Khóa luận tốt nghiệp tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus có khả năng sinh enzyme β galactosidase phân giải lactose

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  LÊ THỊ KHUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE PHÂN GIẢI LACTOSE Hà Nội – 09/2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE PHÂN GIẢI LACTOSE Người thực : LÊ THỊ KHUYÊN Mã sinh viên : 620767 Lớp : K62CNTPA Ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn : TS V QU NH H Địa điểm thực tập NG : KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội – 09/2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu cá nhân dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Vũ Quỳnh Hƣơng Các nội dung nghiên cứu đề tài trung thực chƣa cơng bố dƣới hình thức trƣớc Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc cá nhân thu thập từ nguồn khác có ghi rõ nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Lê Thị Khuyên i LỜI CẢM N Quá trình thực khóa luận tốt nghiệp giai đoạn quan trọng quãng đời sinh viên Với tôi, đƣợc học tập môi trƣờng Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhận đƣợc dạy dỗ, giúp đỡ tận tình thầy khoa Cơng nghệ thực phẩm điều mà trân trọng Đặc biệt, phải gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên hƣớng dẫn tôi, TS Vũ Quỳnh Hƣơng, ngƣời sát cánh bên tơi suốt q trình thực môn học đặc biệt Cảm ơn cô định hƣớng nghiên cứu, giải đáp thắc mắc tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ thực phẩm trang bị kiến thức, kĩ cần thiết, tạo điều kiện để nghiên cứu học hỏi Đồng thời xin cảm ơn chị Phạm Thị Dịu bạn sinh viên nhóm thực khóa luận tốt nghiệp giúp đỡ nhiều trình hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến Dự án VIBE, Khoa Công nghệ thực phẩm tài trợ kinh phí để tơi thực đề tài nghiên cứu Kết nghiên cứu phần dự án VIBE Cuối cùng, cảm xin cảm ơn gia đình bạn bè bên cạnh ủng hộ tinh thần, động viên thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp Tuy nhiên, nghiên cứu khoa học thực nên không tránh khỏi sai sót, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy cô bạn để báo cáo đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Lê Thị Khuyên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 T ng quan sữa tƣơi 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Tình hình phát triển ngành công nghiệp sữa Việt Nam 2.1.3 Tiềm phát triển ngành sữa sản phẩm sữa không lactose 2.2 Vi khuẩn Bacillus 2.2.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Bacillus 2.2.2 Ứng dụng Bacillus thực phẩm 10 2.3 Enzyme β-galactosidase 11 2.3.1 Đặc điểm chung enzyme β-galactosidase 11 2.3.2 Vai tr β-galactosidase 12 2.3.3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase có liên quan đề tài 12 PHẦN ĐỐI T ỢNG – NỘI DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 iii 3.2 Phạm vi nghiên cứu 15 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 3.4.1 Xác định mơi trƣờng ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus 18 3.4.2 Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả sinh β-galactosidase 18 3.4.