Thiết lập một số chất đối chiếu từ lá đu đủ carica papaya l , caricaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ NGUYỄN VIỆT ĐỨC THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ LÁ ĐU ĐỦ Carica papaya L., Caricaceae Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Minh Thuận PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Nguyễn Việt Đức i LỜI CẢM ƠN Đề tài “Thiết lập số chất đối chiếu từ Đu đủ (Carica papaya L., Caricaceae)” hoàn thành hướng dẫn chu đáo tận tình Cơ PGS TS Võ Thị Bạch Huệ, Cô TS Nguyễn Thị Minh Thuận, với hỗ trợ, giúp đỡ Thầy Cô Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM Vì vậy, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quý Thầy Cô Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM, Khoa Dược – Trường Đại Học Lạc Hồng, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, Viện Cơng nghệ hóa học TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài nghiên cứu hỗ trợ gia đình, bạn bè suốt thời gian qua Học viên Nguyễn Việt Đức TĨM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2017-2019 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ LÁ ĐU ĐỦ Carica papaya L., Caricaceae Nguyễn Việt Đức Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Minh Thuận PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Mở đầu đặt vấn đề Lá Đu đủ có nhiều cơng dụng kháng khối u, kháng viêm, kháng khuẩn kháng nấm,… Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu từ Đu đủ để phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu Đu đủ sản phẩm chứa Đu đủ thị trường Mục tiêu đề tài phân lập chất tinh khiết Đu đủ nhằm góp phần tạo nguồn chất đối chiếu từ Đu đủ Đối tượng Lá Đu đủ thu hái Đồng Nai vào tháng năm 2018 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt với ethanol, lắc phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột chân không phương pháp tinh chế để phân lập hợp chất alcaloid flavonoid tinh khiết từ Đu đủ Sau xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết phương pháp phổ học (UV, IR, MS, NMR) Định lượng alkaloid toàn phần Đu đủ phương pháp chiết đo quang định lượng quercetin phương pháp HPLC Thiết lập chất đối chiếu từ hợp chất tinh khiết phân lập Kết bàn luận Quy trình chiết đồng thời cao alcaloid flavonoid từ Đu đủ xây dựng tối ưu với dung môi chiết ethanol 70% Từ cao chloroform thu 1000 mg carpain từ cao ethyl acetat phân lập 50 mg quercetin Kết định lượng cho thấy hàm lượng alkaloid tồn phần có Đu đủ 0,167% hàm lượng quercetin 153,74 µg/g Sau đó, chất đối chiếu carpain thiết lập để phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu Đu đủ Kết luận Đề tài xây dựng thẩm định quy trình định lượng alcaloid tồn phần quercetin có Đu đủ Thiết lập chất đối chiếu carpain với độ tinh khiết 98,36% ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2017 – 2019 ESTABLISH REFERENCE SUBSTANCES FROM PAPAYA LEAF Carica papaya L., Caricaceae Speciality: Drug quality control and toxicology code: 8720206 NGUYEN VIET DUC Supervisors: Dr NGUYEN THI MINH THUAN Assoc Prof VO THI BACH HUE Introduction Papaya leaves have several pharmacological activities, such as antitumor, antiinflammatory, anti-fungal, etc However, there has not been any research on establishing a reference substance from papaya leaves to serve the testing of medicinal papaya leaves and papaya leaf products on the market Therefore, the aim of this study is to isolate the pure substances from papaya leaves to contribute to the reference supply of papaya leaves Materials Leaves of Carica papaya L., were collected in Dong Nai in July, 2018 Methods Extraction method with ethanol, shaking of liquid – liquid distribution, vacuum column chromatography