Tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng sinh enzyme protease ngoại bào

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE NGOẠI BÀO Trần Thị Thuý Hằng Đà Nẵng, năm 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE NGOẠI BÀO Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2019-2023 Sinh viên: Trần Thị Thuý Hằng Người hướng dẫn: TS Phạm Thị Mỹ Đà Nẵng, năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu hướng dẫn TS Phạm Thị Mỹ Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Đà Nẵng, tháng năm 2023 Tác giả khóa luận Trần Thị Thuý Hằng I LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học giúp đỡ, động viên suốt q trình thực đề tài khóa luận Để hồn thành khố luận tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi xin chân thành cảm ơn đến TS.Phạm Thị Mỹ, Th.S Lê Thị Mai anh Bùi Đức Thắng tận tình hướng dẫn, khích lệ, động viên định hướng cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn 19CNSH đồng hành tơi, ln hỗ trợ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! II MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG BIỂU VI DANH MỤC HÌNH ẢNH VII TÓM TẮT VIII MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản 1.2 Tổng quan vi khuẩn chịu mặn 12 1.3 Một số nghiên cứu vi khuẩn chịu mặn giới việt nam 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn từ nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản 24 3.2 Khả chịu mặn chủng vi khuẩn phân lập 25 3.4 Xác định khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn tuyển chọn 27 3.4 Kết định danh chủng B3 .28 III 3.5 Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease chủng Bacillus velezensis B3 .29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 Kết luận 34 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 IV DANH MỤC VIẾT TẮT VSV vi sinh vật BOD5 nhu cầu oxy sinh hóa ngày COD nhu cầu oxy hóa học TSS tổng chất rắn lơ lửng FOG chất béo, dầu mỡ OD giá trị độ quang V DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 1.2 1.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tiêu bảng Đặc điểm nước thải thô ngành cơng nghiệp chế biến thủy sản đóng hộp bảo quản Những thông số ô nhiễm tiêu biểu nước thải chế biến thủy sản Phân loại vi sinh vật nhóm Halophilic Trang 10 12 Đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy chế biến thủy hải sản Hoạt độ protease chủng Bacillus spp phân lập 24 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Ảnh hưởng nồng độ pH đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Ảnh hưởng việc bổ sung số nguồn Nitơ hoạt độ protease dịch môi trường nuôi cấy chủng Bacillus velezensis B3 29 VI 27 31 32 5DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Tên hình Quy trình xử lý nước thải nhà máy xử lý nước thải Trang 11 2.1 Đường chuẩn tyrosine 21 3.1 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản Sự phát triển chủng vi khuẩn B1, B2,B3, B4 mơi trường có nồng độ muối NaCl khác Đường kính vịng phân giải casein chủng vi khuẩn B1, B2,B3, B4 Kết sản phẩm điện di PCR khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn Kết tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn B3 25 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Ảnh hưởng nồng độ pH đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Ảnh hưởng việc bổ sung số nguồn Nitơ đến hoạt độ protease dịch môi trường nuôi cấy chủng Bacillus velezensis B3 30 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 VII 26 28 28 29 31 33 TĨM TẮT Ngành cơng nghiệp chế biến thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn nước ta Tuy nhiên, ngành chế biến thủy sản phát triển dẫn tới tình trạng ô nhiễm nguồn nước Đặc trưng