Chúng tôi đã tiến hành phân lập được chất ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16- en-18-yl acetat (CT-1), là hoạt chất chính trong khổ sâm cho lá. Và đã sử dụng chất phân lập được để xây dựng quy trình định tính và định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá. Việc sử dụng chất chuẩn đối chiếu CT-1 để đánh giá chất lượng dược liệu sẽ cho kết quả định tính chính xác và tin cậy hơn việc dùng dược liệu chuẩn (quy định trong DĐVN IV), ngoài ra còn giúp định lượng được hàm lượng của hoạt chất chính trong dược liệu. Đây là công trình đầu tiên ứng dụng việc dùng chất chuẩn đánh dấu trong kiểm nghiệm dược liệu Khổ sâm cho lá. Kết quả của chúng tôi có thể làm cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn vị thuốc này.
DĐVN IV định tính dược liệu Khổ sâm cho lá theo dược liệu chuẩn với hệ dung môi Benzen:EtOAc (tỷ lệ 95:5), các dấu hiệu để định tính chỉ hướng đến thành phần alkaloid, flavonoid mà chưa giúp nhận biết sự có mặt của ent-kauran. Công trình này dùng chất đối chiếu CT-1 và hệ dung môi Hex:EtOAc (2:1) đã cho kết quả định tính tốt, rõ ràng. So với tiêu chuẩn DĐVN IV, sử dụng dung môi bớt độc hại và kinh tế hơn (thay benzen bằng n-Hexan), và xác định rõ ràng hoạt chất chính của Khổ sâm cho lá, đặc trưng cho dược liệu này. Có thể sử dụng kết quả nghiên cứu này cho công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu về sau.
Do thời gian và điều kiện có hạn nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc thu thập 8 mẫu dược liệu, trong đó mới chỉ định lượng được 8 mẫu lá, 4 mẫu cành non, 4 mẫu cành già. Tuy nhiên, từ kết quả định lượng có thể nhận thấy hàm lượng chất
CT-1 trong mẫu lá cao hơn trong mẫu cành: cành non là từ 1,5-2 lần và cành già từ 3-7 lần. Hàm lượng chất CT-1 trong mẫu lá cây Khổ sâm cho lá khá cao (từ 0,51 đến 1,27% tính theo khối lượng khô tuyệt đối), trong đó cao nhất là mẫu ở Bắc Ninh (1,27%), thấp nhất là mẫu ở Vĩnh Phúc (0,51%). Hàm lượng chất CT-1 trong cành non (>0,31%) cao hơn rất nhiều so với cành già (<0,18%). Vì vậy, thu hái lá và những cành còn non sẽ cho hàm lượng hoạt chất chính CT-1 cao nhất. Thật thú vị là điều này phù hợp với quy định của dược liệu trong DĐVN IV.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành các mục tiêu của khóa luận tốt nghiệp, kết quả thu được như sau:
- Xác định được thành phần hóa học của dược liệu Khổ sâm cho lá gồm các thành phần chính là: alkaloid, flavonoid, tanin; ngoài ra còn có các thành phần khác như: đường khử, acid amin, caroten.
- Phân lập và xác định công thức hóa học 01 ent-kauran diterpenoid chính từ lá cây C. tonkinensis là chất ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (CT-1) có độ tinh khiết 96%, với hiệu suất 14,12%.
- Xây dựng được phương pháp định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là Hex:EtOAc (tỷ lệ 2:1) và sắc ký lỏng hiệu năng cao với hệ dung môi acetonitril:nước cất hai lần chạy đẳng dòng (tỷ lệ 65:35).
- Xây dựng được phương pháp định lượng chất CT-1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, áp dụng định lượng hàm lượng chất CT-1 của một số mẫu lá (0,51-1,27%) và cành (0,14-0,46%) Khổ sâm cho lá thu hái tại miền bắc Việt Nam.
- Kết quả định lượng một số mẫu thực tế cho thấy phần lá cây có hàm lượng chất CT-1 cao hơn nhiều lần so với phần cành non cũng như cành già của cây Khổ sâm cho lá.
KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT
- Cần sử dụng chất đối chiếu CT-1 trong công tác kiểm nghiệm dược liệu Khổ sâm cho lá nhằm phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa vị thuốc này.
Tài liệu tham khảo
I. Tiếng việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn - Viện Dược liệu(2005), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, II, NXB. khoa học và kỹ thuật, tr. 87-89.
2. Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội (2006), Thực tập dược liệu phần kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học, Trung tâm thông tin thư viện Đại học Dược Hà Nội.
3. Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt nam IV, NXB. Y học,tr. 802-803.
4. Tào Duy Cần, Trần Sĩ Viên (2007), Cây thuốc, vị thuốc, bài thuốc Việt Nam, NXB. Hà Nội, tr. 122.
5. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB. Trẻ, tr. 622-623.
6. Phạm Minh Giang, Phan Tống Sơn (2011), “Hoạt tính gây độc tế bào của các
ent-kauran diterpenoid từ cây thuốc Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis
Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí dược học, 419, tr. 24-27.
7. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, (in lần thứ 8), NXB. Y học, tr. 826.
8. Phạm Luận (2000),Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN.
9. Phạm Thị Hồng Minh (2003), Về thành phần hoá học và các hoạt chất của cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae, Luận án tiến sĩ hoá học, Hà Nội.
10. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2002), “Phân lập và nhận dạng một số hợp chất triterpenoid trong cây khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.)”, Tạp chí Dược học, 42 (12), tr. 8-9.
11. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2003), “ent-(16S)-7β-hydroxy-18α- acetoxy kauran-15-on - một kauran diterpen mới, phân lập từ cây Khổ sâm cho lá Croton tonkinensis”, Tạp chí Hoá học, 41(2), tr. 104-109.
12. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Trần Quang Hưng, Chu Đình Kính (2004), “Phát hiện các berbin alcaloid trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis)”, Tạp chí Phân tích lý, hoá, sinh, 9 (1), tr. 38-41.
13. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Chu Đình Kính (2004), “Phân lập và nhận dạng một số flavonoid-C-glucosid từ cây Khổ sâm cho lá (C. tonkinensis) có ở Việt Nam”, Tạp chí Hoá học , 42 (2), tr. 187-190.
14. Phạm Thị Hồng Minh, Lưu Thị Huế, Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Hữu Điển (2006), “Góp phần nghiên cứu thành phần alkaloid trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) ở Tây Thiên-Tam Đảo”, Tạp chí khoa học Trường ĐHSP Hà Nội, 4, tr. 110-114.
15. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Lan, Phạm Hữu Điển, Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Hoàng Ngọc (2007), “Nghiên cứu thành phần alkaloid trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thu hái ở Ninh Bình”, Tuyển Tập các Công trình Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hóa học Hữu cơ Toàn quốc lần thứ tư, NXB. Đại học Quốc gia, Hà Nội, tr. 455-459.
16. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Đái Duy Ban, Lê Kim Xuyến, Hoàng Thị Minh Châu, Lê Trung Dũng, Phan Xuân Độc, Nguyễn Văn Vũ (2007), “Kết quả nghiên cứu khả năng tăng cường miễn dịch của các chế phẩm Khổ sâm Croton tonkinensis Gagnep.,”, Tạp chí Y học Việt Nam, 333, tr. 24-28.
17. Phạm Hoàng Ngọc, Lê Mai Hương, Phạm Thị Hồng Minh, Đỗ Hữu Nghị, Chu Đình Kính (2003), “Về thành phần hoá học và các hoạt chất của cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) ở Việt Nam”, Hội nghị hóa học toán quốc lần thứ IV 10/2003.
18. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2010), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin, kaempferol, nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, Luận án tiến sĩ dược học, Hà Nội.
19. Trương Văn Như (1992), Nghiên cứu cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) và đánh giá tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét bằng phương pháp thực nghiệm, Luận văn PTS khoa học y dược, Hà Nội.