and refining methods were used to isolate pure compounds Structure of these substances were determined by spectroscopic methods (UV, IR, MS, NMR) Quantifications of total alkaloid and quercetin in papaya leaves were realized by photometric method and HPLC method, respectively Then reference substances were established from isolated pure compounds Results and Discussion A simultaneous extraction of alkaloid and flavonoids from Papaya leaves has been developed and optimized with 70% ethanol extraction solvent Then 1000 mg of carpain and 50 mg of quercetin were obtained from chloroform fraction and ethyl acetate fraction, respectively Quantitative results showed that the total alkaloid and quercetin amount of papaya leaves is 0.116% and 153.74 µg/g, respectively The carpain reference substance was then established to serve the testing of medicinal papaya leaves Conclutions We developed and validated the procedure for quantifying simultanously total alkaloid and quercetin in papaya leaves, and established carpain reference substance with 98.36% purity i MỤC LỤC MỤC LỤC vi DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật 1.2 Thành phần hóa học Tổng quan alcaloid Đu đủ .4 Tổng quan flavonoid Đu đủ 1.3 Tác dụng dược lý 1.4 Phương pháp phân lập hợp chất tinh khiết từ Đu đủ Phân lập alcaloid .8 Phân lập flavonoid 1.5 Tổng quan chất đối chiếu 10 Định nghĩa – Mục đích sử dụng chất đối chiếu 10 Phân loại chất đối chiếu 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Vật liệu 13 Dung mơi hóa chất 13 Dụng cụ, thiết bị 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 Nghiên cứu thực vật học sơ khảo sát thành phần hóa thực vật .14 Khảo sát quy trình chiết alcaloid flavonoid toàn phần .15 Tách, phân lập, xác định cấu trúc định lượng alcaloid 19 Tách, phân lập, xác định cấu trúc định lượng flavonoid 23 Thiết lập chất đối chiếu từ Đu đủ 26 i CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Nghiên cứu thực vật học sơ khảo sát thành phần hóa thực vật 30 Đặc điểm vi phẫu Đu đủ .30 Soi bột Đu đủ 30 Thử tinh khiết 31 Phân tích sơ thành phần hóa thực 32 3.2 Khảo sát quy trình chiết alcaloid flavonoid 33 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol lên hiệu suất chiết cao tồn phần 33 Khảo sát trình tự chiết cao alcaloid flavonoid toàn phần 34 3.3 Tách, phân lập, xác định cấu trúc định lượng alcaloid .37 Tách phân đoạn alcaloid sắc ký cột chân không 37 Tinh chế kiểm tra độ tinh khiết alcaloid 39 Xác định cấu trúc hợp chất CP1 42 Định lượng alcaloid toàn phần dược liệu Đu đủ phương pháp chiết đo quang 46 3.4 Tách, phân lập, xác định cấu trúc định lượng flavonoid 53 Tách phân đoạn flavonoid sắc ký cột chân không 53 Tinh chế kiểm tra độ tinh khiết flavonoid 54 Xác định cấu trúc hợp chất CP2 56 Định lượng quercetin Đu đủ HPLC-DAD 61 3.5 Thiết lập chất đối chiếu từ hợp chất CP1 68 Xác định độ tinh khiết carpain HPLC 69 Đóng lọ - Đánh giá độ đồng lọ 73 CHƯƠNG BÀN LUẬN .74 4.1 Chiết xuất alcaloid flavonoid toàn phần Đu đủ .74 4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn 74 4.3 Quy trình định lượng alcaloid toàn phần dược liệu Đu đủ .75 4.4 Quy trình định lượng quercetin dược liệu Đu đủ .75 4.5 Thiết lập chất đối chiếu .75 ii CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 5.1 Kết luận 76 5.2 Đề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dụng cụ thiết bị .13 Bảng 2.2 Các yếu tố điều kiện khảo sát 21 Bảng 3.1 Kết thử tinh khiết bột Đu đủ 31 Bảng 3.2 Kết khảo sát sơ thành phần hóa thực vật 32 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol lên hiệu suất chiết 33 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết (%) 36 Bảng 3.5 Hiệu suất chiết (%) 