Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành dược phẩm Việt Nam, việc mua bán, trao đổi dược liệu phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe và sản xuất chế phẩm đông dược ngày càng nhiều. Tuy nhiên, hệ thống quản lý và kiểm tra chất lượng dược liệu của nước ta còn nhiều hạn chế và chưa được các cơ quan có thẩm quyền quan tâm đứng mức. Vì vậy, việc xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đưa chúng vào các tài liệu là cơ sở pháp lý của việc kiểm nghiệm như Dược điển Việt Nam là rất cần thiết. Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài, ăn không tiêu, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng 1. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây Khổ sâm cho lá đã khẳng định các diterpen thuộc nhóm entkauran có tác dụng chống ung thư và chống viêm rất mạnh 21. Trong DĐVN IV đã có chuyên luận về dược liệu Khổ sâm cho lá. Tuy nhiên, trong chuyên luận chưa có tiêu chí về định tính, định lượng entkauran 3. Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường”. Với 3 mục tiêu: Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá. Chiết xuất, phân lập 01 entkauran chính trong Khổ sâm cho lá dùng làm chất đối chiếu trong định tính, định lượng. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng entkauran phân lập được trong dược liệu Khổ sâm cho lá.

TRẦN THỊ HẰNG AN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

TRẦN THỊ HẰNG AN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Hoàng Tuấn

2 TS Phương Thiện Thương

Phương Thiện Thương, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho

tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược liệu đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài; các anh, chị trong khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2013

Sinh viên

TRẦN THỊ HẰNG AN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương I TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố, sinh thái 3

1.1.3 Cách trồng 3

1.1.4 Thu hái và chế biến 3

1.2 Thành phần hóa học 3

1.2.1 Các diterpenoid 4

1.2.2 Các alkaloid 5

1.2.3 Các flavonoid 6

1.2.4 Các triterpenoid 7

1.2.5 Các steroid 7

1.3 Tác dụng dược lý 8

1.3.1 Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn 8

1.3.2 Tác dụng chống viêm 8

1.3.3 Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư 8

1.3.4 Tác dụng ức chế SIRT1 9

1.3.5 Tác dụng trên tế bào tạo xương 9

1.4 Công dụng 10

1.4.1 Công dụng 10

1.5.1 Định tính 11

1.5.2 Chất chiết được trong dược liệu 12

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên vật liệu 13

2.1.2 Hóa chất và dung môi 14

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Định tính bằng phương pháp hóa học 15

2.3.2 Chiết xuất, phân lập 15

2.3.3 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 01 ent-kauran diterpenoid đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá 16

2.3.4 Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả 18

Chương III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 19

3.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 19

3.1.1 Định tính alkaloid 19

3.1.2 Định tính flavonoid 19

3.1.3 Định tính coumarin 20

3.1.4 Định tính tanin 20

3.1.5 Định tính saponin 21

3.1.6 Định tính glycosid tim 21

3.1.7 Định tính chất béo, sterol, caroten 22

3.1.8 Định tính acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid, acid amin 23

3.2 Chiết xuất, phân lập 24

3.2.1 Chiết xuất 24

3.3 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng chất CT-1 từ lá và cành cây

Khổ sâm cho lá 29

3.3.1 Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 29

3.3.2 Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 31

3.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng chất CT-1 trong dược liệu Khổ sâm cho lá bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 32

3.4 Bàn luận 38

3.4.1 Định tính các nhóm chất chính 38

3.4.2 Định tính và định lượng hoạt chất CT-1 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang

Bảng 1.1: Một số ent -kauran phân lập được từ C tonkinensis 4 Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng 13 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Khổ sâm cho lá 23 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR chất CT-1 28 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 33 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 34

Hình 3.5: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 35 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36 Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD 36 Bảng 3.8: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu lá và cành

Khổ sâm cho lá

37

Trang

Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) 2

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on 4 Hình 1.3: Một số diterpen phân lập được từ Khổ sâm cho lá 5 Hình 1.4: Các flavonoid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7 Hình 1.5: Các steroid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7 Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá 13 Hình 3.1: Sơ đồ chiết và phân đoạn cao lá Khổ sâm cho lá 25

Hình 3.4: Sắc ký đồ chất CT-1, lá và cành cây Khổ sâm cho lá 30

Hình 3.5: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1 (Hình A), lá Khổ sâm cho lá

(Hình B), cành Khổ sâm cho lá (Hình C)

32

Hình 3.6: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 34

EtOAC Ethyl acetat

UV Phổ tử ngoại (Ultra violet)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS Phổ khối (Mass Spectroscopy)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

