đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá
2.3.3.1. Định tính bằng phương pháp sắc ký
Dùng các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao để định tính ent-kauran diterpenoid đã phân lập từ lá và cành cây Khổ sâm cho lá.
a) Định tính bằng sắc kí lớp mỏng (TLC)
Khảo sát điều kiện phân tích định tính phù hợp áp dụng để định tính ent- kauran có trong lá Khổ sâm cho lá gồm có các yếu tố liên quan như: Cách xử lý mẫu, pha tĩnh, pha động, cách phát hiện…
Chuẩn bị:
- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1050C trong 30 phút.
- Dung môi pha đúng theo tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút.
- Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, cách mép dưới 1 cm, cách 2 mép bên 1 cm. Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, lặp lại 3-5 lần.
Khai triển sắc ký: Bản mỏng sau khi chấm được triển khai theo chiều từ dưới lên trong bình sắc ký, khi dung môi chạy đến cách mép trên 0,5-1 cm thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi triển khai.
Hiện sắc đồ: Vệt chất được phát hiện bằng đèn điện tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, và/hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Tính Rf: Rf =
dm v
d d
dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.
ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi triển khai. Đánh giá: quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị hệ số di chuyển Rf.
b) Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng kết hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng để kiểm tra sự có mặt của chất đối chiếu trong dược liệu nghiên cứu bằng cách so sánh thời gian lưu tR, phổ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiếu.
2.3.3.2. Định lượng 01 ent-kauran chính trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Khảo sát lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp để định lượng ent-kauran chính trong lá và cành Khổ sâm cho lá.
Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của ent-kauran chính chiết xuất được từ dược liệu lá Khổ sâm cho lá, để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp như: bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu.
- Tính thích hợp của phương pháp so với hệ thống. - Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính. - Độ lặp của phương pháp.
- Độ đúng của phương pháp.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp.
Từ phương pháp đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành định lượng 01 ent- kauran chính trong mẫu dược liệu Khổ sâm cho lá thực tế trên thị trường.