37 Bảng 3.6 Các phân đoạn cao CF 37 Bảng 3.7 So sánh phổ NMR hợp chất CP1 với carpain 45 Bảng 3.8 Kết độ hấp thu điều kiện khảo sát 46 Bảng 3.9 Cách pha giai mẫu chuẩn carpain 47 Bảng 3.10 Cách pha mẫu khảo sát độ .48 Bảng 3.11 Kết thẩm định tính tương thích hệ thống carpain .48 Bảng 3.12 Kết thẩm định tính tuyến tính 49 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ lặp lại 51 Bảng 3.14 Kết thẩm định độ xác trung gian 51 Bảng 3.15 Kết thẩm định độ 52 Bảng 3.16 Các phân đoạn cao EA 53 Bảng 3.17 So sánh phổ NMR hợp chất CP2 với quercetin .60 Bảng 3.18 Cách pha giai mẫu chuẩn quercetin .61 Bảng 3.19 Cách pha mẫu khảo sát độ .62 Bảng 3.20 Kết tính tương thích hệ thống quercetin 63 Bảng 3.21 Kết tính tuyến tính quercetin 65 Bảng 3.22 Kết thẩm định độ lặp lại 66 Bảng 3.23 Kết thẩm định độ xác .67 Bảng 3.24 Kết thẩm định độ 68 Bảng 3.25 Kết tính phù hợp hệ thống carpain 69 Bảng 3.26 Kết tính tuyến tính carpain 71 Bảng 3.27 Kết độ xác carpain 72 Bảng 3.28 Kết đánh giá đồng lọ 73 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nhân piperidin Hình 1.2 Cholin (trái), benzyl isothiocyanat (phải) Hình 1.3 Carpain (trái), pseudocarpain (phải) Hình 1.4 Dehydrocarpain I (trái), dehydrocarpain II (phải) Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo flavon .6 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo quercetin .6 Hình 1.7 Công thức cấu tạo kaempferol Hình 2.1 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol lên quy trình chiết .16 Hình 2.2 Quy trình chiết cao alcaloid trước, cao flavonoid sau 17 Hình 2.3 Quy trình chiết cao flavonoid trước, cao alcaloid sau 18 Hình 3.1 Cấu tạo vi phẫu Đu đủ 30 Hình 3.2 Lơng che chở (trái) mảnh mạch xoắn (phải) .31 Hình 3.3 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (trái) mảnh tế bào chứa tinh thể canxi oxalat (phải) .31 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol lên hiệu suất chiết 33 Hình 3.5 Sắc ký đồ so sánh trình tự chiết cao n-hexan 34 Hình 3.6 Sắc ký đồ so sánh trình tự chiết cao cloroform .35 Hình 3.7 Sắc ký đồ so sánh trình tự chiết cao ethyl acetat 35 Hình 3.8 SKLM cao phân đoạn CF UV 254 (a), UV 365 (b), TT Dragendorff (c) TT VS (d) 39 Hình 3.9 Sơ đồ tinh chế phân đoạn CF5 40 Hình 3.10 Sơ đồ tinh chế lọ E 40 Hình 3.11 Kết tinh lọ E (trái) kết tinh lọ E5 (phải) 41 Hình 3.12 SKLM hợp chất CP1 hệ dung mơi khác 41 Hình 3.13 Kết HPLC-ELSD hợp chất CP1 42 Hình 3.14 Phổ IR hợp chất CP1 43 Hình 3.15 Phổ HR-MS hợp chất CP1 .46 Hình 3.16 Phổ 13C-NMR hợp chất CP1 44 Hình 3.17 Phổ 1H-NMR hợp chất CP1 44 Hình 3.18 Công thức cấu tạo hợp chất CP1 45 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-43 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-44 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-45 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-46 PL 38 Độ định lượng quercetin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-47 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-48 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-49 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-50 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-51 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-52 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-53 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-54 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ Y TẾ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Số: /ĐHYD-SĐH Độc lập –Tự – Hạnh phúc Tp Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 09 năm 2019 KẾT LUẬN HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ Căn định số: 3500/QĐ-ĐHYD-SĐH ngày 05/9/2017 Hiệu trưởng Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh việc cơng nhận học viên trình độ thạc sĩ khóa 2017-2019; Căn định số 3168/QĐ-ĐHYD ngày 20/8/2019 Hiệu trưởng Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh việc thành lập Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ cho học viên: Nguyễn Việt Đức Ngày 12-09-2019 Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Hội đồng họp thức để học viên bảo vệ luận văn trước Hội đồng Đề tài: Thiết lập số chất đối chiếu từ Đu đủ Carica papaya L., Papayaceae Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất; Mã số: 8720210 Sau học viên trình bày luận văn trả lời câu hỏi phản biện, thành viên Hội đồng; Hội đồng họp thống nội dung sau: Những kết luận khoa học bản, điểm mới, đóng góp luận văn: Đề tài phân lập định lượng carpain từ Đu đủ đạt độ tinh khiết 98,36 %, phân lập định lượng quercetin từ Đu đủ đạt độ tinh khiết 99,01% thiết lập chất đối chiếu carpain với độ tinh khiết 98,36% Cơ sở khoa học, độ tin cậy luận điểm kết luận nêu luận văn: Luận văn có sở khoa học, thực công việc nghiên cứu theo hướng dẫn hành, luận điểm kết luận có độ tin cậy Ý nghĩa lý luận thực tiễn, đề nghị sử dụng kết nghiên cứu đề tài luận văn: : Đề tài tách carpain Đu đủ đạt độ tinh khiết 98,36 % thiết lập chất đối chiếu để đánh giá hàm lượng alcaloid dược liệu Đu đủ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Mức độ đáp ứng yêu cầu luận văn: đề tài đáp ứng yêu cầu mặt nội dung hình thức luận văn thạc sĩ Những điểm cần bổ sung, sửa chữa luận văn: • Đổi tên đề tài thành “Thiết lập số chất đối chiếu từ Đu đủ Carica papaya L., Caricaceae” • Trình bày lại tồn luận văn theo đóng góp hội đồng thầy phản biện Kết luận: Luận văn đáp ứng yêu cầu nội dung hình thức Luận văn cao học Căn vào kết bỏ phiếu (04 tán thành), Hội đồng đánh giá luận văn đề nghị Hiệu trưởng công nhận học vị thạc sĩ cho học viên Nguyễn Việt Đức CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS Vĩnh Định Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự – Hạnh Phúc GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA LUẬN VĂN THEO Ý KIẾN HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ - Học viên : Nguyễn Việt Đức - Đề tài: Thiết lập số chất đối chiếu từ Đu đủ Carica papaya L., Caricaceae - Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 - Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Minh Thuận PGS TS Võ Thị Bạch Huệ Luận văn bổ sung sửa chữa cụ thể điểm sau: Đổi tên đề tài thành “Thiết lập số chất đối chiếu từ Đu đủ Carica papaya L., Caricaceae” Chỉnh sửa bổ sung liệu phổ IR, NMR Chỉnh sửa cách trình bày tài liệu tham khảo số 7, 9, 14, 20, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 33, 34, 37, 40, 41 Rút gọn phần phụ lục TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 09 năm 2019 NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Ký tên ghi rõ họ tên) HỌC VIÊN (Ký tên ghi rõ họ tên) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN (Ký tên ghi rõ họ tên) PGS TS Vĩnh Định Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... chiết alcaloid flavonoid tồn phần .15 Tách, phân l? ??p, xác định cấu trúc định l? ?ợng alcaloid 19 Tách, phân l? ??p, xác định cấu trúc định l? ?ợng flavonoid 23 Thiết l? ??p chất đối chiếu từ Đu đủ ... ? ?Thiết l? ??p số chất đối chiếu từ Đu đủ Carica papaya L. , Caricaceae? ?? thực với mong muốn góp phần tạo nguồn chất đối chiếu từ Đu đ? ?, phục vụ cho công tác kiểm tra chất l? ?ợng nguyên liệu chế phẩm... phân l? ??p định danh chất có Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu thiết l? ??p chất đối chiếu từ Đu đủ để phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu Đu đủ sản phẩm chứa Đu đủ thị trường Vì vậy, đề tài ? ?Thiết l? ??p