DĐVN Dược điển Việt Nam

M Khối lượng phân tử ( Mass)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard devition) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography) RAW 264,7 Dòng tế bào bạch cầu mono của chuột bị bệnh bạch cầu

(Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành dược phẩm Việt Nam, việc mua bán, trao đổi dược liệu phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe và sản xuất chế phẩm đông dược ngày càng nhiều Tuy nhiên, hệ thống quản

lý và kiểm tra chất lượng dược liệu của nước ta còn nhiều hạn chế và chưa được các

cơ quan có thẩm quyền quan tâm đứng mức Vì vậy, việc xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đưa chúng vào các tài liệu là cơ sở pháp lý của việc kiểm nghiệm như Dược điển Việt Nam là rất cần thiết

Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,), thuộc họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài, ăn không tiêu, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1] Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây

Khổ sâm cho lá đã khẳng định các diterpen thuộc nhóm ent-kauran có tác dụng

chống ung thư và chống viêm rất mạnh [21] Trong DĐVN IV đã có chuyên luận về dược liệu Khổ sâm cho lá Tuy nhiên, trong chuyên luận chưa có tiêu chí về định

tính, định lượng ent-kauran [3]

Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần

hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường” Với 3 mục tiêu:

- Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá

- Chiết xuất, phân lập 01 ent-kauran chính trong Khổ sâm cho lá dùng làm

chất đối chiếu trong định tính, định lượng

- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng ent-kauran phân lập được

trong dược liệu Khổ sâm cho lá

Chương I TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., thuộc

họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) (Hình 1.1) [1], [4], [5], [7]

Tên khác: Khổ sâm cho lá, Cù đèn, Co chạy đón (Thái) [1]

Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)

Khổ sâm cho lá là cây nhỏ, mọc thành bụi cao từ 1-2 m [1], [7]

Lá mọc so le, gần như mọc đối 3-6 lá chụm lại thành kiểu vòng giả Lá hình mũi mác hẹp, hơi tù ở gốc, đầu nhọn, dài và có mỏ, mép nguyên dài 5-9 cm, rộng 1-

3 cm, cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót), dày hơn ở mặt dưới Ba gân chính tỏa ra từ gốc lá cùng với hai tuyến dạng răng nhỏ, cuống phủ lông hình khiên, có cuống lá kèm rụng sớm Khi phơi khô mặt lá ở dưới

có màu trắng bạc, mặt trên có màu nâu đen [1], [7]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành tạo thành chùm dài 2-7 cm, gồm cả hoa đực và hoa cái hoặc hoa đực và hoa cái riêng Hoa đực có cuống màu bạc, 5 lá đài

hình bầu dục, tràng 5 cánh hoa, thuôn hình dải có lông mịn ở mép, 12 nhị, chỉ nhị

có lông tơ ở phần dưới Hoa cái có 5 lá đài hình bầu dục-mũi mác, bầu hình cầu, thuôn dần ở đỉnh Ba vòi nhụy xẻ đôi đến tận giữa, tỏa rộng ra [1], [7]

Quả nang hình cầu, khi khô nứt thành 3 mảnh, trên đỉnh mỗi mảnh có một bướu nhỏ, màu hung đỏ, có lông ánh bạc [1], [7]

Hạt hình trứng, màu nâu hung, có mỏ ở đỉnh, mồng rất bé Cây ra hoa và kết quả từ tháng 5 đến tháng 8 [1], [7]

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Khổ sâm cho lá được trồng ở khắp nơi, trong các vườn gia đình hoặc vườn thuốc, chủ yếu các tỉnh phía Bắc Việt Nam [5]

Khổ sâm cho lá thuộc loại cây bụi, ưa sáng và có thể hơi chịu hạn Cây rụng

lá hàng năm về mùa đông, sinh trưởng mạnh vào mùa hè thu, ra quả nhiều, tái sinh

tự nhiên chủ yếu bằng hạt và cây chồi sau khi chặt [1]

1.1.3 Cách trồng

Khổ sâm cho lá được trồng rải rác ở nhiều nơi để làm thuốc và làm cảnh Trồng bằng cành hoặc bằng hạt vào tháng 2-3 Cây không kén đất, chỉ cần không úng ngập Trồng ở vườn với khoảng cách 1-1,5 m hoặc trồng trong chậu Cây có khả năng chịu hạn tốt, không bị sâu bệnh [1]

1.1.4 Thu hái và chế biến

Thu hoạch lá và ngọn non quanh năm, rửa sạch, cắt thành từng đoạn dài khoảng 1 cm đến 3 cm, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô Khi dùng sao vàng [3]

Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặc sấy khô, khi dùng đem sao vàng [1], [4], [5], [7]

