Thiết lập một số chất đối chiếu alcaloid từ thân hành trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l , amaryllidaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - Nguyễn Thị Tuyết Nhung THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Luận văn Thạc sĩ Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - Nguyễn Thị Tuyết Nhung THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phan Văn Hồ Nam PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Thị Tuyết Nhung ii Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2016-2018 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất – Mã số: 8720210 THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Nguyễn Thị Tuyết Nhung Người hướng dẫn khoa học: TS Phan Văn Hồ Nam PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Từ khóa: Crinum latifolium L., thân hành, chất đối chiếu, hippadin, lycorin Mở đầu: Trinh nữ hoàng cung (TNHC) sử dụng dân gian để điều trị u xơ, ung thư tử cung u xơ, ung thư tuyến tiền liệt Lá thân hành hai phận dùng Thành phần chủ yếu mang lại tác dụng sinh học cho TNHC alcaloid Có nhiều chế phẩm từ TNHC lưu hành thị trường, dẫn đến vấn đề quản lý đảm bảo chất lượng nguyên liệu chế phẩm chứa TNHC, khâu quan trọng liên quan đến việc đánh giá, kiểm tra chất lượng chất đối chiếu Vì đề tài thực với mục tiêu thiết lập chất đối chiếu alcaloid từ thân hành TNHC Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: hợp chất tự nhiên từ thân hành TNHC Phương pháp nghiên cứu: chiết cao alcaloid toàn phần từ thân hành TNHC phương pháp ngấm kiệt, tách phân lập hợp chất tự nhiên từ thân hành TNHC sắc kí cột Hợp chất phân lập xác định cấu trúc phương pháp phổ nghiệm Xác định độ tinh khiết phương pháp HPLC thiết lập chất đối chiếu (CĐC) Sử dụng CĐC thiết lập để định lượng alcaloid thân hành TNHC phương pháp HPLC Kết quả: từ 10 kg thân hành TNHC phân lập 470,2 mg hippadin; 270,6 mg daucosterol; 570,4 mg lycorin 80,1 mg hợp chất CL (C18H21NO5) Thiết lập chất đối chiếu hippadin (99,75%) Xây dựng quy trình định lượng hippadin thân hành TNHC phương pháp HPLC Kết luận: đề tài xây dựng quy trình chiết cao alcaloid tồn phần từ thân hành TNHC, phân lập hợp chất tinh khiết định danh hippadin, daucosterol, lycorin CL alcaloid có cơng thức phân tử C18H21NO5 Hippadin phân lập có khối lượng lớn độ tinh khiết cao sử dụng làm chất đối chiếu để định lượng hippadin dược liệu TNHC iii Master’s Thesis – Academic course: 2016 – 2018 Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210 ESTABLISH REFERENCE STANDARDS FROM THE BULBS OF Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Nguyen Thi Tuyet Nhung Supervisors: Dr Phan Van Ho Nam and Assoc Prof Dr Vo Thi Bach Hue Keywords: Crinum latifolium, the bulbs, reference standards, hippadine, lycorine Introduction: Crinum latifolium is used in Vietnamese folk medicine as an anticancer remedy, rubefacient, tonic and for treatment of allergic disorders and tumor diseases These activities are attributed to the presence of Amaryllidaceae alkaloids Nowaday, a large number of functional foods, drugs from Crinum latifolium are circulating in the Vietnamese market such as Crila, CrilaOPC, Tadimax … Therefore, the management and quality control of these products is essential, the study was carried out with the aim of establishing reference standards from the bulbs of Crinum latifolium L for quality control of herbs and Crinum latifolium containing preparations Materials and methods: Object of study: the natural subtances from the bulbs of Crinum latifolium L Methods: bulb powder of Crinum latifolium was percolated with ethanol 70%, percolate obtained was evaporated at 65 ℃ to give a liquid extract The extract was fractionated by distribution with solvents and the fractions were then chromatographed on silica gel 60 (0.40 – 0.063 mm) The pure compound was isolated, purified and elucidated by NMR, MS, IR and UV-Vis spectrum The isolated compound was determined its purity by high performance liquid chromatography (HPLC) and established reference standards Using established reference standards to quantify alcaloid in Crinum latifolium by HPLC Results: From 10 kg of bulb powder of Crinum latifolium, the study isolated 470,2 mg of hippadine; 270,6 mg of daucosterol; 570,4 mg of lycorine and 80,1 mg of CL (C18H21NO5); established a reference standard – hippadine (99,75%) and developed a process to quantify hippadin in Crinum latifolium by HPLC Conclusions: The study developed a process to extract total alcaloid from the bulbs of Crinum latifolium, and isolated pure compounds identified as hippadine, daucosterol, lycorine and CL (C18H21NO5) Hippadine is established as a reference standard and used to determinate hippadine in Crinum latifolium by HPLC iv MỤC LỤC MỤC LỤC iv BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC SƠ ĐỒ x MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TRINH NỮ HOÀNG CUNG 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHIẾT XUẤT - PHÂN LẬP ALCALOID .16 1.3 TỔNG QUAN VỀ CHẤT ĐỐI CHIẾU 18 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG – NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.2 DUNG MƠI, HĨA CHẤT - THIẾT BỊ 22 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .35 3.1 CHIẾT CAO ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TNHC 35 3.2 KẾT QUẢ TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT ALCALOID BẰNG SẮC KÝ CỘT .43 3.3 KIỂM TRA - XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT 49 3.4 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 71 3.5 ĐỊNH LƯỢNG HIPPADIN TRONG THÂN HÀNH TNHC BẰNG HPLC.78 Chương BÀN LUẬN 89 v 4.1 CHIẾT XUẤT ALCALOID TRONG THÂN HÀNH TNHC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGẤM KIỆT 89 4.2 PHÂN LẬP HỢP CHẤT TINH KHIẾT TỪ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN .92 4.3 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 94 4.4 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALCALOID 94 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .95 5.1 KẾT LUẬN .95 5.2 ĐỀ NGHỊ 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO .98 