiết đồng thời kết hợp với việc phân tích thơng số vật lý tính chất, nhiệt độ nóng chảy khẳng định cơng thức cấu tạo công thức phân tử chất phân lập tinh chế notoginsenosid R1 4.3 Về định tính, định lƣợng, giới hạn tạp chất liên quan notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc phƣơng pháp HPLC HPLC kỹ thuật phân tích đại áp dụng rộng rãi phân tích kiểm nghiệm với nhiều ưu điểm độ xác cao, giới hạn phát 89 thấp, độ lặp lại tốt, bị ảnh hưởng mẫu Phương pháp HPLC mà chúng tơi đưa để định tính, định lượng, xác định giới hạn tạp chất liên quan N-R1 phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Quy trình chuẩn bị mẫu pha động đơn giản, hóa chất dung mơi dễ kiếm, sẵn có phổ biến Thiết bị HPLC hầu hết trang bị Kết thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp HPLC đưa có độ đặc hiệu, độ lặp lại cao, đảm bảo kết độ cho kết xác độ tin cậy cao Nồng độ định lượng nằm khoảng tuyến tính khảo sát, có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ diện tích pic Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng N-R1 tinh chế xác định hàm lượng NR1 tinh chế 97,39%, hàm lượng tạp 1,333% Chất N-R1 tinh chế đáp ứng yêu cầu chất chuẩn phòng thí nghiệm, ứng dụng vào thực tế kiểm nghiệm tam thất chế phẩm đơng dược có chứa dược liệu Hiện nay, giá thành chuẩn N-R1 cao phải đặt mua từ nước với số lượng hạn chế Với sản phẩm tinh chế được, tiến hành thiết lập chuẩn làm việc N-R1, cung cấp chất chuẩn thị trường đáp ứng nhu cầu thực tế chất chuẩn N-R1 trung tâm kiểm nghiệm công ty dược đảm bảo chất chuẩn cung cấp cách nhanh nhất, giá thành hợp lý chất lượng chất chuẩn không thua so với chất chuẩn nước 4.4 Về việc sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lƣợng notoginsenosid R1 dƣợc liệu tam thất Sản phẩm đề tài chúng tơi sử dụng làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính N-R1 dược liệu Tam thất theo chuyên luận Tam thất DĐTQ 2010 Kết thu tin cậy, góp phần đánh giá chất lượng dược liệu tam thất mua thị trường 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài nghiên cứu thu kết sau: Đã xây dựng quy trình phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần tam thất, thu chất R1 tinh khiết có hàm lượng 95% Đã tiến hành xác minh cấu trúc notoginsenosid R1 tinh chế dựa phân tích thơng số hóa lý tính chất, nhiệt độ nóng chảy phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phương pháp phân tích khối phổ, phương pháp quang phổ hồng ngoại Kết thực nghiệm khẳng định công thức phân tử cấu trúc notoginsenosid R1 tinh chế phù hợp với kết nghiên cứu công bố Đã xây dựng thẩm định (về mặt Độ đặc hiệu, Độ tuyến tính, Độ đúng, Độ phù hợp hệ thống, Độ lặp lại, LOD LOQ) phương pháp HPLC để định tính, định lượng notoginsenosid R1 tinh chế Với phương pháp xác định hàm lượng notoginsenosid R1 tinh chế 97,32% Đã xây dựng thẩm định (về mặt Độ đặc hiệu, LOD) phương pháp HPLC để xác định giới hạn tổng tạp chất liên quan notoginsenosid R1 tinh chế Với phương pháp xác định giới hạn tổng tạp chất liên quan notoginsenosid R1 không 2,0% Đã sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng notoginsenosid R1 dược liệu tam thất lưu hành thị trường Kết 10 mãu dược liệu tam thất đem khảo sát có chứa notoginsenosid R1 với hàm lượng từ 0,306% - 1,413% tính theo nguyên trạng Đã phân lập tinh chế ginsenosid Rg1, định lượng hàm lượng ginsenosid Rg1 98,13% tính theo nguyên trạng Đã phân lập tinh chế ginsenosid Rb1, định lượng hàm lượng ginsenosid Rb1 96,49% tính theo nguyên trạng 91 KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu thêm để tăng hiệu suất chiết áp dụng quy mô lớn để phục vụ công tác kiểm tra đánh giá chất lượng dược liệu thuốc đông dược Cần tiếp tục tiến hành đánh giá đầy đủ chất chuẩn notoginsenosid R1, Rg1, Rb1 theo nguyên tắc việc thiết lập chất chuẩn 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2: Phân tích dụng cụ, Nhà xuất Y học Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm thuốc độc chất, Nhà xuất Y học Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau đại học, Trường Đại học dược Hà Nội Bộ khoa học cơng nghệ, Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC 10/06-10 (2007), Nghiên cứu chiết tách, tinh chế số hợp chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu, tr.13-15, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Hà