1.2 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Khổ sâm cho lá cho biết

thành phần hóa học chính của C tonkinensis là các diterpen thuộc nhóm ent-kauran

Ngoài ra có các nhóm chất khác như flavonoid [13], alkaloid [12], steroid, triterpenoid [10]

1.2.1 Các diterpenoid

Đến nay đã xác định được cấu trúc của rất nhiều diterpen phân lập từ cây C

tonkinensis, hầu hết chúng là các chất thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung

ent-kaur-16-en-15-on (Hình 1.2) Một số crotonkin chính đã phân lập được gọi tên (Bảng 1.1) và công thức cấu tạo (Hình 1.3)

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on Bảng 1.1: Một số ent-kauran phân lập được từ C tonkinensis

Cho đến nay đã phân lập và nhận dạng được 4 nhóm alkaloid chính từ C

tonkinensis với bộ khung rất phong phú đó là:

 Alkaloid khung protoberberin: dehydrocorytenchin [14]

 Alkaloid khung benzyltetrahydroisoquinolin: laudanidin [14]

 Alkaloid khung aporphin: corunnin, oxoglaucin [15]

1.2.3 Các flavonoid

Các flavonoid đã phân lập được từ cây C tonkinensis là kaempferol, vitexin,

và isovitexin (Hình 1.4) [9], [13] Kaempferol là một flavonol gặp rất phổ biến trong giới thực vật, có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá Vitexin

chỉ có hoạt tính yếu với nấm Aspergillius niger, còn isovitexin thì không có hoạt

tính [9]

=O -O-CH3 -CH3 Corunnin -O-CH3 -O-CH3 Oxoglaucin

N H

R

OH OCH 3

H 3 CO

H 3 CO

Hai hợp chất triterpenoid được phát hiện từ C tonkinensis đó là α-Amyrin

acetat và Acetyl aleuritolic acid [10]

α-Amyrin acetat

(urs-12-en-3β-yl acetat)

Acetyl aleuritolic acid

(3β-hydroxy taracer-14-en-28-oic acid)

1.2.5 Các steroid

Nhóm chất steroid tìm thấy trong dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của C

tonkinensis, chủ yếu thuộc loại sterol C29 với bộ khung 3β-ol, Δ5-pregnan, có mạch

nhánh với cấu hình và cấu dạng khác nhau Đó là các sitosterol, poriferasterol, sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosyl (Hình 1.5) [9]

1.3 Tác dụng dược lý

1.3.1 Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn

Phân đoạn alkaloid toàn phần chiết từ lá C tonkinensis có tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và P berghei trên in-vitro và trên chuột

[19] Một số dịch chiết (cồn, aceton, ethyl acetat và nước) và các phân đoạn

alkaloid, flavonoid có tác dụng kháng một số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, E

coli, Klebsiella, Staphylococcus aureus, nhưng không có tác dụng đến hai chủng Samonella typhy và Shigella [19] Năm 2006, Phan Minh Giang và cộng sự đã cho

biết tác dụng kháng tụ cầu khuẩn (S aureus) của các ent-kauran diterpen phân lập

từ lá C tonkinensis [29] Các chất 1, 4 (Hình 1.3) cho tác dụng mạnh nhất trên S

aureus và S aureus đã kháng methicillin [29]

1.3.2 Tác dụng chống viêm

Những kết quả nghiên cứu đã khẳng định rằng các ent-kauran diterpenoid có

tác dụng chống viêm mạnh Năm 2003, bốn diterpen 1-4 (Hình 1.3) được phát hiện

có tác dụng ức chế quá trình kích thích NF-κB và ức chế tổng hợp ra nitric oxid (NO) trên tế bào RAW 264,7 được kích hoạt bởi lypopolysachrid (LPS), mạnh hơn nhiều hai chất đối chứng là parthenolid và aminoguanidin [25] Chúng còn ức chế

sự hoạt động của enzym NADPH oxidase (NOX), một tác nhân quan trọng trong quá trình gây viêm Hai grayanan diterpenoid tách từ Khổ sâm cho lá cũng thể hiện tác dụng chống viêm khi ức chế sự hóa enzym Cyclooxygenase 2 (COX-2), tuy

nhiên, cả hai chất đều có tác dụng ức chế COX-2 kém hơn chất 1 (Hình 1.3) [21], [34] Như vậy, 1 là chất có tác dụng chống viêm mạnh nhất trong dược liệu Khổ sâm

cho lá

1.3.3 Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

Dịch chiết phân đoạn dicloromethan từ Khổ sâm cho lá có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư màng tử cung người (FI), ung thư biểu mô (KB), ung thư vú MCF-7, ung thư phổi NCI-H460, SF-268 [34] Phân lập các hoạt chất theo định hướng thử hoạt tính Kết quả thu được cho