20. Tạ Thị Thảo (2007), Thống kê trong hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQGHN, tr. 56.
21. Phương Thiện Thương, Đào Trọng Tuấn, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi (2011), “Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Khổ sâm cho lá”, Tạp chí dược liệu, 1+2/2011, tr. 9-19.
22. Nguyễn Quốc Tuấn (2012), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối, Luận văn thạc sĩ khoa học, Hà Nội.
23. Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Taylor W. C (1999), “Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cây Khổ sâm cho lá
Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae”, Tạp chí Hoá học, 37(4), tr. 57- 59.
24. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB. khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
II. Tiếng Anh
25. Phan Minh Giang, Hui Zi Lin, Phan Tong Son, Jeong Hyuny Lee, Yuong Soo Hong and Jung Joon Lee (2003), “Ent-kauran diterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPS-induced NF-kB activation and no production”,
26. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee, J. J., and Otsuka, H. (2004), “four ent- kauran diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep.,”, Chem. Pharm. Bull., 52 (7), pp. 879-882.
27. Phan Minh Giang, Hideakii Otsuka, Phan Tong Son (2005), “The minor ent- kauran-16-en-15-on type diterpen from Croton tonkinensis”, Journal of Chemistry, 43 (2), pp. 263-264.
28. PhanMinh Giang., Phan T. S., Hamada Y., Otsuka H. (2005), “Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis
Gagnep.,”, Chem. Pharm. Bull., 53 (3), pp. 296 – 300.
29. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka (2006), “Anti-staphylococcal activity of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis”, J. Nat. Med., 60, pp. 93–95.
30. Kuo P.C., Shen Y.C., Yang M.L., Wang S.H., Thang T.D., Dung N. X., Chiang P.C., Lee K.H., Lee E.J., Wu T.S. (2007), “Crotonkinins A and B and related diterpenoids from Croton tonkinensis as anti-inflammatory and antitumor agents”, Journal of Natural Products, 70, pp. 1906-1909.
31. Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Đang Ngoc Quang, Hashimoto T., Takaoka S., Asakawa Y (2003), “A novel ent-1-acetoxy-7,14-dihydroxy-16- kauren-15-on from the Croton tonkinensis”, Chem. Pharm. Bull, 51(5), pp. 590-591.
32. Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Nguyen Manh Cuong, Taylor W. C (2004), “A new ent-kauran diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep., leaves”, Fitoterapia, 75 (2), pp. 552-556.
33. Thuong P.T., Dao T.T., Pham T.H.M., Nguyen P.H., Le T.V.T., Lee K.Y., Oh W.K. (2009), “Crotonkinensins A and B, diterpenoids from the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis”, Journal of Natural Products, 72, pp. 2040-2042.
34. Dao Trong Tuan., Le T.V.T., Nguyen P.H., Thuong P.T., Minh P.T.H., Woo E.R., Lee K.Y., Oh W.K. (2010), “Sirt1 inhibitory diterpenoids from the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis”, Planta Medica, 76, pp. 1011-1014.
35. Dao Trong Tuan (2012), “Connective Tissue Cells; Research Reports on Connective Tissue Cells from Institute of Medicine Provide New Insights”, Health & Medicine Week, 3/2012, pp. 1542.
36. Young Hoon Sul, Myung Sun Lee, Eun Young Cha, Phuong Thien Thuong, Nguyen Minh Khoi, In Sang Song (2013), “An ent-Kaurane diterpenoid from Croton tonkinensis Induces Apoptosis by Regulating AMP-Activated Protein Kinase in SK-HEP1 Human Hepatocellular Carcinoma Cells”, Biol. Pharm. Bull., 36(1), pp. 158–164.
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học của cây Khổ sâm cho lá. Phụ lục 2: Phổ tử ngoại.
Phụ lục 3: Phổ hồng ngoại. Phụ lục 4: Phổ khối.
Phụ lục 5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H. Phụ lục 6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C.
PHỤ LỤC 1
PHỔ TỬ NGOẠI
PHỔ HỒNG NGOẠI
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6