Nội Bộ môn dược liệu, Trường Đại học dược Hà Nội (2007), Bài giảng dược liệu, tập 1, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr 158-179 Bộ Y tế (2006), Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu sắc ký lỏng cao áp với kỹ thuật điểm vân tay, Viện Dược liệu, Hà Nội Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, tr 320-325 10 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học 11 Nguyễn Thị Thúy, Đào Thị Hồng Bích, Nguyễn Việt Anh, Vũ Đức Lợi, Bùi Thanh Tùng, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Hữu Tùng (2016), Nghiên cứu thành phần điều chế Phytosome Saponin toàn phần củ Tam thất (Panax Notoginseng ) trồng Tây Bắc Việt Nam, Tạp chí khoa học Đại học quốc gia Hà Nội: Khoa học Y Dược, tập 32, số 1/2016(18-24) 12 Trần Thị Thu Uyên, Hà Diệu Ly, Lê Thị Hồng Vân, Dương Hồng Tố Quyên, Nguyễn Minh Đức (2014), Điều chế thiết lập chuẩn Notoginsenoside-R1 từ sâm Việt Nam, Tạp chí dược liệu, tập 19 số 6/2014 13 Viện dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1&2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội 14 Viện dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội 15 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2006), Thủ tục Thiết lập Hiệu chuẩn chất chuẩn, ống chuẩn độ 16 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2006), Danh mục Chất chuẩn cập nhật 22/8/2016 17 Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh (2016), Danh mục Chất chuẩn Tiếng Anh 18 Bo Ma, Xiangbao Meng, Jing Wang, Jing Sun, Xiaoyu Ren, Meng Qin, Jie Sun, Guibo Sun, Xiaobo Sun (2014), “Notoginsenoside R1 attenuates amyloid-βinduced damage in neurons”, International Immunopharmacology 22 (2014), (151– 159) 19 Ding-Fung Toh, Lee-Sun New, Hwee-Ling Koh, Eric Chun-Yong Chan (2009), "Ultra-high performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (UHPLC/TOFMS) for time-dependent profiling of raw and steamed Panax notoginseng", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 52 (2010), (43–50) 20 Hiromichi Matsuura, Ryoji Kasai, Osamu Tanaka, Yuh-jchiro Saruwatari, Tohru Fuwa and Jun Zhou (1983), “Futher Studies on Dammarane-Saponin of Sanchi-Ginseng”, Chem Pharm Bull, 31(7), (2281-2287) 21 Hong-Sheng Zhang, Sheng-Qi Wang (2006), “Notoginsenoside R1 inhibits TNF-α-induced fibronectin production in smooth muscle cells via the ROS/ERK pathway”, Free Radical Biology & Medicine40 (2006), (1664–1674) 22 Hong-Sheng Zhang, Sheng-Qi Wang (2006), “Notoginsenoside R1 from Panax notoginseng inhibits TNF-a-induced PAI-1 production in human aortic smooth muscle cells”, Vascular Pharmacology 44 (2006), (224 – 230) 23 Hongxiang Sun, Zhigang Yang, Yiping Ye (2006), "Structure and biological activity of protopanaxatriol-type saponins from the roots of Panax notogins", International Immunopharmacology (2006), (14– 25) 24 Jing Wang, Chun-ming Liu, Li Li and He-long Bai (2010), "Isolation of Four High-purity Dammarane Saponins from Extract of Panax notoginseng by Centrifugal Partition Chromatography Coupled with Evaporative Light Scattering Detection in One Operation", Phytochem Anal 2011, 22, (263–267) 25 J.B Wan, C.M Lai, S.P Li, M.Y Lee, L.Y Kong, Y.T Wang (2005), "Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41 (2006), (274–279) 26 J.B Wan, F.Q Yang, S.P Li, Y.T Wang, X.M Cui (2006), "Chemical characteristics for different parts of Panax notoginseng using pressurized liquid extraction and HPLC-ELSD", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41 (2006) (1596–1601) 27 J B Wan, Q W Zhang, W C Ye, Y T Wang (2007), “Quantiffication and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins from Panax notoginseng with macroporous resins”, Separation and Purification Technology, 60 , 2008, (198–205) 28 Jian – bo Wan, Peng Li, Ruo – Lin Yang, Qing – Wen Zhang & Yi – Tao Wang (2012), “Separation and Purification of Saponins from Panax Notoginseng by preparative high – performance liquid chromatography”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, volume 36, 2013, Issue (406-417) 29 Jian-Qing Ruan, Weng-Im "Characterization of Metabolism Leong, Ru Yan, Yi-Tao Wang (2010), and in Vitro Permeability Study of Notoginsenoside R1 from Radix Notoginseng", J Agric Food Chem 2010, 58, (5770–5776) 30 Jun Zhou, Ming-zhu