thấy cấu trúc 16-en-15-one (O = C − CH = CH −), nhóm OH ở vị trí số 7, và nhóm acetyl ở vị trí số 18 rất quan trọng đối với tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [33], [36] Cơ chế của tác dụng chống ung thư có thể là ức chế NF-B, ức chế sự tăng sinh mạch máu, hay theo cơ chế apoptosis [21] Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ

ra rằng 1 không có độc tính đối với các nguyên bào sợi Điều này có nghĩa khi điều trị bằng 1 tế bào bình thường ít bị ảnh hưởng hơn so với các tế bào khối u, do cơ chế chống ung thư tạo ra bởi 1 tập trung vào các tế bào khối u [36]

1.3.4 Tác dụng ức chế SIRT1

Các chất 1-5, 9 và 10 (Hình 1.3) có tác dụng ức chế Sirt1 mạnh hơn chất đối

chiếu dương là nicotinamid Giống ba tác dụng trước, cấu trúc 16-en-15-one (O=C−CH=CH−) kết hợp với nhóm thế (OH hoặc OAc) tại vị trí số 7 đặc biệt quan trọng cho tác dụng ức chế Sirt1 Có nhiều chất tự nhiên và tổng hợp ức chế Sirt1 đã

được tìm thấy, nhưng việc tìm ra các diterpen nhóm ent-kauran có tác dụng mạnh hơn

so với nicotinamid đã đưa ra một nhóm chất mới có tác dụng ức chế protein Sirt1 [25] Sirt1 (hay sir2) là một thành viên của Sirtuin được tìm thấy trong tế bào của người, đó

là một nhóm protein chứa các enzym histone deacetylase hoặc mono-ribosyl transferase Sirtuin đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh học trong sinh vật, có ảnh hưởng đến các quá trình sao chép, lão hóa, apoptosis Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các chất có ức chế Sirt1 có thể có tác dụng chống ung thư Như vậy, tác dụng ức chế Sirt1 có thể gợi ý một cơ chế tác dụng chống ung thư

mới của các ent-kauran diterpen phân lập từ C tonkinensis [21]

1.3.5 Tác dụng trên tế bào tạo xương

Các diterpenoid ent-kauran từ Khổ sâm cho lá còn có tác dụng kích thích

trực tiếp vào nguyên bào xương Đó là các phân tử điều trị tiềm năng chống lại các bệnh về xương như loãng xương [35]

Phương Thiện Thương và cộng sự đã chứng minh ent-7-hydroxy-15-oxo

kaur-16-en-18-yl acetat (1) là chất thường có tác dụng tốt nhất đối với tất cả các

nghiên cứu về kháng khuẩn, ức chế các enzym nitric oxide synthetase và NADPH

oxidase (NOX), ức chế sự hoạt động của các protein NF-B và Sirt1, và độc đối với các tế bào ung thư [21] Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng

hàm lượng 1 trong các mẫu Khổ sâm cho lá trên thị trường là rất cần thiết

1.4 Công dụng

1.4.1 Công dụng

Khổ sâm cho lá được dùng trị ung nhọt, sang lở, chốc đầu (sắc uống và rửa ngoài), đau bụng khó tiêu, lỵ, viêm loét dạ dày, tá tràng Ngoài ra, Khổ sâm cho lá còn được dùng trong các phương thuốc chữa mẩn ngứa, phong hủi, vảy nến, viêm

âm đạo trùng roi và sa sinh dục (sắc uống và rửa ngoài) Liều dùng hàng ngày là

12-24 g, có khi tới 40 g, dạng thuốc sắc [1], [19]

1.4.2 Bài thuốc

1.4.2.1 Chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1], [7], [19]

a Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 50 g; Bồ công anh 20 g Sắc uống

b Lá Khổ sâm cho lá, Bồ công anh, Nhân trần, mỗi vị 12 g; Lá khôi, Chút chít, mỗi vị 10 g Tán bột, mỗi ngày uống 30 g với nước đun sôi để nguội

c Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 40 g; Bồ công anh 20 g; Uất kim, Hậu phác, mỗi vị 12 g; Ngải cứu 8 g; Cam thảo 4 g Sắc uống hoặc nấu cao pha siro uống

1.4.2.2 Chữa đau bụng không rõ nguyên nhân [1]

Nhai mấy lá Khổ sâm cho lá tươi với muối, nếu có nôn hay sôi bụng thêm miếng gừng tươi