nước khu chế biến thủy sản thường có lượng nhiễm COD cao khai thác hoạt động chế biến hải sản Các phương pháp xử lý sinh học đối mặt với thách thức độ mặn cao từ đến 30 g/L nước nồng độ muối cao ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn làm cho công nghệ sinh học xử lý nước thải truyền thống không hiệu Nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu mặn phân lập từ mẫu nước thải công ty CP Thủy sản Đà Nẵng - Seafish Corp (19 Vân Đồn, Nại Hiên Đông, Sơn Trà, Đà Nẵng) Kết thu chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (B1, B2, B3, B4) Cả chủng sinh trưởng tốt nồng độ muối 1%, 2%, 4%, sinh trưởng nồng độ muối 6% đến 8% Chủng B3 có khả sinh enzyme protease cao với đường kính 18,3 ± 0,577 mm Kết định danh B3 việc giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng Bacillus velezensis Đã xác định thời gian nuôi cấy 30 giờ, môi trường pH bổ sung nguồn nitơ casein cho hoạt độ enzyme protease cao Từ khoá: Bacillus velezensis, chịu mặn, chế biến thủy sản, hoạt độ VIII Hình 3.5 Kết tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn B3 Trình tự gen 16S rRNA chủng B3 giải trình tự so sánh (phân tích BlAST) với trình tự có sẵn sở liệu GenBank Chủng B3 có trình tự vùng gen 16S rRNA tương đồng 99.05%% với loài Bacillus velezensis YA215, kết luận rằng, chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản loài Bacillus velezensis 3.5 Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease chủng Bacillus velezensis B3 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp protease chủng Bacillus velezensis B3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy khả sinh tổng hợp protease chủng Bacillus velezensis B3 thể Bảng 3.3 Hình 3.5 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Thời gian (giờ) Hoạt độ enzyme (U/mL) 10 15 20 25 232,79 70,09 2217,9 242,16 ±16,29a abc ± 3,91e ±15,04cd ±2,19 bcd 30 35 256 ± 5,42a 250,6 ± 1,87ab 40 224,93 211,46 ±10,15bcd ± 7,63d Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có mức ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 29 45 250 2.5 200 150 1.5 100 Abs 600nm Hoạt tính(U/mL) 300 0.5 50 0 10 20 30 Thời gian (giờ) 40 50 Hoạt tính(U/mL) 60 Abs 600nm Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Giai đoạn thích nghi chủng Bacillus velezensis B3 – Lúc này, enzyme protease sản xuất, từ 10 đến 20 vi khuẩn pha log phát triển sinh khối tế bào nhanh Giai đoạn từ 20 đến 35 thuộc pha cân pha suy vong Khả sản xuất protease chủng Bacillus velezensis B3 tương đồng với mật độ tế bào Ở giai đoạn thích nghi, hoạt độ protease thu thấp, mật độ tế bào tăng dần, hoạt độ protease tăng theo đến pha cân 20 đạt (242,16 U/mL) đạt cực đại 30 (256,77 U/mL) sau giảm dần Kết sai khác với kết nghiên cứu trước: chủng B stearothermophilus B mojavensis nghiên cứu Laili cs 2017 có hoạt tính mạnh sau 24 nuôi cấy sản xuất enzyme, nghiên cứu Lakshmi cs đối tượng Bacillus licheniformis cho thấy thời gian tối ưu để thu nhận protease sau 72 Với vi khuẩn Bacillus subtilis, hoạt độ protease cao xác định sau 36 (G Pant cs, 2015) sau 48 (A Jadhav cs, 2014) Nguyên nhân dẫn đến khác biệt thời gian sản xuất enzyme chủng Bacillus khác khác biệt nguồn mẫu phân lập, đối tượng vi khuẩn mà mối tương quan yếu tố ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp q trình ni cấy thành phần môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian chất cảm ứng… Sau 30 hoạt độ protease chủng Bacillus velezensis B3 giảm Sự giảm hoạt độ enzyme mơi trường ni cấy giải thích nhiều lý khác thời gian ni cấy kéo dài hàm lượng chất dinh dưỡng chất cảm ứng 30 giảm xuống; thành phần mơi trường thay đổi q trình trao đổi chất vi khuẩn; vi sinh vật