Nghiên cứu sơ bộ thiết lập schisandrin làm chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu ngũ vị tử ngọc linh (schisandra sphenathera rehder e h wilson)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ NGỌC HOẠT Mã sinh viên: 1201236 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THIẾT LẬP SCHISANDRIN LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤC VỤ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ NGỌC LINH (SCHISANDRA SPHENANTHERA REHDER & E.H WILSON) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ NGỌC HOẠT 1201236 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THIẾT LẬP SCHISANDRIN LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤC VỤ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ NGỌC LINH (SCHISANDRA SPHENANTHERA REHDER & E.H WILSON) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà PGS.TS Phương Thiện Thương Nơi thực hiện: Viện Dược Liệu HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận thực hoàn thành Viện Dược Liệu với hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà PGS.TS Phương Thiện Thương Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phương Thiện Thương PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà định hướng nghiên cứu, hướng dẫn góp ý giúp em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dược Liệu cán bộ, anh chị khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ em học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên không tránh thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn sinh viên Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Hồ Ngọc Hoạt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu sơ lược họ Ngũ vị (Schisandraceae) 1.2 Tổng quan chi Schisanda .3 1.2.1 Giới thiệu chi Schisandra 1.2.2 Một số loài thuộc chi Schisandra Việt Nam 1.3 Tổng quan Ngũ vị tử Ngọc Linh 1.3.1 Đặc điểm thực vật .6 1.3.2 Phân bố .7 1.3.3 Một số kết nghiên cứu thành phần hóa học NVTNL 1.3.4 Các hợp chất lignan 1.3.5 Tác dụng dược lý 1.4 Tổng quan schisandrin .10 1.4.1 Công thức cấu tạo 10 1.4.2 Tính chất hóa lý schisandrin .11 1.4.3 Tác dụng sinh học 11 1.4.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng schisandin Ngũ vị tử 13 1.5 Tổng quan phương pháp xác định cấu trúc schisandrin 15 1.6 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng 15 1.6.1 Vài nét phương pháp TLC áp dụng nghiên cứu định tính 15 1.6.2 Vài nét phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu .20 2.2 Phương tiện nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết bị 20 2.2.2 Dụng cụ 20 2.2.3 Hóa chất 21 2.3 Nội dung nghiên cứu .21 2.3.1 Phân lập chất schisandrin từ NVTNL .21 2.3.2 Định tính schisandrin NVTNL TLC 21 2.3.3 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin NVTNL HPLC 21 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích schisandrin HPLC 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 22 2.4.2 Phân lập schisandrin từ NVTNL .22 2.4.3 Phương pháp định tính schisandrin NVTNL TLC 23 2.4.4 Xây dựng phương pháp định lượng schisandrin NVTNL HPLC 24 2.4.5 Thẩm định phương pháp định lượng schisandrin HPLC 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 27 3.1 Phân lập schisandrin .27 3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ NVTNL 27 3.1.2 Phân lập schisandrin phương pháp sắc ký cột 27 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học NVT1 30 3.1.4 Định lượng lại schisandrin phân lập 31 3.2 Xây dựng phương pháp định tính schisandrin NVTNL phương pháp TLC .32 3.3 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin NVTNL phương pháp HPLC 35 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 35 3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 38 3.4 Thẩm định phương pháp 42 3.4.1 Khảo sát tính phù hợp hệ thống .42 3.4.2 Tính chọn lọc 42 3.4.