1.4.2.3 Chữa lỵ cấp tính, tiêu chảy [1], [19]

a Lá Khổ sâm cho lá, lá Phèn đen, mỗi thứ một nắm sắc uống

b Khổ sâm cho lá, Rau sam, Cỏ sữa, Cỏ nhọ nồi, lá Mơ lông, mỗi vị 10 g, sắc uống ngày 1 thang

c Khổ sâm cho lá 16 g; Hương phụ 10 g; củ Sả 6 g; vỏ Quýt 6 g; Gừng khô

3 lát Sắc uống ngày 1 thang

1.4.2.4 Chữa viêm da thần kinh thể phong nhiệt mới mắc [1]

a Khổ sâm cho lá 12 g; Sinh địa, Thổ phục linh, mỗi vị 16 g; Cúc hoa, Kim ngân hoa, Ké đầu ngựa, mỗi vị 12 g; Đan bì 8 g Sắc uống ngày một thang

b Khổ sâm cho lá 12 g ; Kinh giới, Sinh địa, mỗi vị 16 g; Phòng phong, Kim ngân, Cúc hoa, Tạo giác thích, mỗi vị 12 g; Thuyền thoái 6 g Sắc uống ngày một thang

1.4.2.5 Chữa bệnh phong hủi [19]

a Khổ sâm cho lá 500 g; lá Xoan 300 g; rượu trắng 1 lít Ngâm rượu uống

b Khổ sâm cho lá 600 g; Tạo giác bỏ vỏ 1000 g; Hà thủ ô trắng 200 g; Phòng phong 100 g Hoàn to bằng hạt ngô, ngày uống 3-4 lần, mỗi lần 20 viên 1.4.2.6 Chữa vảy nến [1]

Khổ sâm cho lá, Huyền sâm, Kim ngân, Sinh địa, mỗi loại 15 g; quả Ké 10 g Làm thành viên, ngày uống 20-25 g

1.5 Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược điển Việt Nam IV [3]

DĐVN IV đã có riêng một chuyên luận về Khổ sâm cho lá trong đó trình bày các phần: mô tả thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột), độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, tỉ lệ thân cành, chế biến, bảo quản, tính vị-quy kinh, công năng-chủ trị, cách dùng-liều lượng và có cả các tiêu chuẩn để định tính theo phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng và tiêu chuẩn định lượng theo chất chiết được trong dược liệu

1.5.1 Định tính

A Lấy khoảng 2 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25 ml dung

dịch acid sulfuric 2% (TT) Đun cách thủy ở 1000C trong 10 phút, lọc Lấy khoảng

1 ml dịch lọc cho vào chén sứ trắng Thêm 5 giọt đến 6 giọt thuốc thử Dragendoff (TT) Để yên khoảng 1 phút sẽ có tủa màu cam sậm

Lấy khoảng 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT), xuất hiện màu nâu đen

B Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng: Silica gel 60 F254

Dung môi khai triển: Benzen- EtOAc (95:5)

Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu, thêm 50 ml EtOH 96 % (TT) Đun hồi lưu cách thủy ở 1000C trong 20 phút Lọc qua giấy lọc Cô cách thủy dịch lọc đến cắn, hòa cắn trong 2 ml EtOAc (TT), để bốc hơi còn khảng 1 ml, dùng dung dịch này làm dịch thử Hoặc sử dụng cắn còn lại trong mục “Chất chiết được trong dược liệu” hòa tan trong 2 ml EtOAc (TT) để làm dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g bột Khổ sâm cho lá (mẫu chuẩn), thêm 50 ml EtOH 96% (TT), tiến hành chiết như dung dịch thử

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 µl dung dịch thử

và dung dịch đối chiếu Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát màu sắc các vết ở ánh sáng thường và dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Sau đó phun lên bản mỏng dung dịch vanilin – sulfuric (TT), sấy bản mỏng ở 1000C đến 1050C trong khoảng 5 phút Trên sắc đồ chưa phun thuốc hiện màu của dung dịch thử phải có vết cùng màu vàng tươi ở ánh sáng thường, phát quang màu xanh lơ khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm và cho màu tím đậm khi phun thuốc hiện màu với giá trị Rf khoảng 0,8 Ngoài ra, còn có nhiều hơn 4 vết màu tím hay xanh tím và một số vết màu lục vàng hay xanh lá, có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết của dung dịch đối chiếu

1.5.2 Chất chiết được trong dược liệu

Không ít hơn 8,0 % tính theo dược liệu khô kiệt

Tiến hành theo phương pháp chiết nóng, dùng EtOH 96 % (TT) làm dung môi

Các tiêu chuẩn của DĐVN IV mới chỉ giúp định tính và định lượng các thành phần hóa học chung có trong Khổ sâm cho lá mà chưa có quy định về định

tính và định lượng ent-7-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (1) là hoạt chất

chính có giá trị cao trong y học

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá

Nguyên liệu để chiết xuất và phân lập ent-kauran diterpenoid là lá cây Khổ

sâm cho lá thu hái ở Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội, tháng 1 năm 2013 Mẫu dược liệu đã được TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà

Nội, xác định tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., mã tiêu bản số

HNIP/17851/13 (Phụ lục 1) Mẫu nghiên cứu hiện còn lưu tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Nguyên liệu để định lượng là các mẫu lá, cành cây Khổ sâm cho lá thực tế dùng để kiểm nghiệm được thu hái ở các địa phương khác nhau vùng Bắc bộ (Bảng 2.1) Các mẫu thực tế được phơi, sấy khô ở 500C và lưu tại Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng

mẫu

Bộ phận dùng

Ký hiệu mẫu

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu

chuẩn phân tích; dung môi dùng cho HPLC, HPTLC của hãng Merck; dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng

Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 (Merck)

Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck)

Hóa chất: dung dịch H2SO4 đặc, dung dịch NaOH 10%, dung dịch HCl đặc, dung dịch FeCl3, dung dịch gelatin 1%… Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng thuốc thử: Dragendroff, Mayer, Liebermann-Burchard…

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Cân kỹ thuật Precisa XT 620M

Cân phân tích Precisa XT 220A

Máy cất quay Buchi B481

Tủ sấy Binder – FD 115

Máy HPTLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5

Hệ thống CAMAG REPROSTAR3 kết nối với máy vi tính

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – LC 10A (Shimadzu)

Máy đo điểm nóng chảy GALLENKAMP (Sanyo) của Nhật Bản

Máy đo phổ tử ngoại UV-1800 Spectrometer (Shimadzu) của Nhật Bản

Máy đo phổ hồng ngoại (IR) GX-PerkinElmer (Mỹ)

Máy đo phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) AGILENT 1100 LC-MSD Tram

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- và 13C-NMR Bruker NMR và sử dụng dung môi CDCl3 để hòa tan chất

AM500-FT-2.2 Nội dung nghiên cứu

- Định tính sơ bộ thành phần hóa học lá cây Khổ sâm cho lá bằng các phản ứng ống nghiệm

- Phân lập, tinh chế (độ tinh khiết > 90%) và xác định công thức hóa học 01

ent-kauran diterpenoid (CT-1) chính từ lá cây Khổ sâm cho lá

 Phân lập, tinh chế bằng các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, kết tinh…)

 Xác định công thức bằng các phương pháp phổ (UV, IR, MS, NMR…)

- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng chất CT-1 trong mẫu lá và

cành cây Khổ sâm cho lá

 Định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Định lượng hàm lượng CT-1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

trình chiết xuất (chiết ở nhiệt độ phòng, chiết nóng) để đảm bảo hợp lý cả hai yêu cầu: Chiết được tối đa lượng chất nghiên cứu và tối thiểu tạp chất để thuận tiện cho quá trình phân lập và tinh chế tiếp theo Sử dụng phương pháp chiết ở nhiệt độ phòng hoặc chiết nóng với methanol, ethanol ở các độ cồn khác nhau

2.3.2.2 Phân lập chất bằng phương pháp sắc ký cột (CC)

Tiến hành phân lập chất bằng phương pháp sắc ký cột, sử dụng pha tĩnh là Silica gel 60 (Merck) Để lựa chọn dung môi rửa giải hợp lý, chúng tôi tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn thu được

2.3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Xác định cấu trúc chất phân lập thông qua phân tích tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực) kết hợp với việc phân tích các phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo

2.3.3 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 01 ent-kauran diterpenoid

đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá

2.3.3.1 Định tính bằng phương pháp sắc ký

Dùng các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao

để định tính ent-kauran diterpenoid đã phân lập từ lá và cành cây Khổ sâm cho lá

a) Định tính bằng sắc kí lớp mỏng (TLC)

Khảo sát điều kiện phân tích định tính phù hợp áp dụng để định tính

ent-kauran có trong lá Khổ sâm cho lá gồm có các yếu tố liên quan như: Cách xử lý mẫu, pha tĩnh, pha động, cách phát hiện…

 Chuẩn bị:

- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1050C trong 30 phút

- Dung môi pha đúng theo tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút

- Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, cách mép dưới 1 cm, cách 2 mép bên 1 cm Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, lặp lại 3-5 lần

