Khóa luận tốt nghiệp tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocine phân lập từ ruột gà

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: "TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCINE PHÂN LẬP TỪ RUỘT GÀ" Sinh viên thực : Hoàng Thị Ngọc Giang Lớp : K62CNSHA MSV : 620457 Giảng viên hƣớng dẫn : PSG TS Nguyễn Xuân Cảnh TS Phạm Hồng Hiển HÀ NỘI - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2020 Sinh viên Hoàng Thị Ngọc Giang i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian tiến hành thực tập Bộ môn Công nghệ Vi sinh- khoa Công nghệ Sinh học Đƣợc quan tâm, hƣớng dẫn giúp đỡ tận tình Thầy/Cơ giáo, cán Phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, cố gắng nỗ lực thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, TS Phạm Hồng Hiển ngƣời định hƣớng nghiên cứu tận tình bảo, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến, PGS TS Nguyễn Văn Giang, ThS Nguyễn Thanh Huyền, ThS Trần Thị Đào anh chị toàn thể bạn bè giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập Xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học, thầy cô, cán trƣờng Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập vừa qua Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vơ hạn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, ngƣời thân, bạn bè động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2020 Sinh viên Hoàng Thị Ngọc Giang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN I – MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu PHẦN II – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn axit lactic 2.2 Sơ lƣợc bacteriocin 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu bacteriocin 2.2.2 Định nghĩa 2.2.3 Đặc điểm, tính chất 2.2.4 Cơ chế hoạt động bacteriocin 2.2.5 Ứng dụng bacteriocin 2.2.5.3 Các giống khởi động 2.2.5.4 Làm probiotic 2.2.5.5 Các bacteriocin thƣơng mại 2.2.6 Tình hình nghiên cứu bacteriocin 2.2.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.2.6.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 10 PHẦN III - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu 12 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 12 3.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.1.2.1 Địa điểm 12 3.1.2.2 Thời gian nghiên cứu 12 iii 3.1.3 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 12 3.1.4 Thiết bị hóa chất 13 3.1.4.1 Thiết bị 13 3.1.4.2 Dụng cụ 14 3.1.4.3 Hóa chất 14 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.2.2 Phân lập vi khuẩn lactic 14 3.2.3 Đánh giá khả kháng khuẩn 15 3.2.4 Kiểm tra khả sinh bacteriocin 15 3.2.4.1 Xử lý nhiệt độ 15 3.2.4.2 Xử lý với proteinase K 16 3.2.5 Định danh chủng vi khuẩn 16 3.2.5.1 Tách chiết DNA vi khuẩn 16 3.2.5.2 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 16 3.2.5.3 Định danh phân tích phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 17 3.2.6 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn 18 PHẦN IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu ruột gà thu thập 19 4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn 20 4.3 Kiểm tra khả sinh bacteriocin 23 4.3.1 Xử lý nhiệt độ 23 4.3.2 Xử lý proteinase K 24 4.4 Định danh chủng vi khuẩn HD3 HN5 .25 4.4.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 25 4.4.2 Định danh phân tích phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 25 4.5 Đặc điểm sinh học chủng HD3 HN5 27 4.5.1 Nhuộm Gram 27 4.5.2 Phản ứng catalase 28 4.5.3 Khả sinh axit lactic 29 PHẦN V – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Kiến nghị .31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Kết phân lập từ mẫu thu thập đƣợc 19 Bảng 4.2: Bảng kết vòng kháng vi sinh vật gây bệnh 21 Bảng 4.3: kết quan sát hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn 27 Bảng 4.4: Kết khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn 29 Bảng 4.5: Kết thử khả chịu axit chủng vi khuẩn tuyển chọn 29 v DANH MỤC HÌNH Hình 4.1: Khả phân giải CaCO3 số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 20 Hình 4.2: Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh chủng lactic 22 Hình 4.3: Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt độ 23 Hình 4.4: Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn lactic sau xử lý proteinase K 24 Hình 4.5: Kết chạy điện di sản phẩm PCR 25 Hình 4.6: Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng HD3 HN5 26 Hình 4.7: Kết nhuộn Gram chủng HD3 HN5 27 Hình 4.8: Hình ảnh minh họa hoạt tính catalase chủng vi khuẩn lactic chủng vi khuẩn đối chứng 28 Hình 4.9: Khả di động vi khuẩn lactic 28 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải thích nghĩa NXB Nhà xuất cs Cộng STT Số thứ tự LAB Lactic Acid Bacteria LB Luria Bertami MRS Man, Rogosa Sharpe OD Oprical Density WHO World Health Organization E coli Escherichia coli PCR Polymerase chain reaction vii TĨM TẮT Với mục đích đề tài tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn sinh bacteriocin phân lập từ ruột gà, tiến hành phân lập vi khuẩn từ nguồn khác Sau đánh giá khả đối kháng chủng phân lập đƣợc với chủng vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli Salmonella Kiểm tra khả sinh bacteriocin phƣơng pháp xử lý nhiệt xử lý enzyme proteinase K Định danh số chủng tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng Từ mẫu lấy từ tỉnh, thành phố khác (Thái Nguyên, Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Dƣơng, Hƣng Yên), thu đƣợc 15 chủng vi khuẩn khác nhau, tiến hành đánh giá khả đối kháng 15 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc với chủng vi khuẩn kiểm định Escherichia coli Salmonella phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch Kết thu đƣợc 15 chủng vi khuẩn có khả kháng lại chủng vi khuẩn kiểm định Escherichia coli Salmonella, sau chúng tơi tiến hành chọn chủng có khả kháng khuẩn tốt để kiểm tra khả sinh bacteriocin là: TN5, HN4, HN5, HD3, HY1 HY2 tiến hành chọn chủng tốt HD3, HN5 để định danh nghiên cứu số đặc điểm sinh học viii PHẦN I – MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi nhân tố quan trọng kinh tế Việt Nam Mục tiêu nhà chăn nuôi đạt đƣợc kinh tế tối đa với chi phí thấp Đó mục tiêu nhà nƣớc nhƣ nhà khoa học để đƣa thành tựu nghiên cứu khoa học vào chăn nuôi Tuy nhiên bệnh vật nuôi ngày nhiều phức tạp đặc biệt bệnh đƣờng tiêu hóa, để giảm thiểu tối đa thiệt hại, nhà chăn nuôi sử dụng kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng ngày lệ thuộc vào kháng sinh nhƣ yếu tố kích thích sinh trƣởng để chữa bệnh cho vật nuôi gây tƣợng kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh Sự kháng lại kháng sinh mầm bệnh, với kháng sinh hệ mới, ngày nhanh so với việc tìm kháng sinh thay để phịng trừ vi khuẩn đề kháng này, dƣ lƣợng thuốc kháng sinh tồn đọng thực phẩm gây hại đến sức khỏe ngƣời Vì vậy, việc phịng điều trị bệnh đƣờng tiêu hố cho vật ni hạn chế sử dụng kháng sinh vấn đề đƣợc nhà khoa học nhà chăn nuôi quan tâm Ngƣời ta đẩy mạnh việc ứng dụng sản phẩm sinh học vào chăn nuôi LAB đƣợc coi nhƣ nhóm vi khuẩn probiotic cho ngƣời động vật (Chen, 2005) Vì chúng an tồn, chịu đƣợc axit muối mật Chúng bám dính tốt vào biểu mơ ruột vật chủ ức chế phất triển vi khuẩn gây bệnh nhƣ Escherichia coli Salmonella vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột gà (Murry, 2004) Chúng trì khả tồn trình chế biến bảo quản thức ăn gia súc (Lin, 2007) Vì vậy, nỗ lực để giảm kháng sinh chăn nuôi sử dụng probiotic ngày đƣợc quan tâm, nhƣ giải pháp thay hiệu chi phí kiểm sốt bệnh động vật cải tiến suốt vật nuôi (Reuter, 2001) Chủng vi sinh vật có khả