DANH MỤC PHỤ LỤC PL -1 Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-1 .PL -2 Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-2 .PL -7 Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-3 .PL -17 Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-4 .PL -26 Phụ lục THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HIPPADIN - KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỒNG NHẤT LIÊN PHỊNG THÍ NGHIỆM PL -38 vi BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 13 C-NMR H-NMR Ý nghĩa Chữ nguyên C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 13C H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13 CĐC Chất đối chiếu Chất đối chiếu d Doublet Đỉnh đôi DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide GC - MS Gas Chrotography Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép nối khối phổ HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC IR Infrared Hồng ngoại j Coupling constant Hằng số ghép m Multiplet Nhiều đỉnh, đỉnh bội MS Mass Spectrometry Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm Part per million Phần triệu PTN Phịng thí nghiệm Phịng thí nghiệm s Singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc kí lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng TNHC Trinh nữ hoàng cung Trinh nữ hoàng cung TT Thuốc thử Thuốc thử UV Ultraviolet Tử ngoại UV - Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không VS Vanilin – sulfuric Thuốc thử Vanilin - sulfuric vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học alcaloid khung crinin .9 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin 11 Hình 1.3 Cấu trúc khung lycorenin 11 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học alcaloid khung belladin .11 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học khung cheryllin 12 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học khung augustamin 12 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học số hợp chất flavonoid TNHC 13 Hình 2.1 Một số phận Trinh nữ hoàng cung 21 Hình 3.1 SKLM so sánh thân hành phơi sấy 36 Hình 3.2 SKLM so sánh dung môi chiết 38 Hình 3.3 SKLM so sánh tác nhân kiềm hóa .39 Hình 3.4 SKLM khảo sát ảnh hưởng pH đến quy trình chiết 40 Hình 3.5 SKLM phân đoạn cao HA 44 Hình 3.6 SKLM phân đoạn cao CF 46 Hình 3.7 SKLM hợp chất CL1, CL2, CL3, CL .47 Hình 3.8 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 49 Hình 3.9 SKLM hợp chất CL – hệ dung mơi 50 Hình 3.10 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 50 Hình 3.11 SKĐ xác định độ tinh khiết HPLC hợp chất CL 52 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hippadin 55 Hình 3.13 Khảo sát độ tinh khiết hợp chất CL sắc ký lớp mỏng 56 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học β-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid 60 Hình 3.15 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 61 Hình 3.16 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 62 Hình 3.17 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 62 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học lycorin 65 Hình 3.19 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 66 viii Hình 3.20 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 67 Hình 3.21 SKLM hợp chất CL – hệ dung môi 67 Hình 3.22 SKĐ xác định độ tinh khiết HPLC hợp chất CL 68 Hình 3.23 SKĐ đánh giá tính đặc hiệu quy trình kiểm tinh khiết hippadin .73 Hình 3.24 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ quy trình xác định độ tinh khiết hippadin 74 Hình 3.25 SKĐ khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng hippadin 83 Hình 3.26 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ quy trình định lượng hippadin 84 Hình 4.1 SKLM lycorin bị phân hủy 93 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL24 Phổ HSQC CL-3 (DMSO-d6, 500 MHz) (vùng δC 96 - 120, δH 5,3 – 6,9) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL25 Phổ HSQC CL-3 (DMSO-d6, 500 MHz) (vùng δC 25 - 75, δH 1,8 - 4,4) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL26 PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-4 Phổ IR CL-4 Phổ MS CL-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ 1H-NMR CL-4 (CDCl3, 500 MHz) PL27 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ 1H-NMR CL-4 (CDCl3, 500 MHz) (vùng δH 3,2 – 6,6) PL28 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ 1H-NMR CL-4 (CDCl3, 500 MHz) (vùng δH 0,6 – 2,7) PL29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ 13C-NMR CL-4 (CDCl3, 125 MHz) PL30 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ 13C-NMR CL-4 (CDCl3, 125 MHz) (vùng δC 90 – 150) PL31 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ 13C-NMR CL-4 (CDCl3, 125 MHz) (vùng δC 15 – 80) PL32 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ DEPT CL-4 (CDCl3, 125 MHz) PL33 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phổ DEPT CL-4 (CDCl3, 125 MHz) (vùng δC 15 – 110) PL34 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL35 Phổ HSQC CL-4 (CDCl3, 500 MHz) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL36 Phổ HSQC CL-4 (CDCl3, 500 MHz) (vùng δC 55- 105, δH 3, – 6,6) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL37 Phổ HSQC CL-4 (CDCl3, 500 MHz) (vùng δC 15 - 80, δH 1,0 - 4,5) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL38 PHỤ LỤC THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HIPPADIN - KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỒNG NHẤT LIÊN PHỊNG THÍ NGHIỆM Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... l? ?, thân hành, hoa rễ TNHC[ 3, 4, 5 ], nhiên nghiên cứu thiết l? ??p chất đối chiếu alcaloid TNHC l? ??i Vì vậy, đề tài ? ?Thiết l? ??p số chất đối chiếu alcaloid từ thân hành Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium. .. Thị Tuyết Nhung THIẾT L? ??P MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L. , Amaryllidaceae Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ... 2016-2018 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất – Mã số: 8720210 THIẾT L? ??P MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L. , Amaryllidaceae Nguyễn Thị Tuyết Nhung Người