 Khai triển sắc ký: Bản mỏng sau khi chấm được triển khai theo chiều từ dưới lên trong bình sắc ký, khi dung môi chạy đến cách mép trên 0,5-1 cm thì lấy

ra, đánh dấu đường dung môi triển khai

 Hiện sắc đồ: Vệt chất được phát hiện bằng đèn điện tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, và/hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Tính Rf: Rf =

dm

v

d d

d v: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết

d dm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi triển khai Đánh giá: quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị hệ số di chuyển Rf

b) Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng kết hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng để kiểm tra sự có mặt của chất đối chiếu trong dược liệu nghiên cứu bằng cách so sánh thời gian lưu tR, phổ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiếu

2.3.3.2 Định lượng 01 ent-kauran chính trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Khảo sát lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp để định lượng ent-kauran

chính trong lá và cành Khổ sâm cho lá

Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của ent-kauran chính chiết

xuất được từ dược liệu lá Khổ sâm cho lá, để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp như: bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu

Xây dựng phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:

- Tính thích hợp của phương pháp so với hệ thống

- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính

- Độ lặp của phương pháp

- Độ đúng của phương pháp

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

Từ phương pháp đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành định lượng 01

ent-kauran chính trong mẫu dược liệu Khổ sâm cho lá thực tế trên thị trường

2.3.4 Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thông qua các đặc trưng sau:

x n

Chương III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

3.1.1 Định tính alkaloid

Cho 10 g bột dược liệu đã xay nhỏ vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25

ml dd H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc vào một bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac, sau đó lắc với chloroform (3x10 ml), gạn lấy lớp chloroform rồi cho bốc hơi cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 10 ml H2SO4 1N, lấy dịch chiết này làm phản ứng, chia vào 3 ống nghiệm

- Ống 1: Thêm 2 giọt TT Mayer Quan sát thấy có xuất hiện tủa trắng

- Ống 2: Thêm 2 giọt TT Dragendorff Quan sát thấy có xuất hiện tủa đỏ cam

- Ống 3: Thêm 2 giọt TT Bouchardat Quan sát thấy có xuất hiện tủa nâu

Nhận xét: Cả 3 phản ứng dương tính

3.1.2 Định tính flavonoid

Lấy 10 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml có nút mài, thêm 50 ml ethanol 90% Đun cách thủy 10 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp Cô dịch lọc

đến cắn, hòa cắn với một lượng tối thiếu nước cất Cho dịch vào bình gạn, lắc với

n-hexan (3x10 ml), lắc tiếp với ethyl acetat (3x10 ml), gạn lấy lớp ethyl acetat cô đến cắn Hòa cắn trong ethanol, dùng dung dịch để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí của tờ giấy lọc,

để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc Quan sát thấy màu vàng chuyển sang đậm

hơn

- Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột

Mg kim loại, sau đó cho 5 giọt HCl đặc, đun sôi cách thủy trong vài phút Quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu hồng hay đỏ

- Phản ứng với FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm 1-2 giọt FeCl3 5% Quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu xanh đen

- Phản ứng với kiềm loãng: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, nhỏ vài giọt NaOH 10% Quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu vàng và có kết tủa vàng

- Phản ứng diazo hóa: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 ml NaOH 10%, đun cách thủy, để nguội, thêm vài giọt TT diazo mới pha Quan sát thấy có xuất hiện màu đỏ gạch

Nhận xét: Phản ứng âm tính

- Phản ứng diazo hóa: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm NaOH 10%, đun cách thủy, để nguội, thêm vài giọt TT diazo mới pha Quan sát thấy có xuất hiện màu đỏ gạch

Nhận xét: Phản ứng dương tính

- Phản ứng huỳnh quang: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ chồng vài giọt NaOH 10%, hơ nhẹ cho khô Che một phần diện tích bằng đồng tiền kim loại rồi đặt dưới ánh sáng tử ngoại 366 nm trong vài phút, bỏ vật chắn ra thấy 2 phần đều phát quang như nhau

Nhận xét: Phản ứng âm tính

3.1.4 Định tính tanin

Cho vào cốc có mỏ 5 g bột dược liệu, thêm 30 ml nước cất, đun sôi trực tiếp

5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc chia vào 3 ống nghiệm để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng với FeCl3: Thêm vào ống nghiệm 1-2 giọt FeCl3 5% Quan sát thấy dung dịch có màu xanh đen

- Phản ứng với chì acetat: Thêm vào ống nghiệm 2 giọt chì acetat 10% Quan sát thấy xuất hiện tủa trắng

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Thêm vào ống nghiệm vài giọt gelatin 1% Quan sát có một ít tủa bông xuất hiện

Nhận xét: Cả 3 phản ứng đều dương tính

3.1.5 Định tính saponin

- Hiện tượng tạo bọt: Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 5 ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút Để yên và quan sát Quan sát thấy có cột bọt nhưng kém bền (3 phút)

- Phản ứng Salkowski: Cho vào ống nghiệm to 2 g dược liệu, thêm vào 10 ml ethanol 90%, đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc, lấy 1 ml cho vào ống nghiệm khác Để ống nghiệm nghiêng 450, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1 ml acid sulfuric đặc Không thấy xuất hiện vòng nâu đỏ ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

Nhận xét: Cả 2 phản ứng âm tính

3.1.6 Định tính glycosid tim

Lấy khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50

ml ethanol 25%, lắc đều rồi ngâm trong 24 giờ Lọc lấy dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% đến dư Để lắng, lọc Loại chì acetat bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa đến không còn tủa với Na2SO4 Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, lắc với chloroform (2x20 ml) Gạn và lọc qua bông thu lấy lớp chloroform, chia dịch chiết vào 4 ống nghiệm khô, bốc hơi cách thủy đến khô Cắn thu được để làm phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống nghiệm

0,5 ml H2SO4 đặc Không quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ

- Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dd FeCl3 5% pha trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống 450 Thêm 0,5 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Không thấy

ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ

- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt TT Baljet (1 phần dd acid picric 1% và 9 phần dd NaOH 10%) Không thấy xuất hiện màu đỏ cam

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết cắn Thêm 5 giọt dung dịch natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều Không thấy xuất hiện màu đỏ

Nhận xét: Cả bốn phản ứng đều âm tính

3.1.7 Định tính chất béo, sterol, caroten

Cho 10 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm ether dầu hỏa đến ngập dược liệu, ngâm qua đêm, lọc

- Định tính chất béo: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô Không thấy có vết dầu mỡ để lại

Nhận xét: Phản ứng âm tính

3.1.8 Định tính acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid, acid amin

Lấy khoảng 2 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước, đun sôi cách thủy 5 phút, lọc, lấy dịch lọc làm các phản ứng

- Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc và vài tinh thể

Na2CO3 khan Không thấy xuất hiện bọt khí nổi lên

Nhận xét: Phản ứng âm tính

- Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A, 0,5 ml thuốc thử Fehling B Đun cách thủy 15 phút Thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

Nhận xét: Phản ứng dương tính

- Định tính acid amin: Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 0,5%, đun cách thủy sôi 15 phút Quan sát thấy xuất hiện màu xanh tím

Nhận xét: Phản ứng dương tính

- Định tính polysaccarid: Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml

dung dịch Lugol, đun cách thủy sôi 2 phút Không thấy dịch lọc chuyển màu tím đỏ

Cyanidin Diazo hóa

3 Coumarin Mở, đóng vòng lacton

Diazo hóa Hiện tượng huỳnh quang

– + –

Legal

– – – –

Không có

7 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy – Không có

Kết luận sơ bộ: Lá cây Khổ sâm cho lá có nhiều alkaloid, flavonoid, tanin, ngoài ra

còn có thành phần caroten, đường khử, acid amin

3.2 Chiết xuất, phân lập

3.2.1 Chiết xuất

Lá cây Khổ sâm cho lá đã phơi khô (5 kg) nghiền thành bột thô (0,5-1,5 cm) chiết với MeOH (15l x 2 lần) bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần Lần thứ 3 chiết nóng trên máy cô quay trong 3 giờ Gộp các dịch chiết MeOH thu được đem cất loại dung môi thu được 500 g cắn chiết Thêm nước vào cắn

Chú thích: +++ Phản ứng dương tính rất rõ

++ Phản ứng dương tính rõ + Phản ứng dương tính yếu – Phản ứng âm tính

MeOH và chiết phân bố với dung môi dicloromethan (tỷ lệ 1:1) thu được dịch chiết tương ứng Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 223 g cắn chiết Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ 3.1

Hình 3.1: Sơ đồ chiết và phân đoạn cao lá Khổ sâm cho lá

3.2.2 Phân lập

Sử dụng cắn Khổ sâm cho lá (200 g) thu được từ phân đoạn Dicloromethan của dịch chiết MeOH để tiến hành phân lập

Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính 10 cm, chiều dài 90

cm, rửa sạch, sấy khô, cố định cột trên giá theo chiều thẳng đứng Chất nhồi cột:

450 g Silica gel 60 (Merck) cỡ hạt 40-63 µm Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt

Dung môi rửa giải: Hex:EtOAc (4:1) đẳng dòng

(500 g)

Dịch nước

- Ngâm ở nhiệt độ phòng: 15l MeOH x 2 lần / 2 tuần

- Chiết nóng: 15l, MeOH x 1 lần

- Cô thu hồi dung môi

- Chiết với dicloromethan

- Cất loại dung môi

Bột lá cây khổ sâm Bắc bộ