tổng hợp nên chất gây kìm hãm trình sinh tổng hợp enzym, vi khuẩn cuối pha sinh tổng hợp tế bào bắt đầu tự phân huỷ tốc độ tích luỹ enzyme bị chậm lại (Đỗ Thị Bích Thuỷ, 2012; Trần Thị Hồng Nhi cs, 2012; Lakshmi cs,2014) 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ pH đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Mỗi enzyme hoạt động mạnh khoảng pH thích hợp; đó, phản ứng xảy nhanh Kết khảo sát mức độ ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease sản xuất từ Bacillus velezensis B3 trình bày Bảng 3.4 Hình 3.7 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ pH đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 pH 5.5 6.5 7.5 Hoạt độ 206,27 220,06 219,84 264,39 264,39 231,49 190,69 enzyme ±10,65cd ±7,58bc ±12,56 bc ±5,64 ab ±11,56a ±2,39b ±6,99d (U/mL) Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có mức ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Hoạt độ enzym (U/mL) 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 5.5 6.5 7.5 Giá trị pH Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ pH đến khả sinh enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 31 Kết cho thấy, chủng Bacillus velezensis B3 sinh trưởng phát triển mơi trường acid bazơ Hoạt tính protease thay đổi theo giá trị pH khảo sát, pH môi trường tăng từ đến 6,5, hoạt tính protease có xu hướng tăng dần với hoạt tính tương đối tăng 206,27 U/mL đến 241,25 U/mL hoạt tính cao đạt mơi trường pH 264,39 U/mL (Hình 3.7) Ở khoảng pH cao pH tối ưu, hoạt tính enzyme protease giảm đáng kể Hoạt tính cịn 190.69 U/mL pH Kết tương đồng với khảo sát Võ Hồng Thi cs 2012, 10 chủng Bacillus cho hoạt tính enzyme tốt pH Ở giá trị này, hoạt độ protease mạnh M5 (0,87 U/mL) yếu chủng M1 (0,68 U/mL) Nihan Sevinc cs 2011 thống với kết trên, chủng Bacillus sp N-40 cho hoạt độ cao pH 7,0 Trong khi, chủng Bacillus subtilis Bs04 có hoạt độ enzyme cao ghi nhận pH 7,5 đạt 0,434 U/mL Protease từ chủng B flexus APCMST Bacillus sp APCMST-RS7 thể hoạt tính mạnh pH 50°C.Sản lượng protease thay đổi đáng kể theo độ pH thành phần khác môi trường ảnh hưởng kết hợp q trình trao đổi chất loài vi khuẩn (Maghsoodi et al., 2013) 3.5.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh protease ngoại bào B velezensis B3 Trong nguồn nitơ khảo sát, khả kích thích trình sinh protease chủng B velezensis B3 nguồn nitơ hữu tốt nguồn vơ Trong đó, casein làm cho hoạt độ protease tăng cao đạt (437,1 U/mL), cao so với mẫu đối chứng 181,09 U/ml (Bảng 3.5 Hình 3.9) Bảng 3.5 Ảnh hưởng việc bổ sung số nguồn Nitơ hoạt độ protease dịch môi trường nuôi cấy chủng Bacillus velezensis B3 Nguồn Casein Tryptone LB KNO3 NH4NO3 NH4Cl Hoạt độ 437,1 392,4 256,01 215,07 135,3 86,23 enzyme ±25,1a ±26,9e ±11,32b ±5,3a ±16,42d ±10,73c Nitơ (U/mL) Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có mức ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 32 500 450 Hoạt độ enzym (U/mL) 400 350 300 250 200 150 100 50 Casein Tryptone LB KNO3 NH4NO3 NH4Cl Nguồn Nitơ Hình 3.8 Ảnh hưởng việc bổ sung số nguồn Nitơ đến hoạt độ protease dịch môi trường nuôi cấy chủng Bacillus velezensis B3 Nhiều nhà nghiên cứu báo cáo nguồn nitơ hữu phù hợp với Bacillus spp cho tăng trưởng sản xuất enzyme protease so với nguồn vô Đã có báo cáo peptone, casein, sữa gầy, chiết xuất nấm men, tạo thuận lợi cho việc sản xuất protease tối đa Bacillus spp (Puri et al , 2002; Sangeetha et al , 2008) Trong số nguồn N hữu cơ, tác dụng bột đậu nành, peptone cá, peptone thịt bò polypeptone gần giống B pumilus c172-14 (Feng et al 2001) Kết nghiên cứu Mussarat (2008) chủng Bacillus subtilis BS1 kết luận casein làm tăng hoạt độ protease mạnh Đỗ Thị Bích Thủy cho tất