Wu, Shigenori Taniyashu, Hiromichi Besso, Osamu Tanaka, Yuichiro Sauruwatari, Tohru Fuwa(1981), “Damarane-Saponins of SanchiGinseng, Roots of Panax notoginseng (Burk) F.H Chen (Araliaceae): Structure of New Saponins, Notoginsenoside-R1 and –R2 and Identification of GinsenosidesRg2 and –Rh1”, Chem Pharm Bull., 29, (2844-2850) 31 Kaunda Joseph Sakah, Tao Wang, Lili Liu, Yue Chen, Lifeng Han, Yi Zhang (2013), “Eight darmarane-type saponins isolated from the roots of Panax notoginseng”, Acta Pharmaceutica Sinica B 32 Lie Li, Jin-lan Zhang, Yu-xin Sheng, De-an Guo, Qiao Wang, Hong-zhu Guo (2005), " Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high-performance liquid chromatography-UV method", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 38 (2005) , (45–51) 33 Li-feng Han, Kaunda Joseph Sakah, Li-li Liu, Agyemang Kojo, Tao Wang, Yi Zhang (2014), “Saponins from Roots of Panax notoginseng”, Chinese Herbal Medicine (CHM) ISN 1674-1384, 2014, 6(2), (159-163) 34 Nozomi Komakine, Mamoru Okasaka, Yoshihisa Takaishi, Kazuyoshi Kawazoe, Kotaro Murakami, Yoshihide Yamada (2005), “New dammaranetypesaponin from roots of Panax notoginseng”, J Nat Med (2006) 60,(135–137) 35 Ping Zhao, Yu-Qing Liu, Chong-Ren Yang (1995), “Minor dammarane saponins from Panax notoginseng”,Phytochemisrry, Vol 41, No 5, (1419-1422), 1996 36 Ping Su, ShijingDu, HangLi, ZhiLi, WenfengXin, WenshengZhang (2016), “Notoginsenoside R1 inhibits oxidized low-density lipoprotein induced inflammatory cytokines production in human endo the lialEA.hy926 cells”, European Journal of Pharmacology 770 (2016), (9-15) 37 Peng -Ying Liao, Dong Wang, Ying- Jun Zhang, Chong- Ren Yang (2008), “Dammarane – Type Glycosides from Steamed Notoginseng”, Journal of Agricultural and food chemistry, 56,(1751-1756) 38 Qizhen Du, Gerold Jerz, Reiner Waibel, Peter Winterhalter (2003),” Isolation of dammarane saponin from Panax notoginseng by high-speed counter – current chromatography”, Journal of Chromatography A, 1008, (173-180) 39 Satyajit D.Sarker, Zahid Latif, Alexander I Gray (2006), “Natural products isolation”, Humana Press Inc Totowa, New Jersey, second edition 40 The People of Republic of China Pharmacopoeia 2010, volume I 41 The United State Pharmacopoeia 38 42 The Bristish Pharmacopoeia 2014 43 Ting Wang, Daqian Wan, Lei Shao, Jiezhi Dai, Chaoyin Jiang (2105), “Notoginsenoside R1 stimulates osteogenic function in primary osteoblasts via estrogen receptor signaling”, Biochemical and Biophysical Research Communications 466 (2015) , (232-239) 44 Wei Guang Ma, Masanori Mizutani, Karl Egil Malrerud, Shao Long Lu, Bertrand Duccrey, Satoshi Tahara (1999), “Saponins from the roots of Panax notoginseng”, Phytochemistry 52, (1133-1139) 45 W.J.Zhang, A Fabry, J Wojta, B.R Binder (1995), “Effect of Notoginsenoside R1 on the Synthesis of Components of the Fibrinolytic System in Cultured Human Pulmonary Artery Endothelial Cells and Human Skin Microvascular Endothelial Cells”, Fibrinolysis (1995) 9, Suppl 1, (193-199) 46 Xue – Li Cao, Yu Tian, Tian – You – Zhang, Quing – Hui Liu, Li – Jun Jia & Yoichiro Ito (2002), “Separation of Dammarane – saponins from Notoginseng, Root of Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen, by HSCCC Coupled with Evaporative Light Scattering Detector”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, volume 26, 2013, Issue 9-10, (1579-1591) 47 Yi Liu, Zhen Lin, Jing Guo, Jianzhi Chen, Gang Wu (2016), “Effect of notoginsenoside r1 on osteoblastogenesis in vitro”, Journal of Orthopaedic Translation (2016) 7, (76-81), 48 Y.Tsuda (2004), “Isolation of natural products”, H.E.J Research Institute of Chemistry, University of Karachi, Karachi 75270, Pakistan ... nguyên liệu saponin toàn phần tam thất để làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm với mục tiêu: - Phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu cao tam thất Xác định cấu trúc, nhận dạng chất. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT THÚY NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC... có chất chuẩn nhằm bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ cơng tác kiểm tra quản lí chất lượng dược liệu Tam thất, tiến hành đề tài: Nghiên cứu phân lập tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên