Nghiên cứu chiết xuất hợp chất alkaloid từ rễ trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l amaryllidaceae

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT HỢP CHẤT ALKALOID TỪ RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Ngọc Tú Tp Hồ Chí Minh, 14 tháng năm 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG 2.1.1 Danh pháp phân loại [1], [7],[12], [9] 2.1.2 Mô tả thực vật [1], [2],[12] 2.1.3 Phân bố địa lý [1] 2.1.4 Bộ phận dùng [2] 2.1.5 Thành phần hóa thực vật [1], [3], [17],[20], [24] 2.1.6 Tác dụng trị liệu 2.2 ALKALOID 2.2.1 Định nghĩa [8], [23] 2.2.2 Tính chất hóa học [8] 2.2.3 Phân loại alkaloid [8], [31] 2.2.4 Chiết xuất alkaloid [8], [18] 10 2.2.5 Alkaloid TNHC[5], [10], [11], [17], [24],[30] 11 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT HÓA HỌC 15 2.3.1 Phương pháp sắc ký để tách chất tinh khiết [28] 15 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc 17 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 3.1.1 Nguyên vật liệu 19 3.1.2 Dung môi 19 3.1.3 Trang thiết bị 19 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.2.1 Chiết xuất alkaloid từ cao cồn rễ TNHC 19 3.2.2 Tách alkaloid phương pháp sắc ký cột nhanh 21 3.3.3 Phân lập tinh chế hợp chất từ phân đoạn sắc ký cột 22 3.3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 22 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24 4.1 CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TỪ CAO CỒN RỄ TNHC 24 4.2 PHÂN TÁCH CÁC ALKALOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT NHANH 24 4.2.1 Chuẩn bị 24 4.2.2 Tiến hành 24 4.2.3 Kết 25 4.3 PHÂN LẬP VÀ TINH KHIẾT HÓA CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN SẮC KÝ CỘT NHANH 28 4.3.1 Phân đoạn F2 28 4.3.2 Phân đoạn F4 30 4.3.3 Phân đoạn F5 31 4.3.4 Phân đoạn F6 33 4.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 37 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 5.1 KẾT QUẢ 44 5.2 BÀN LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC PHỤ LUC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời đại mà ngành khoa học dược phẩm phát triển không ngừng, hướng nghiên cứu hợp chất tự nhiên hay bán tổng hợp giữ vị trí quan trọng Đặc biệt, nước phát triển Việt Nam, việc sử dụng phổ biến phương thuốc cổ truyền tạo điều kiện phát triển hiệu tốt, giá hợp lý gần gũi với sống thường ngày Nằm vùng khí hậu nhiệt đới, Việt Nam sở hữu hệ động thực vật phong phú Điều tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu phát triển hợp chất thiên nhiên quý nhằm điều trị bệnh nan y Trong số thuốc đó, Trinh nữ hoàng cung (TNHC) từ lâu lên phương thuốc đầy hứa hẹn việc điều trị số bệnh phì đại tuyến tiền liệt, u xơ tử cung, u nang buồng trứng, Nhờ tính chất quý giá đó, TNHC mục tiêu nhiều nghiên cứu, chủ yếu thực lá, hoa thân hành Tuy nhiên, nghiên cứu hợp chất rễ hạn chế Đặc biệt hợp chất alkaloid biết đến với tác dụng kháng ung thư, gây độc tế bào, Với lý nêu trên, đề tài « Nghiên cứu chiết xuất hợp chất alkaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L Amaryllidaceae » thực với mục tiêu cụ thể sau: ❖ Rễ TNHC rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu hồi cồn thu cao cồn tồn phần rễ ❖ Xây dựng quy trình chiết alkaloid toàn phần từ cao cồn rễ TNHC ❖ Phân lập phân đoạn alkaloid từ cao cồn rễ TNHC phương pháp sắc ký cột nhanh thu 10 phân đoạn Các phân đoạn chọn lọc có khối lượng cao có nhiều alkaloid tiến hành sắc ký cột cổ điển thu hợp chất alkaloid Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập SKLM HPLC ❖ Xác định cấu trúc hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG 2.1.1 Danh pháp phân loại [1], [7],[12], [9] Tên khoa học: Crinum latifolium L Amaryllidaceae Tên tiếng Việt: Trinh nữ hoàng cung, Tỏi lơi, Tỏi lơi rộng, Tỏi Thái Lan, Náng rộng Tên tiếng Pháp: Crinole pourprée, crinole feuille large,… Phân loại : Plantae Cormobionta Magnoliophyta Liliopsida Liliidae Amaryllidales 2.1.2 Mô tả thực vật [1], [2],[12] Amaryllidaceae Crinum Crinum latifolium L loại cỏ, sống nhiều năm, thân phủ lớp hành với đường Crinum L Bên kính thân khoảng 10-15 cm, vùi sâu đất Một thân giả dài khoảnglatifolium 10-15 cm ngồi thân hành, có vỏ màu nâu tạo thành từ vảy mọng nước, màu trắng, bao bọc tạo thành lớp bảo vệ Lá có mép lượn sóng, mỏng, đỉnh nhọn hình giáo, dài 80-100 cm, rộng 3-8 cm, có ống phần dưới, mở rộng có bẹ ơm thân đáy Hai mặt có gân song song, mặt có màu tối mặt Cụm hoa gồm 6-12 hoa trắng, có vài điểm có màu hồng, bao bọc bắc trắng dạng thìa Tràng hoa cấu tạo cánh hoa màu hồng dài 10-15 cm, rộng 2,5 cm, dính phần ba chiều dài tạo thành ống hẹp Bộ nhị gồm nhị, gắn vào bên ống bao hoa thành vịng Mỗi nhị có dạng sợi cong dài khoảng 7-8 cm Nhụy có dạng sợi dài đính vào bầu nhụy tạo thành nỗn bên Quả có dạng hình cầu Cây Lá Hoa Quả Thân hành Rễ Hình Một số phận TNHC 2.1.3 Phân bố địa lý [1] Bắt nguồn từ Ấn Độ, Crinum latifolium L chủ yếu phân bố vùng nhiệt đới Hiện nay, TNHC trồng nhiều nước Đông Nam Á Thái Lan, Lào, Malaysia, Campuchia, Việt Nam, , phía nam Trung Quốc Ở Việt Nam, TNHC trồng miền, chủ yếu tỉnh ven biển Quảng Nam, Bình Định, Bình Thuận, Vũng Tàu TNHC sinh trưởng phát triển mạnh vào mùa xuân miền Bắc đầu mùa mưa miền Nam Là loại cỏ phù hợp với điều kiện nóng ẩm nhiều ánh sáng Nó cho năm từ 6-8 mới, 3-5 thân hành Ra hoa năm chúng không cho Việt Nam, nơi mà chúng nhân giống thân hành Trong Ấn Độ Thái Lan, chúng nhân giống hạt 2.1.4 Bộ phận dùng [2] Bộ phận dùng thân hành tươi khơ Một số nước, học cịn dùng cánh hoa sấy khơ 2.1.5 Thành phần hóa thực vật [1], [3], [17],[20], [24] Các hợp chất hóa học TNHC nghiên cứu từ năm 1980 nhiều nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản Việt Nam Những hợp chất chúng chủ yếu thuộc nhóm lớn : alkaloid flavonoid Khoảng 180 alkaloid thuốc nhóm khác phân lập định danh Phần lớn số có khung crinine (5,10-b-enthanophenanthridin), lycorine (benzopyrano- (3,4-g) - indole) tazettine (2-benzopyrano- (3.4 c) -indole) Khoảng 100 hợp chất alkaloid phân lập đinh danh Chúng thuộc nhóm flavonoid, nhóm mang màu, coumarin, terpen, steroid, alcool, aldehyd, ceton, acid, ester hay hydrocarbon mạch dài Phenolique nhóm số hợp chất khơng alkaloid Năm 1997, Nguyễn Hồng cộng phân lập 11 alkaloid, 11 acid hữu acid amin phenylalanin, l-leucin, dl-valin l-arginin Mai Đình Trị, Nguyễn Cơng Hào tìm thấy dịch chiết TNHC flavonol glycosid kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid et kaempferol-3-4’-di-O-β-D- glucopyranosid Sự tồn phenylpropanoid ((E)-p-hydroxycinnamat methyl, (E)-3,4dihydroxycinnamat ethyl), coumarin (senecioyloxymethyl-3,4- dimethoxycoumarin) hai hợp chất cycloartenol ghi nhận 2.1.6 Tác dụng trị liệu Nhiều nhà nghiên cứu công bố nhiều tác dụng dược lý TNHC việc điều trị số bệnh : bệnh tiết niệu, mụn nhọt,bệnh phụ khoa, ung thư cổ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt,… Tác dụng kháng acetylcholinesterase [14], [26], [27] Hoạt tính kháng acetylcholinesterase TNHC chứng minh tác dụng ức chế acetylcholinesterase giảm theo độ phân cực hợp chất alkaloid Crinamidin có hoạt tính ức chế trung bình 6-hydroxycrinamidin có hoạt tính yếu Dịch chiết methanol từ thân hành Crinum jagus (45,1%) Crinum glaucum (40,8%) với nồng độ 100 µg/ml có tác dụng kháng acetylcholinesterase liên quan đến dienj nhóm hydroxyl cấu trúc alkaloid Dịch chiết tứ thân hành Crinum bulbispermum có tác dụng kháng acetylcholinesterase với IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml dịch chiết Crinum moorei có tác dụng ức chế với IC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml Hoạt tính giải thích alkaloid Tác dụng chống oxy hóa [22] Liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa flavonoid TNHC, isoquercitrin chứng minh khả chống oxy hóa dập tắt gốc tự tốt astraglin, tương đương 50% so với vitamin E khả ức chế tiến trình peroxyd tốt astragalin vitamin E In vitro, khả chống oxy hóa dịch chiết nước đánh giá bắng cách sử dụng phép thử ORAC (khả dập tắt chất oxy hóa thơng qua hệ thống vận chuyển proton) mang đến kết đáng ý 1610 ±150 μmol Trolox đương lượng/g Dịch chiết methanol Crinum moorei có tác dụng chống oxy hóa với EC50 = ,06 ± 1,54 µg/ml tương ứng với vitamin C với EC50 = 5,06 ± 0,2 µg/ml Tác dụng kháng khối u kích thích miễn dịch [1], [17],[19], [22], [25] Năm 2011, Nguyễn Thị Ngọc Trâm cộng công bố dịch chiết nước Crinum latifolium L có khả ức chế tính miễn dịch tế bào bạch cầu mono máu ngoại biên tăng simh tế bào ung thư tuyến tiền liệt Thực tế, đo liều phụ thuộc tác dụng ức chế dịch chiết dựa dự tăng sinh tế bào di cao : tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người PC3 (IC50 = 4,5 ± 0,8 mg / ml), tế bào nhạy cảm hormon LNCaP (IC50 = 2,1 ± 0,04 mg / ml) tế bào tăng sinh tuyến tiền liệt lành tính BPH-1 (IC50 = 2,1 ± 0,04 mg / ml) Theo nghiên cứu này, ức chế tăng sinh tế bào ung thư phục hồi chức tế bào hệ thống miễn dịch hai yếu tố quan trọng đặc tính kháng ung thư loài In vitro, dịch chiết nước Crinum latifolium L (1 – mg/ml) cho hoạt tính kích thích miễn dịch, đặc biệt kích thích trực tiếp tế bào TCD4+ bạch cầu mono thu từ máu ngoại biên Dịch chiết ức chế tế bào NF-κB (Nuclear factor-kappa B), liên quan tới tác dụng kháng ung thư kháng viêm Panacrin (một hợp chất loài Crinum latifolium L., Panax proto-ginseng, Carica papaya) nghiên cứu tác dụng kháng khối u In vivo, panacrin làm giảm kích thước khối u (tế mà sarcoma TG-180 chuột), làm giảm tỷ lệ phân bào ung thư ác tính Do đó, làm ức chế di Panacrin dùng cho bệnh nhân mắc ung thư dày, ung thư gan ung thư bạch cầu, chứng minh lợi ích (tác dụng tốt, tác dụng phụ) so với nhóm chứng sau tháng sử dụng Thế nhưng, thiếu bệnh nhân nên kết khơng có ý nghĩa thống kê Lycorin, alkaloid họ Amaryllidaceae, ức chế mạnh tổng hợp protein ADN tế bào chuột, tăng sinh khối u cổ trướng cấy chuột In vitro, lycorin làm giảm cách đáng kể khả sống tế bào ung thư Vả lại, cịn có tác dụng ức chế tổng hợp vitamin C Tác dụng giảm đau [25] Nhờ có cấu trúc giống morphin hay codein, số alkaloid TNHC có tính chất giảm đau Bảng Tác dụng giảm đau số alkaloid Tác dụng giảm đau 6,2 14,7 Alkaloid Buphanidrin (±) Crinan Thời gian (phút) 106 108 Nhận xét LD50 8,9 LD50 36,4 AN 10 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 11 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 12 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHỤ LỤC DỮ LIỆU KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT F5.A BẰNG HPLC AN 13 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 14 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 16 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 17 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHỤ LỤC DỮ LIỆU KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT F6.A BẰNG HPLC AN 19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 21 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 22 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 23 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC AN 24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC ... Với l? ? nêu trên, đề tài « Nghiên cứu chiết xuất hợp chất alkaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L Amaryllidaceae » thực với mục tiêu cụ thể sau: ❖ Rễ TNHC rửa sạch, phơi khô, xay... nghiên cứu alkaloid TNHC phương pháp GC-MS Theo nghiên cứu này, số 16 alkaloid định danh (1 alkaloid khơng chắn), tìm thấy alkaloid : 6hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin et undulatin so với alkaloid. .. phân l? ??p trước Tuy nhiên, số chất l? ??i, alkaloid tìm l? ??n Nó l? ??n ghi nhận tồn alkaloid khác (ambelin, 1,2β-époxyambellin, powellin) ; tìm thấy phận khác TNHC Ghosal cộng phân l? ??p thành công glucoalkaloid