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase 21 3.4.4 Phƣơng pháp tinh sơ β-galactosidase muối amonisunfate 24 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Xác định môi trƣờng phân lập nuôi cấy vi khuẩn Bacillus 25 4.2 Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả sinh β-galactosidase 26 4.2.1 Kết tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ chủng phân lập từ sữa tƣơi 26 4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ chủng sƣu tập có sẵn 27 4.3 Xác định hoạt độ β-galactosidase vi khuẩn 30 4.4 Tinh sơ β-galactosidase 31 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 38 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Abs 420nm : Độ hấp thụ quang bƣớc sóng 420nm Abs 595nm : Độ hấp thụ quang bƣớc sóng 595nm cs : Cộng FDA : Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ GRAS : Generally Recognized As Safe IPTG : Isopropyl β–D–1-thiogalactopyranoside LB : Lysogeny Broth NA : Nutrient Agar (môi trƣờng thạch dinh dƣỡng) NB : Nutrient Broth (môi trƣờng canh thang) oNPG : Ortho– nitrophenyl-β-D-galactopyranoside oNP : Ortho – nitrophenol X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosit v/v : Thể tích/thể tích w/v : Khối lƣợng/thể tích v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng 100g sữa b tƣơi .3 Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn đƣợc chọn để nghiên cứu .15 Bảng 3.2 Thiết bị dùng nghiên cứu .16 Bảng 3.3 Danh sách hóa chất .17 Bảng 4.1 Thời gian nuôi chủng Bacillus môi trƣờng lỏng 25 Bảng 4.2 Kết định tính chủng Bacillus sau phân lập với X-gal 27 Bảng 4.3 Kết định tính chủng Bacillus sƣu tập với X-gal 29 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ cấu doanh thu thị trƣờng sữa Việt Nam4 (Nguồn: Euromonitor, trích từ Vneconomy.vn) Hình 2.2 Sự thay đ i thói quen tiêu dùng sữa ngƣời Việt Nam tác động Covid-19 quý đầu năm 2020 (%) (Nguồn: Invest Vietnam, 2020) .5 Hình 2.3 Tiêu thụ sữa bình quân đầu ngƣời năm 2020 (lít/ngƣời/năm) Hình 2.4 Dự báo tăng trƣởng sản lƣợng tiêu thụ sản phẩm sữa giai đoạn 20202024 (Nguồn: Invest Vietnam, 2020) .7 Hình 2.5 Một số sản phẩm sữa bột sữa nƣớc không lactose thị trƣờng .8 Hình 3.1 Biểu đồ đƣờng chuẩn oNP 22 Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc Bacillus ni cấy mơi trƣờng thạch 26 Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc Bacillus phân lập từ sữa mẹ sữa b 27 Hình 4.3 Màu khuẩn lạc Bacillus thủy phân X-gal 28 Hình 4.4 Hoạt độ enzyme β-galactosidase (U/l) vi khuẩn Bacillus .30 vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sữa chế phẩm từ sữa nguồn dinh dƣỡng thiết yếu chế độ ăn hàng ngày ngƣời tồn giới Khơng thực phẩm cung cấp lƣợng canxi, vitamin nhiều khoáng chất quan trọng cho thể lứa tu i mà nhiều nghiên cứu sản phẩm từ sữa c n giúp ngăn ngừa bệnh lỗng xƣơng, giảm nguy mắc ung thƣ, làm hạ huyết áp, chống nhiễm khuẩn (Nguyễn Ý Đức, 2018) Tuy nhiên, giới có đến 68% dân số mắc chứng hấp thu lactose (Storhaug & cs., 2017) Họ gặp phải vấn đề nhƣ tiêu chảy, đau bụng, đầy sử dụng sữa sản phẩm từ sữa thiếu hụt enzyme phân giải lactose thể Lactose thành phần đƣờng có sản phẩm từ sữa enzyme phân giải lactose lactase (c n gọi β-galactosidase) Lƣợng lactase thể giảm dần theo thời gian tu i tác (Shinya, 2019) Vì sử dụng thực phẩm làm từ sữa đƣờng lactose khơng đƣợc chuyển hóa hấp thu ruột non mà đƣợc chuyển xuống ruột già Tại