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 43 3.4.4 Xây dựng đường chuẩn xác định khoảng tuyến tính 44 3.4.5 Thẩm định độ lặp lại 45 3.4.6 Thẩm định độ thu hồi 46 3.5 Kết định lượng schisandrin mẫu dược liệu NVTNL 46 3.6 Bàn luận 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AS 13 C-NMR Chú thích Hệ số đối xứng pic Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) DĐHK Dược điển Hồng Kông DĐTQ Dược điển Trung Quốc EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol H-NMR HPLC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy) Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lương (Linmit of Quantitation) MeOH MS NVTNL RS Methanol Khối phổ (Mass spectroscopy) Ngũ vị tử Ngọc Linh Độ phân giải SKĐ Sắc ký đồ TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Công thức cấu tạo số chất phân lập NVTNL Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) chất NVT1 schizandrin theo tài liệu tham khảo 30 Bảng 3.2: Kết khảo sát chương trình 37 Bảng 3.3: Kết khảo sát dung môi chiết 38 Bảng 3.4: Kết khảo sát nồng độ dung môi 39 Bảng 3.5: Kết khảo sát số lần chiết 30 Bảng 3.6: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống 42 Bảng 3.7: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 44 Bảng 3.8: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 45 Bảng 3.9: Kết khảo sát độ thu hồi 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Ngũ vị tử Ngọc Linh Hình 1.2: Công thức cấu tạo schisandrin 10 Hình 2.1: Dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 20 Hình 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao NVTNL 27 Hình 3.2: Sắc ký đồ mỏng schisandrin (1) với phân đoạn 28 Hình 3.3: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập schisandrin cao dichloromethan từ NVTNL 29 Hình 3.4: Công thức cấu tạo schisandin 31 Hình 3.5: Sắc ký đồ schisandrin tách 32 Hình 3.6: Sắc ký đồ hệ dung môi 34 Hình 3.7: Phổ UV-VIS schisandrin 35 Hình 3.8: Sắc ký đồ chương trình gradient 37 Hình 3.9: Biểu đồ phụ thuộc hàm lượng schisandrin vào dung môi chiết 40 Hình 3.10: Tóm tắt quy trình xử lý mẫu 41 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thêm chuẩn 43 Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu chuẩn schisandrin nồng độ 0,1 µg/mL 43 Hình 3.13: Đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính schisandrin 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngũ vị tử Ngọc Linh (NVTNL) loài ngũ vị tử tìm thấy vào đầu năm 2007 vùng núi Ngọc Linh, Kon Tum nhà thực vật học xác định tên khoa học Schisandra sphenanthera Rehder et Wils., thuộc họ Ngũ vị tử (Schisandraceae) [4] Như vậy, ngũ vị tử Ngọc Linh loài Ngũ vị tử nam Trung Quốc [4], [20], [23], [36] Tương tự Ngũ vị tử nam qui định DĐTQ, NVTNL dùng y học cổ truyền với nhiều tác dụng chống co giật, thuốc bổ, an thần, chữa phế hư, ho tức ngực, di tinh Nhiều nghiên cứu gần cho thấy Ngũ vị tử Ngọc Linh có tác dụng điều trị viêm gan siêu vi mạn [4], [25], [32], [33], bảo vệ thận [28], chống oxy hóa [19], nhiều tác dụng khác [21] Quả Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera nghiên cứu xác định thành phần hóa học có nhiều hợp chất lignan (schisandrin, gomisin, schisandrin A, schisantherin), hợp chất terpenoid (β-sitosterol, henridilacton, ) tinh dầu dễ bay [10], [12] Một số nghiên cứu gần nước ta phân lập schisandrin từ NVTNL, hoạt chất có nhiều tác dụng như: chống oxy hóa, điều trị viêm gan, hen xuyễn, chống viêm, chống đông máu [4] Theo nghiên cứu, schisandrin có hàm lượng thấp loài Ngũ vị tử nam khác (Schisandra sphenanthera) lại thành phần loài Ngũ vị tử bắc (Schisandra chinensis) phân bố chủ yếu Đông Bắc Trung Quốc [23], [27], [34], [36] Trong khảo sát sơ phát thấy schisandrin thành phần loài NVTNL Hiện nước ta chưa có nghiên cứu xác định hàm lượng schisandrin NVTNL, điều gợi ý cho thực nghiên cứu để xác định hàm lượng schisandrin loài NVTNL để tạo thêm sở khoa học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu NVTNL, xa đưa NVTNL vào thay loài Ngũ vị tử (bắc nam) phải nhập từ Trung Quốc 56 Phổ 13C-NMR 57 Phổ MS 58 Phụ lục 2: SKĐ dung môi chiết ethanol SKĐ dung môi chiết methanol 59 SKĐ dung môi chiết EtOH 40% SKĐ dung môi chiết EtOH 60% SKĐ dung môi chiết EtOH 80% 60 SKĐ dung môi chiết EtOH 100% SKĐ lần chiết SKĐ lần chiết 61 SKĐ lần chiết Phụ lục 3: SKĐ dung dịch chuẩn 62 63 64 Phụ lục 4: SKĐ tính tương thích hệ thống 65 66 Phụ lục 5: SKĐ độ lặp lại 67 68 Phụ lục 6: SKĐ độ thu hồi 69 70 ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H C DƯỢC H NỘI H NGỌC HOẠT 1201236 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THIẾT LẬP SCHISANDRIN LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤC VỤ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ NGỌC LINH (SCHISANDRA SPHENANTHERA REHDER. .. đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Reader & E. H Wilson) với mục tiêu sau đây: Phân lập schisandrin từ NVTNL làm chất đối chiếu Định tính định lượng... vùng núi Ngọc Linh, Kon Tum nhà thực vật h c xác định tên khoa h c Schisandra sphenanthera Rehder et Wils., thuộc h Ngũ vị tử (Schisandraceae) [4] Như vậy, ngũ vị tử Ngọc Linh loài Ngũ vị tử nam