nguồn nitơ, có casein làm cho hoạt độ protease dịch môi trườ (Feng et al , 2001).Nuôi cấy B amyloliquefaciens N1 (0,758 HP/mL) cao mẫu đối chứng (0,511 HP/mL) Khi bổ sung Tryptone vào môi trường LB thay cho 0,5% cao nấm men góp phần làm tăng hoạt độ protease (392,4 U/mL), hoạt độ protease không cao công thức bổ sung casein cao so với mẫu đối chứng 136,39 U/mL.Các muối KNO3, NH4Cl, NH4NO3 khả tăng hoạt độ protease, mà làm giảm hoạt độ protease, hàm lượng 40,94 U/mL, 120,72 U/mL, 169,78 U/mL so với đối chứng (môi trường LB) Như vây, casein nguồn Nitơ tốt để chủng vi khuẩn Bacillus velezensis B3 sinh tổng hợp enzyme protease 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu rút số kết luận sau: - Từ mẫu nước thải nước thải lấy từ Công ty CP Thủy sản Đà Nẵng - Seafish Corp phân lập chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, kí hiệu B1-B4 - Đã khảo sát khả chịu mặn chủng vi khuẩn phân lập Cả chủng sinh trưởng tốt nồng độ muối 1%,2%,4%, sinh trưởng nồng độ muối 6% đến 8% - Đã tuyển chọn khả sinh enzyme protease ngoại bào B1, B2, B3, B4 Trong đó, chọn chủng B3 có khả sinh protease ngoại bào cao với đường kính vịng phân giẩi 18,3 ± 0,577 mm - Kết định danh chủng vi khuẩn B3 việc giải trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng B3 thuộc loài Bacillus velezensis - Đã xác định thời gian nuôi cấy 30 giờ, môi trường pH bổ sung nguồn nitơ Casein cho hoạt độ enzyme protease cao với hoạt đột enzyme 256.77 U/mL, 264,39 U/mL, 437,1 U/mL Kiến nghị Qua kết nghiên cứu, đưa số định hướng nghiên cứu tương lai: - Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả sinh enzyme protease Bacillus velezensis B3 - Khảo sát khả xử lý nước thải nhà máy chế biến thủy sản Bacillus velezensis B3 quy mơ phịng thí nghiệm 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Jadhav, K Ismail, M Harale, S Gadre, M Williamson (2014) Study of protease B Asha M Palaniswamy (2018) Optimization of alkaline protease production by Bacillus cereus FT1 isolated from soil, Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol 8(02), 119127 Aharon Oren, 2010) “Industrial and environmental applications of halophilic microorganisms” Environmental Technology 31(8-9), 825-834 Balslev, O.P.; Lynggaard, J.A.; Nickelsen, C Pilot-scale experiments on anaerobic treatment of wastewater from a fish processing plant Water Sci Technol 1990, 22, 463– 474 Buchanan, J.R Gibbons, N.E (1974) Bergey’s manual of determinative bacteriology The Williams and Wilkins Company Bùi Văn Lệ, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Vũ Hồng Liên (1999) Giáo trình Thực tập sinh hố ngành cơng nghệ sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM, 67tr Burnett, W.E The effect of salinity variations on the activated sludge process Water Sew Works 1974, 121, 37–55 Carawan R.E.; Chambers J.V and Zall J.V , (1979) Seafood Water and Wastewater Management, North Carolina Agricultural Extension Services, Raleigh Công ty cổ phần kỹ thuật SEEN COWI Industrial Sector Guide Cleaner Production Assessment in Fish Processing Industry; UNEP DTIE: Paris, France; Danish Environmental Protection Agency: Copenhagen, Denmark, 1999 Cui, Y.W.; Zhang, H.Y.; Ding, J.R.; Peng, Y.Z The effects of salinity on nitrification using halophilic nitrifiers in a Sequencing Batch Reactor treating hypersaline wastewater Sci Rep 2016, 6, 24–25 [CrossRef] [PubMed] 35 Cupp-Enyard C Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate J Vis Exp 2008 Sep 17;(19):899 doi: 10.3791/899 Dan, N.P.; Visvanathan, C.; Basu, B Comparative evaluation of yeast and bacterial treatment of high salinity wastewater based on biokinetic coefficients Bioresour Technol 