vi khuẩn phân hủy lactose thành chất lỏng khí khiến ngƣời bệnh xuất triệu chứng hệ tiêu hóa nhƣ (Nguyễn Thị Lâm, 2021) Để sản xuất sản phẩm sữa dành cho ngƣời hấp thu lactose cần tìm nguồn sinh vật có khả sinh β-galactosidase nhằm ứng dụng vào q trình chế biến sữa Nhờ đó, sản phẩm sữa khơng chứa lactose thu hút lƣợng lớn ngƣời tiêu dùng dung nạp lactose, đồng thời nhà sản xuất mở rộng tồn thị trƣờng tiêu thụ sữa Enzyme β-galactosidase đƣợc tìm thấy nhiều loại thực vật, động vật có vú, nấm men, vi khuẩn nấm mốc Enzyme nói chung đƣợc thu nhận từ nguồn thực vật, động vật c n nhiều hạn chế phải phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, hiệu kinh tế không cao; đa số nguồn enzyme chƣa phải mục đích ƣu tiên ni trồng động thực vật nên việc thu nhận enzyme từ nguồn đƣợc thay dần enzyme vi sinh vật (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) Nguồn enzyme từ vi sinh vật chiếm 90% thị trƣờng enzyme Một vài ƣu điểm điển hình vi sinh vật nhƣ có hệ thống trao đ i chất mạnh mẽ, linh hoạt dễ dàng nhân lên cấp độ lớn, dễ treaction : Thời gian phản ứng enzyme chất (phút) 1U : Lƣợng enzyme có khả xúc tác làm chuyển hóa μmol chất phút điều kiện phân tích xác định Số liệu đƣợc xử lý dựa vào đƣờng chuẩn phần mềm Microsoft Excel 4 Phư ng pháp tinh s β-galactosidase muối amonisunfate Nguyên tắc: Muối amonisunfate (NH4)2SO4 có khả kết tủa protein enzyme β-galactosidase nên đƣợc sử dụng nhằm tách tạp chất từ dịch enzyme thô Phƣơng pháp tinh đƣợc tiến hành theo Patil & cs., 2011 Tiến hành: - Hút 15ml dung dịch enzyme (bảo quản 4oC) vào ống nghiệm, b sung thêm 5,92g muối (NH4)2SO4 dạng tinh thể, khuấy cho tan hết - Để dung dịch kết tủa 4oC qua đêm - Ly tâm lạnh hỗn hợp (4oC) 10000 v ng/phút 20 phút - Đ bỏ phần dịch lỏng phía - H a tan kết tủa dung dịch đệm phosphate pH=6.5 (50mM) 24 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn Bacillus Môi trƣờng nuôi cấy phù hợp tạo điều kiện phát triển tốt cho vi khuẩn, nhờ khả sinh enzyme đạt hoạt tính cao so với môi trƣờng khác Môi trƣờng đƣợc lựa chọn để hoạt hóa ni cấy Bacillus NB (peptone 10g/l, cao thịt 5g/l, NaCl 5g/l), NA (NB b sung thêm 2% agar) LB (tryptone 10g/l, cao nấm men 5g/l, NaCl 5g/l), LB – agar (LB b sung thêm 2% agar) Thành phần môi trƣờng đơn giản, dễ kiếm, nữa, nhiều thí nghiệm cho thấy nhiều chủng Bacillus thích hợp với hai kiểu môi trƣờng nên cần xác định môi trƣờng thích hợp cho chủng Bacillus có sẵn (Nguyễn Hồng Anh & Trần Thị Na, 2017; Nguyễn Văn Phúc & Phan Thị Phƣợng Trang, 2014) Q trình ni cấy vi khuẩn môi trƣờng bao gồm nuôi Bacillus môi trƣờng canh thang cấy chuyển vi khuẩn sang môi trƣờng rắn nhƣ mô tả mục 3.4.1 Kết thể bảng 4.1 cho thấy vi khuẩn Bacillus tuyển chọn thích hợp với mơi trƣờng NB môi trƣờng LB, tỷ lệ ống đục tƣơng ứng 100% 10%, thời gian vi khuẩn sinh trƣởng phát triển môi trƣờng NB 2/3 môi trƣờng LB Tuy nhiên, sau cấy vi khuẩn từ môi trƣờng lỏng sang môi trƣờng thạch tƣơng ứng xuất mật độ vi khuẩn lên dày tất đĩa thạch nồng độ pha lỗng 10-6 (Hình 4.1) Điều chứng tỏ mơi trƣờng thạch NA LB – agar thích hợp cho phát triển Bacillus Bảng Thời gian nuôi chủng Bacillus môi trường lỏng Môi trường Thời gian Tỉ lệ ống đục NB 16h 100% LB 24h 10% 25 Môi trƣờng NA Môi trƣờng LB – agar Hình Hình ảnh khuẩn lạc Bacillus ni cấy môi trường thạch Sau xem xét kết mục đích thuận tiện cho q trình nghiên cứu, mơi trƣờng thích hợp dành cho Bacillus mơi trƣờng hoạt hóa NB mơi trƣờng thạch NA giúp tăng số lƣợng vi khuẩn cách nhanh chóng Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả sinh β-galactosidase 4.2.1 Kết tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ chủng phân lập từ s a tư i Việc phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu sữa đƣợc bảo quản nhiệt độ thấp thời gian dài tạo nguồn vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme βgalactosidase hoạt độ cao, phân giải lƣợng lớn lactose sữa thời gian ngắn điều kiện lạnh Điều có ý nghĩa lớn việc ứng dụng vào quy trình sản xuất sữa khơng lactose Các mẫu sữa sau pha lỗng nồng độ thích hợp đƣợc đem định tính với X-gal nhƣ mô tả mục 3.4.2.1 Kết đƣợc thể bảng 4.2 hình 4.2 26 Bảng Kết định tính chủng Bacillus sau phân lập với X-gal Chủng vi Nguồn khuẩn phân lập Kết định Đặc điểm hình thái tính với X-gal Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 2-5mm, có SM01 Sữa mẹ cƣa không bao quanh, bề mặt khuẩn lạc Xanh lớp màng trắng đục, nhăn nheo Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 1-2mm, có SM02 Sữa mẹ cƣa khơng đều, khuẩn lạc có màu nâu Không màu hồng SB01 Sữa b Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 2-3 mm, màu trắng đục, bề mặt bóng SM01 SM02 Khơng màu SB01 Hình Hình thái khuẩn lạc Bacillus phân lập từ s a mẹ s a bò Nhƣ vậy, từ chủng phân lập đƣợc có chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus phân lập từ sữa mẹ có khả sinh enzyme β-galactosidase Chủng SM01 đƣợc đem xác định hoạt độ enzyme 4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ chủng sưu tập có sẵn Các chủng Bacillus bảo quản tủ -35 C đƣợc đem hoạt hóa định tính khả sinh enzyme β-galactosidase theo phƣơng pháp mô tả mục b phần 27 3.4.2.2 Các khuẩn lạc xuất màu xanh indigo chủng vi khuẩn có khả sinh β-galactosidase (hình 4.3) kết sàng lọc chủng vi khuẩn sinh βgalactosidase đƣợc trình bày bảng 4.3 Hình Màu khuẩn lạc Bacillus thủy phân X-gal 28 Bảng Kết định tính chủng Bacillus sưu tập với X-gal Chủng Nguồn Bacillus phân lập TO35.5 Tƣơng ớt TO40.19 Tƣơng ớt Đặc điểm hình thái Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 1-2mm, có viền cƣa, bề mặt bóng Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 3-4mm, có viền cƣa khơng đều, bề mặt bóng Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 3-6mm, viền cƣa, 60.4 Tƣơng ớt 36.5 Tƣơng ớt 51.2 Tƣơng ớt 59.5 Tƣơng ớt 32.13 Tƣơng ớt 40.38 Tƣơng ớt Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 0.5mm, bề mặt bóng 32.4 Tƣơng ớt 35.18 Tƣơng ớt màu trắng xám, tâm đậm màu, bề mặt khô Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 0.5-2mm, bề mặt bóng, màu xám trắng, có chấm đậm màu khuẩn lạc Khuẩn lạc tr n khơng đều, đƣờng kính 4-6mm, màu trắng nhạt, bề mặt khơ Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 1-2mm, màu trắng trong, tâm đậm màu, có viền cƣa, bề mặt khơ, phẳng Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 5-6mm, màu trắng xám, bề mặt khơ, nhăn nheo, có viền cƣa Khuẩn lạc tr n không đều, đƣờng kính 3-4mm, màu trắng đục, tâm đậm màu, bề mặt