2003, 87, 51–56 [CrossRef] Department of Statistics Malaysia Selected Agricultural Indicators, Malaysia, 2016: Production of Agriculture Sector Increased in 2015 Đỗ Thị Bích Thuỷ (2012) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận chế phẩm protease ngoại bào Bacillus amyloloquefacien N1, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, tập 71, số 2, 279-290 Eckenfelder, W.W Principles of Water Quality Management; CBI Publishing Co.: Boston, 1980 Environment Canada Canadian Biodiversity Strategy: Canadian response to the Convention on Biological Diversity, Report of the Federal Provincial Territorial Biodiversity Working Group; Environmant Canada: Ottawa, 1994 Feng, Y., Yang, W., Ong, S., Hu, J., Ng, W., 2001 Fermentation of starch for enhanced alkaline protease production by constructing an alkalophilic Bacillus pumilus strain Appl Microbiol Biotechnol 57, 153–160 G Pant, A Prakash, J.V.P Pavani, S Bera, G.V.N.S Deviram, A Kumar, M Panchpuri & R Prasuna (2015) Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis, Journal of Taibah University for Science, Vol 9(1), 50-55 Ganesh, R., G Balaji, and R A Ramanujam, 2006 “Biodegradation of tannery wastewater using sequencing batch reactor - respirometric assessment” Bioresource Technology 97(15), 1815-1821 Gonzalez, J.F Wastewater Treatment in the Fishery Industry, FAO fisheries Technical Paper, 1996; 355 36 Gonzalez, J.F.; Civit, E.M.; Lupin, H.M Composition of fish filleting wastewater Environ Technol Lett 1983, 7, 269–272 Gururaj Tennalli, Basavaraj udapudi, Praveenkumar Naik Isolation of Proteolytic Bacteria and Characterization of their Proteolytic Activity Department of Biotechnology, B.V.Bhoomaraddi College of Engineering and Technology Vidyanagar Hubli-580031, Karnataka, India 2012 Hall, G.M.; Ahmad, N.H Surimi and Fish Mince Products In Fish Processing Technology; Hall, G.M., Ed.; Chapman & Hall: New York, NY, USA, 1992; pp 72–86 Hamoda, M.F.; Al-Attar, M.S Effects of high sodium chloride concentrations on activated sludge treatment Water Sci Technol 1995, 31, 61–72 Joong, K.K.; Jeong, B.K.; Kyoung, S.C.; Yong, K.H Isolation and identification of microorganisms and their aerobic biodegradation of fish-meal wastewater for liquidfertilization Int Biodeterior Biodegrad 2007, 59, 156–165 Kapdan, I K., & Erten, B (2007) “Anaerobic treatment of saline wastewater by Halanaerobium lacusrosei” Process Biochemistry, 42(3), 449–453 Kargi, F.; Dincer, A.R Salt inhibition of nitrification and denitrification in saline wastewater Environ Technol 1999, 20, 1147–1153 Kargi, F.; Uygur, A Biological treatment of saline wastewater in an aerated percolator unit utilizing halophilic bacteria Environ Technol 1996, 17, 320–325 Kubo,’, M., Hiroe,’ Makoto Murakam I, J., Fukami,’ And, H., & Tachiki’, T (2001) “Treatment of Hypersaline-Containing Wastewater with Salt-Tolerant Microorganisms” In Journal of bioscxencb anti bioengimezwg (Vol 91, Issue 2) Lakshmi, P.V Ratna Sri, K Ambika Devi, KP.J Hemalatha (2014) Media optimization of protease production by Bacillus licheniformis and partial characterization of alkaline protease, International Journal of current microbiology and applied sciences, Vol (5), 650-659 37 Lê Hùng Anh , Nguyễn Khánh Hoàng, Nguyễn Hoàng Mỹ, (2020) “Nghiên cứu khả xử lý phosphatecủa vi khuẩn Bacillus subtilus phân lập từ nguồn nước thải chế biến thủy sản" Tạp chí khoa học Công nghệ Thực phẩm 20 (1) (2020) 87-95 Lê Thị Ngọc Hân, Võ Thị Ngọc Điệp, Trịnh Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Văn Thành, 2021 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh tổng hợp protease từ sản phẩm đậu nành lên men Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Trường Cao đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Cần Thơ Maghsoodi V, Kazemi A, Nahid P, Yaghmaei S, Sabzevari MA Alkaline protease production by immobilized cells using B licheniformis Sci Iran C 2013;20:607–10 Méndez, R., Omil, F., Soto, M., Lema, J.M., 1992 “Pilot plant studies 646 on the anaerobic treatment of different wastewater from a 647 fish-canning factory” Water Sci Technol 25 (1), 37–44 Mendez, R.; Omil, F.; Soto, M.; Lema, J.M Pilot plant studies on the anaerobic treatment of different wastewaters from a fish-canning factory Water Sci Technol 1992, 5, 37–44 Metcalf and Eddy, Inc Wastewater Engineering: Treatment, Disposal, Reuse McGraw-Hill Book Co.: New York, 1979 Moletta, R; Lefebvre, O Treatment of organic pollution in industrial saline wastewater: A literature review Water Res 2006, 40, 3671–3682 [CrossRef] Mosquera-Corral A., 2001.“Simultaneous methanogenesis and denitrification of pretreated effluents from a fish canning industry” Water Research 35(2), 411-418] Mostafa, F.H.; Surabhi, S.; Loring, F.N.; James, E.A Study of Salt Wash Water Toxicity on Wastewater Treatment; Final Report; Purdue University: West Lafayette, IN, USA, 2006 N Laili, S Antonius, (2017) Production and Characterization of Extracellular Protease from Bacillus sp 140-B Isolated from Pineapple Plantation in Lampung, Indonesia, ICBS Conference Proceedings, International Conference on Biological Science, Vol 2(2), 170-176 38 Ngô Duy Thái (2019), “Xử lý nước thải nhiễm mặn phương pháp sinh học hiếu khí với vi sinh vật chịu mặn” Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Văn Giang (2017) “Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus sinh enzym protease xác định đặt tính chịu nhiệt enzyme” Tạp chí khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 15(8): 1062-1069 Nguyen Khanh Hoang, Le Hung Anh, Nguyen Hoang My, Vo Thi Kim Khuyen Isolation and Characterization of Salt-Tolerant Bacteria for Aquaculture Wastewater Treatment International Journal of Emerging Trends in Engineering Research, 8(10), October 2020 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Thi ̣ Quỳnh Trang (2011) “Tuyển chọn chủng vi sinh vậ t tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản” [Luận văn thạc sĩ ] Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Kim Cơ, Trần Quốc Dung (2019) Phân lập sàng lọc số chủng Bacillus sp Sinh protease từ nước thải Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế, Số 3(55)/2020: tr.100-108 Nihan Sevinc and Elif Demirkan Production of Protease by Bacillus sp N-40 Isolated from Soil and Its Enzymatic Properties J BIOL ENVIRON SCI., 2011, 5(14), 95-103 Oren, A.; Gurevich, P.; Malkit, A.; Henis, Y Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations Biodegradation 1992, 3, 387–398 [CrossRef] Puri S, Beg QK, and Gupta R (2002) Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp using response surface methodology Curr Microbiol., 44:286-290 Rui Cheng, Xinyi Wang, Hui Zhu, Baixing Yan, Brian Shutes, Yingying Xu, Baorong Fu & Huiyang We Scientific Reports volume 10, Article number: 10002 (2020) 39 S Judd, 2010 “The MBR Book: Principles and Applications of Membrane Bioreactors for Water and Wastewater Treatment” Elsevier Saghai-Maroof, M A., Soliman, K M., Jorgensen, R A., & Allard, R W (1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(24), 8014–8018 Sangeetha R, Geetha A, and Arulpandi I (2008) Optimization of protease and lipase production by Bacillus pumilus SG isolated from an industrial effluent The Internet J Microbiol Vol 5, No Senthilkumar Sivaprakasam, Surianarayanan Mahadevan, Sudharshan Sekar & Susheela Rajakumar, Microbial Cell Factories Biological treatment of tannery wastewater by using salt-tolerant bacterial strains volume 7, Article number: 15 (2008) Sherly, T.M.V.; Harindranathan, N.; Bright, S.I.S Physicochemical analysis of seafood processing effluents in Aroor Gramapanchayath, Kerala IOSR J Environ Sci Toxicol Food Technol 2015, 9, 38–44 Sivaprakasam, S., Mahadevan, S., Sekar, S., & Rajakumar, S (2008) “Biological treatment of tannery wastewater by using salt-tolerant bacterial strains” Microbial Cell Factories, Stewart, M.J.; Ludwig, H.F.; Kearns, W.H Effects of varying salinity on extended aeration process J Water Pollut Control Fed 1962, 37, 1167–1177 Tanimura, K.; Matsumoto, T.; Nakayama, H.; Tanaka, T.; Kondo, A Improvement of ectoine productivity by using sugar transporter-overexpressing Halomonas elongate Enzyme Microb Technol 2016, 89, 63–68 Teather, R.M., Wood, P.J (1982) “Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen” Applied, Environment Microbiology 43, 777–780 Trần Hữu Hậu, Nguyễn Anh Việt, Hoàng Ngọc Khánh, Trương Thị Bích Vân Nguyễn Phạm Anh Thi1 Tuyển chọn vi khuẩn có khả phân giải protein ức chế vi 40 khuẩn vibrio spp Từ nước mắm truyền thống Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2022 Trần Minh Chí, Ngơ Văn Thanh Huy, & Thị Lương Kim Giang (n.d.) “Xử lý nước thải hữu nhiễm mặn nấm men thí nghiệm mẻ.” 2016 Trần Thị Hồng Nhi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình, Trương Phước Thiên Hồng (2012) Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis để thuỷ phân phụ phẩm cá tra, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, số 2, 56-61 Trần Văn Dũng, Cao Thị Mỹ Tiên, Võ Dương Lan Anh, Nguyễn Thiện Mỹ, Bùi Thị Minh Diệu, Thái Chí Phong, Nguyễn Phạm Anh Thi, Nguyễn Hoàng Hậu Đỗ Thị Xuân, 2021.Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phân hủy protein cellulose từ nguồn rác thải hữu thu Thành Phố Cần Thơ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số Chuyên đề Mơi trường Biến đổi khí hậu (2021)(1): 34-41 TS Đào Trọng Hiếu (2022) “Khơi mở tiềm chế biến thuỷ sản” Thuỷ sản Việt Nam Võ Phú Đức, 2013 “Xây dựng quy trình sản xuất phân hữu vi sinh từ nguồn bùn thải phát sinh trình chế biến cá tra” Đề tài Khoa học công nghệ tỉnh Đồng Tháp Woolard, C.R.; Irvine, R.L Response of a periodically operated halophilic biofilm reactor to changes in salt content Water Sci Technol 1995 Youssef, N.H.; Savage-Ashlock, K.N.; McCully, A.L.; Luedtke, B.; Shaw, E.I.; Hoff, W.D.; Elshahed, M.S Trehalose/2-sulfotrehalose biosynthesis and glycine-betaine uptake are widely spread mechanisms for osmoadaptation in the Halobacteriales ISME J 2014, 8, 636–649 Zhou, G., Wang, X., Zhao, H., Zhang, W., Liu, G., & Zhang, X (2020) “Isolation of two salt-tolerant strains from activated sludge and its COD degradation characteristics from saline organic wastewater” Scientific Reports, 10(1), 18421 41 PHỤ LỤC Phụ lục Mẫu nước lấy từ Công ty CP Thủy sản Đà Nẵng - Seafish Corp Địa chỉ: 19 Vân Đồn, Nại Hiên Đơng, Sơn Trà, Đà Nẵng Hình mẫu nước thải lấy từ từ Công ty CP Thủy sản Đà Nẵng - Seafish Corp Hình Độ mặn nước thải lấy từ từ Công ty CP Thủy sản Đà Nẵng đo máy đo độ mặn khúc xạ Phụ lục 2: Các phản ứng sinh hoá Oxidase, Catalasa, Idol, VP, Di động, Glucose, Mannitol a Phụ lục Các chủng vi khuẩn B1, B2, B3,B4 nuôi nồng độ nuối khác (1%, 2%, 4%, 6%, 8%) Hình 4: Khả chịu mặn Các chủng vi khuẩn B1, B2, B3,B4 nuôi nồng độ nuối khác (1%, 2%, 4%, 6%, 8%) Phụ lục Định lượng enzyme protease chủng Bacillus velezensis B3 Hình 5: Một số yếu tổ ảnh hưởng đến khả sinh enzym chủng Bacillus velezensis B3 b