khơ Khuẩn lạc tr n, đƣờng kính 1mm, màu trắng trong, viền cƣa Kết định tính với X-gal Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Từ 79 chủng vi khuẩn sau kiểm tra phƣơng pháp cấy đĩa thạch sàng lọc đƣợc 10 chủng sinh β-galactosidase thủy phân X-gal tạo thành khuẩn lạc có màu xanh Khi ni cấy mơi trƣờng có chất thị X-gal, số chủng có khuẩn 29 lạc chuyển màu xanh thời gian hình thành khuẩn lạc ngắn (sau 12 nuôi cấy); số chủng c n lại có khuẩn lạc chuyển màu xanh chậm (sau 24 nuôi cấy) Tất chủng đƣợc phân lập từ tƣơng ớt, 8/10 chủng (ngoại trừ TO35.5 TO40.19) đƣợc phân lập từ tƣơng ớt Mƣờng Khƣơng Tƣơng ớt Mƣờng Khƣơng sản phẩm trình lên men giống ớt cay đặc biệt Mƣờng Khƣơng, Lào Cai, không qua trình xử lý nhiệt Các mẫu tƣơng ớt dùng phân lập đƣợc lấy vào mùa hè, số 48 chủng đƣợc phân lập (TO43.13 TO53.2) đƣợc nghiên cứu nhiệt độ 35 C, pH điều kiện tối ƣu cho phát triển hai chủng (Nguyễn Thị Thanh Thủy & cs., 2016) 10 chủng Bacillus sau tuyển chọn đƣợc sử dụng cho nghiên cứu 4.3 Xác định hoạt độ β-galactosidase vi khuẩn Các chủng đƣợc tuyển chọn đƣợc sử dụng để xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase nhằm đánh giá mức độ mạnh yếu (khả xúc tác) enzyme theo phƣơng pháp nhƣ mô tả mục 3.4.3.2 1U tƣơng đƣơng lƣợng enzyme lactase có khả làm chuyển hóa mol lactose phút điều kiện phân tích xác định Kết hoạt độ enzyme đƣợc thể hình 4.4 Hình 4 Hoạt độ enzyme β-galactosidase (U/l) vi khuẩn Bacillus 30 Từ đồ thị 4.4 thấy chủng TO40.19 có hoạt độ enzyme ngoại bào cao (209.74 ± 0.05 U/l) chủng 60.4 có hoạt độ thấp (79.70 ± 0.02 U/l) Hoạt độ enzyme β-galactosidase sinh từ vi khuẩn Bacillus mẫu sữa mẹ tƣơng đối thấp so với chủng c n lại (81.56 ± 0.01 U/l) Kết hoạt độ ngoại bào chủng TO40.19 cao chủng B flexus NT2.8 (42.4 U/l) đƣợc phân lập từ nƣớc thải nghiên cứu tác giả Nguyễn Hoàng Anh Trần Thị Na (2017) nhƣng thấp nhiều so với số tác giả khác Điển hình nhƣ chủng S thermophilus SC3 (389 U/l) có nguồn phân lập từ sữa chua Vinamilk tác giả Nguyễn Thị Huyên (2018) nuôi 37 C sau 24h; chủng LT12 (vi khuẩn lactic) đƣợc phân lập từ sáp ong Trần Thị Thúy & Nguyễn Thị Vân (2013) cho hoạt độ enzyme cao (470 U/l) sau nuôi cấy 37 C, pH hay L acodophilus (1534 U/l) Nguyễn Thị Vân Linh & cs., (2013), sau tinh hoạt độ enzyme c n lại 599,3 U/l chế phẩm enzyme có hoạt tính tối ƣu 40 C, pH – 7,5…Ba chủng vi khuẩn lactic nhƣng đƣợc phân lập từ nhiều nguồn khác (sữa chua, sáp ong), nhiên chúng đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thích hợp (pH, nhiệt độ, thành phần mơi trƣờng) nên có khả sinh enzyme tốt Do cần có nghiên cứu độ pH, nhiệt độ ni cấy, sau tiến hành tinh để cải thiện khả sinh t ng hợp enzyme chủng TO40.19 4 Tinh s β-galactosidase Dịch nuôi cấy chứa enzyme sau ly tâm loại bỏ tế bào mảnh vụn tế bào đƣợc chuyển sang tinh enzyme nhằm loại bỏ chất khơng có lợi cho mục đích sử dụng (nƣớc, protein khơng có hoạt tính), đồng thời làm tăng t ng hoạt tính enzyme Tinh sơ muối (NH4)2SO4 giúp kết tủa protein nồng độ muối h a tan cao mà không ảnh hƣởng xấu đến enzyme Cách thực đƣợc mô tả mục 3.4.4 Chủng TO40.19 (209.74 U/l) sau tinh chế phẩm enzyme thô (NH4)2SO4 thu đƣợc kết tủa enzyme Đây bƣớc tinh ban đầu nên chƣa xác định đƣợc nồng độ muối bão h a thích hợp, hiệu suất thu hồi độ tinh enzyme, cần nghiên cứu thêm vấn đề Các nghiên cứu khác có liên quan đề tài có 31 thể tham khảo nhƣ nghiên cứu Nguyễn Thị Vân Linh & cs., (2013) cho thấy tinh L acidophilus muối amonisunfate độ bão h a 90% cho hiệu suất thu hồi 43.15% độ tinh đạt cao 2.4 lần Trong Nguyễn Thị Huyên (2018) enzyme nội bào chủng S thermophiles SC3 cho hoạt tính riêng cao 2.783 (U/mg protein) sau tinh sơ muối (NH4)2SO4 bão h a 60%, hiệu suất thu hồi đạt 86.63%, độ tinh đạt 7.7 lần Với chế phẩm enzyme thu nhận từ chủng Bacillus, Nguyễn Hoàng Anh & Trần Thị Na (2017) nhận thấy sau tinh chủng B flexus NT2.8 muối (NH4)2SO4 60% hoạt tính riêng enzyme đạt cao (0.639 U/mg) với hiệu suất thu hồi 86.55% độ tinh 3.2 lần Ngoài ra, Patil & cs., (2011) kết tủa phân đoạn (NH4)2SO4 thu enzyme lactase từ Bacillus sp MTCC-864 cho thấy độ bão h a muối 40 – 60% cho hiệu kết tủa tốt Từ nghiên cứu cho thấy kết tủa muối amonisufate cho độ tinh chế phẩm không cao, c n hiệu suất thu hồi cao/thấp tùy chủng Tuy nhiên bƣớc tinh ban đầu, coi nhƣ bƣớc đặc sớm protein kết tủa h a tan lại vào nƣớc (Nguyễn Thị Hiền & cs., 2012) Do nghiên cứu so sánh mức hiệu (NH4)2SO4 với tác nhân kết tủa enzyme khác nhƣ isopropanol, ethanol… kết hợp tác nhân kết tủa nhƣ nghiên cứu Duman YA & Kaya (2013) phân vùng ba pha (TPP) để tinh enzyme lactase từ hạt đậu gà Phƣơng pháp sử dụng amonisunfate t – butanol với nồng độ muối, tỷ lệ dung mơi thích hợp thêm vào chiết xuất enzyme thơ, sau ly tâm tạo điều kiện phân tách pha Kết cho thấy khả thu hồi βgalactosidase độ tinh lần lƣợt 133% 10.1lần độ bão h a (NH4)2SO4 60% (w/v), tỷ lệ chiết xuất thô: t – butanol 1: 0.5, điều chỉnh pH 6.8 TPP kỹ thuật đơn giản, sử dụng hóa chất rẻ, dễ kiếm để tinh chế thu hồi enzyme lactase, có tiềm ứng dụng công nghiệp thực phẩm 32 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Xác định đƣợc môi trƣờng ni cấy thích hợp cho Bacillus NB (peptone 10g/l, cao thịt 5g/l, NaCl 5g/l) NA (NB b sung thêm agar 20g/l) - Từ chủng Bacillus phân lập đƣợc từ mẫu sữa thu đƣợc chủng có khả sinh enzyme β-galactosidase - Từ 79 chủng Bacillus sƣu tập sau nuôi cấy môi trƣờng b sung thị X-gal xác định đƣợc 10 chủng có khả sinh β-galactosidase - Trong 11 chủng Bacillus có hoạt tính, chủng TO40.19 cho hoạt độ enzyme cao 209.74 ± 0.05 U/l sau 24h nuôi 37 C - Tinh sơ chế phẩm enzyme thô từ chủng TO40.19 (NH4)2SO4 Đề nghị Do điều kiện trình thực khóa luận c n nhiều hạn chế nên đề tài chƣa đạt đƣợc kết nhƣ mong muốn, muốn đề xuất số nội dung nhƣ sau: - Nghiên cứu nhiệt độ, pH thích hợp để tối ƣu hoạt độ enzyme thu nhận đƣợc từ chủng TO40.19 - Tiếp tục xác định đặc tính enzyme từ chủng TO40.19 sau tinh nhƣ độ bền nhiệt độ thấp (4 C) khả phân giải lactose sữa tƣơi nguyên liệu - Tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp tinh enzyme đánh giá hiệu suất thu hồi, độ tinh phƣơng pháp 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Anabio (2018) Các ng dụng thực tế Bacillus subtilis – loại vi khuẩn quan trọng khoa học y tế đời s ng người, https://bit.ly/3kpGEDE truy cập ngày 02/08/2021 Nguyễn Hoàng Anh & Trần Thị Na (2017) Tuyển chọn định danh vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt , Tạp chí Khoa học Nông nghi p Vi t Nam 2017, 15(8), 1070-1076 Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn (2021) –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galacto-oligosaccharide enzyme , Tạp chí khoa học nơng nghi p Vi t Nam 2021, 19(6): 745-755 Báo Chính phủ (2019) Hành trình đưa sữa Vi t giới, https://bit.ly/3D8SI4K truy cập ngày 23/08/2021 Bộ Công Thƣơng (2010) Phê t Quy hoạch phát triển Ngành công nghi p chế biến sữa Vi t Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2025 Bộ NN & PTNT (2017) QCVN 01-186: 2017/BNNPTNT Quy chuẩn kỹ thu t qu c gia sữa tươi nguyên li u Bộ Y tế (2007) Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, tr 431 Công Thƣơng (2021) Ngành sữa ị tác động Covid-19, https://bit.ly/2WlvYxJ truy cập ngày 02/07/2021 Nguyễn Ý Đức (2018) Sữa ò s c khỏe, https://bit.ly/3Bdd638 truy cập ngày 23/08/2021 10 Nguyễn Thu Hà, Barbara Splechtna, Stanimira Krasteva, Wolfgang Kneifel, Klaus D Kulbe, Christina Divne, Dietmar Haltrich (2007) Đặc tính hóa nhân ản phân tử dị phân tử  -galactosidase từ chủng lợi khuẩn Lactobacillus acidophilus R22, https://bit.ly/3CuCnq7 truy cập ngày 01/07/2021 34 11 Trƣơng Nam Hải (2004) Nghiên c u, phân p tạo chủng gi ng kỹ thu t di truyền để sinh tổng hợp enzyme beta-ga actosidase có hi u suất cao ng dụng thực phẩm Báo cáo t ng kết Khoa học Kỹ thuật 12 Nguyễn Thị Hiền, Lê Gia Hy, Quản Lê Hà & Từ Việt Phú (2012) Công ngh sản xuất enzyme, protein ng dụng, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội 13 Nguyễn Thị Huyên (2018) Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh enzyme  ga actosidase ưa ạnh, ước đầu nghiên c u ng dụng enzyme sản xuất sữa tươi ti t trùng không actose, Luận văn Thạc sĩ, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 14 Invest Vietnam (2020) Báo cáo ngành sữa Vi t Nam quý 2/2020 https://bit.ly/3jdNe0A truy cập ngày 02/07/2021 15 Nguyễn Thị Lâm (2021) Đ i phó ch ng khơng dung nạp lactose, https://bit.ly/3Dh7d6D truy vập ngày 23/08/2021 16 Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung Trần Bích Lam (2013) Thu nhận tinh β-galactosidase từ Lactobacillus acidophilus”, Tạp chí phát triển KH&CN 15, tập 3, 65-72 17 Nhân dân, 2021 Vinamilk xuất sữa hạt sữa đặc sang Trung Qu c https://bit.ly/3km1TGn truy cập ngày 23/07/2021 18 Nhi Nguyen (2014) C p nh t thị trường tiêu thụ sữa Vi t Nam, hội dành cho sữa không actose, https://bit.ly/3iXs86P truy cập ngày 17/7/2021 19 Nguyễn Văn Phúc & Phan Thị Phƣợng Trang (2014) Phân p, định danh xác định đặc tính có ợi chủng Bacillus spp từ ao nuôi tôm tỉnh Bến Tre, Thành phố Hồ Chí Minh 20 Hiromi Shinya (2019) Nhân t enzyme: Phương th c s ng ành mạnh, tái lần thứ 16, NXB Thế giới, tr 75 21 Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Hữu Tâm, Trần Cát Đông (2014) Nghiên c u đặc tính pro iotic Bacillus subtilis BS02, Ph ng TN Vi Sinh Công Nghệ Dƣợc, Khoa Dƣợc, ĐH Y Dƣợc TP.HCM 22 Trần Thị Thúy & Nguyễn Thị Vân (2013) Phân p, tuyển chọn nghiên c u vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase từ sáp ong, Khoa Sinh học, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 35 23 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên c u tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân p từ đất vườn sinh protease kiềm, Luận văn thạc sĩ trƣờng Đại học sƣ phạm TP HCM, 24 Vũ Văn Tiến, 2013 Vinamilk giới thi u sản phẩm sữa ti t trùng không actoza Vi t Nam, Báo Dân trí, https://bit.ly/3xZkDR0 truy cập ngày 01/08/2021 25 T ng cục thống kê (2021) Kinh tế tháng đầu năm 2021 tăng trưởng ất chấp dịch Covid-19 diễn biến ph c tạp, https://bit.ly/2W04Lkm, truy cập ngày 01/08/2021 Tài liệu tiếng Anh Akinola G E., Adebayo-Tayo B & Olonila O T (2012) Screening and production of β-galactosidase by Trichoderma species, https://bit.ly/3yU9eDn truy cập ngày 01/07/2021 Bradford M M (1976) A rapid and sensitive method for quantitation of protein utilization, the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, (72), pp 248-254 Chen W., Chen H , Xia Y , Yang J., Zhao J., Tian F., Zhang HP, Zhang H (2009) Immo i ization of recom inant thermosta e β-galactosidase from Bacillus stearothermophilus for lactose hydrolysis in milk, https://bit.ly/37VxkBO truy cập ngày 02/07/2021 Choi S H., Lee S B & Won H R (2007) Development of lactose-hydrolyzed milk with low sweetness using nanofiltration, https://bit.ly/2XZy8nz truy cập ngày 01/08/2021 Duman Y.A & Kaya E (2013) Purification, recovery, and characterization of chick pea (Cicer arietinum) β-galactosidase in single step by three phase partitioning as a rapid and easy technique 91 (2): 155-60 FDA Generally Recognized as Safe (GRAS), https://bit.ly/2WSFfxk (2020); https://bit.ly/3toYgDW (2016); https://bit.ly/38InXWk (2015) truy cập ngày 10/08/2021 Nguyen Thi Thanh Thuy, Vu Thi Huyen Trang, Vu Quynh Huong, Trinh Thi Thu Thuy, Nguyen Thi Lam Doan, Tran Thi Na & Nguyen Hoang Anh (2016) Isolation, identification and preliminary characterization of Bacillus subtilis with 36 broad-range antibacterial activity from Muong Khuong chilli sauce , Tạp chí KH Nơng nghi p Vi t Nam, tập 14, số 7: 1009-1015 Parmjit S P., K Shwta & P Reeba (2010) Protential Applications of Ininiobilized β-galactosidase in Food Prossesing Industries SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Article ID473/37, 16 page Patil M M., Mallesha, Ramana K V & Bawa A S., (2011) Characterization of partia y purified β-galactosidase from Bacillus Sp MTCC-864, Recent Research in Science and Technology 3, 84-87 10 Priest F G & Grigorova R (1991) Method for studying the ecology of endosporeforming bacteria, Method in microbiology 22, 565-591 11 Rosovitz M J., Voskuil M I & Chambliss G (1998) Bacillus, In: A Balows and B I Duerden (Eds), Systematic Bacteriology Arnold PRESS, London: 709-720 12 Storhaug C L., Fosse S K & Fadnes L T (2017) Country, regional, and global estimates for lactose malabsorption in adults: a systematic review and metaanalysis, The Lancet Gastroenterology & Hepatology; 2(10):738–746 13 Cơ sở liệu Euromonitor, có sẵn trực tuyến https://www.euromonitor.com/ truy cập ngày 01/08/2021 37 PHỤ LỤC Bảng 1: Hoạt độ enzyme chủng Bacillus sau 24h nuôi 37°C Mẫu Hoạt độ enzyme ngoại bào Mẫu (U/l) Hoạt độ enzyme ngoại bào (U/l) SM01 81.56 ± 0.01 35.18 154.01 ± 0.08 60.4 79.70 ± 0.02 59.5 116.85 ± 0.02 32.4 98.28 ± 0.09 51.2 98.28 ± 0.03 40.38 98.28 ± 0.02 TO35.5 135.43 ± 0.02 32.13 135.43 ± 0.04 TO40.19 209.74 ± 0.05 36.5 154.01 ± 0.03 38