sinh bacteriocin phổ biến vi khuẩn Bảng 4.2: Bảng kết vòng kháng vi sinh vật gây bệnh ST T Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D-d) (mm) Ký hiệu chủng E coli Salmonella TN3 14 0,01 14 0,01 TN5 14 0,01 14 0,01 TN5.5 16 0,02 13 0,01 BN1 12 0,01 14 0,01 BN4 11 0,02 0,01 BN6.6 0,02 HN2 14 0,02 14 0,01 HN4 16 0,01 14 0,02 HN5 16 0,02 17 0,01 10 HN7 14 0,01 11 HN1.1 12 0,01 11 0,02 12 DN2 16 0,01 14 0,01 13 HD3 16 0,01 17 0,02 14 HY1 15 0,02 16 0,01 15 HY2 14 0,01 15 0,02 0,02 21 0,02 Hình 4.2: Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh chủng lactic Hầu hết chủng phân lập đƣợc có khả kháng vi khuẩn gây bệnh Trong đó, có chủng kháng từ yếu đến trung bình là: HN7, HN1.1, BN1, BN4, BN6.6; vịng kháng khuẩn đo đƣợc từ ÷ 14 mm Cịn lại 10 chủng có khả kháng từ trung bình đến mạnh với chủng vi khuẩn gây bệnh là: TN3, TN5, TN5.5, HN2, HN4, HN5, DN2, HD3, HY1 HY2, vòng kháng khuẩn đo đƣợc từ 14 ÷ 17 mm Tuyển chọn từ 10 chủng đƣợc chủng có khả kháng khuẩn tốt có đặc điểm hình thái khác là: HN4, HN5, TN5, HD3, 22 HY1 HY2 để tiếp tục nghiên cứu 4.3 Kiểm tra khả sinh bacteriocin 4.3.1 Xử lý nhiệt độ Sau xử lý nhiệt độ 100oC, dịch lọc chủng vi khuẩn thử nghiệm khơng cịn hoạt tính đối kháng với E coli Salmonella Điều cho thấy yếu tố kháng khuẩn chủng vi khuẩn có chất protein Kết thử nghiệm đƣợc thể hình 4.3 ĐK E coli ĐK E coli ĐK Salmonella ĐK Salmonella Hình 4.3: Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt độ Tất chủng vi khuẩn tuyển chọn khả kháng lại vi sinh vật gây bệnh, điều phần chứng tỏ khả kháng khuẩn chủng lactic bacteriocin sinh từ chủng vi khuẩn lactic tƣơng ứng Nhƣ vậy, ta tiếp tục thực nghiên cứu với chủng vi khuẩn lactic 23 4.3.2 Xử lý proteinase K Proteinase K hoạt động cách phá hủy protein vi khuẩn lactic phá hủy bacteriocin Nếu sau xử lý proteinase K mà vi khuẩn khả kháng khuẩn chứng tỏ khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn bacteriocin mà vài yếu tố khác ĐK E coli ĐK E coli ĐK Salmonella ĐK Salmonella Hình 4.4: Khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn lactic sau xử lý proteinase K Kết cho thấy tất chủng vi khuẩn lactic khơng cịn khả kháng vi khuẩn gây bệnh Điều khẳng định khả kháng vi sinh vật gây bệnh bacteriocin đƣợc sinh axit lactic tƣơng ứng Từ chủng chọn chủng khác để định danh, chủng HN5 HD3 24 4.4 Định danh chủng vi khuẩn HD3 HN5 4.4.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR Hai chủng vi khuẩn sau đƣợc tuyển chọn tiến hành khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi phổ biến 27F VÀ 1492R Tiến hành điện di gel agarose Kết thu đƣợc hình 4.5 HD3, HN5 Hình 4.5: Kết chạy điện di sản phẩm PCR Sau chạy thử nhiều lần kết điều cho thấy kích thƣớc đoạn gen chủng HD3 HN5 khoảng 1500bp nhƣng lần chạy cuối không sử dụng marker hình ảnh khơng có marker 4.4.2 Định danh phân tích phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA Sản phẩm PCR chủng HD3 HN5 đƣợc gửi giải trình tự định danh đến lồi Từ kết giải trình tự đoạn gen 16S RRNA sử dụng công cụ blast phần mềm mega 06 dựng phân loại hình 4.6 25 Hình 4.6: Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng HD3 HN5 Kết giải trình tự đoạn gen 16s rRNA hình 4.6 cho thấy chủng HD3 HN5 gần với nhóm vi khuẩn lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum vi khuẩn gram dƣơng thuộc nhóm lợi khuẩn, tìm đƣợc đƣờng ruột động vật thực phẩm lên men Các chủng L fermentum đƣợc thƣơng mại hóa, đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học bao gồm PCC, ME-3 CECT5716 Do chủng HD3 HN5 có tiềm sử dụng làm probiotic bổ sung 26 vào thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên cần phải có nghiên cứu thêm muốn ứng dụng vào thực tiễn 4.5 Đặc điểm sinh học chủng HD3 HN5 4.5.1 Nhuộm Gram Sau quan sát hình thái khuẩn lạc chủng HD3 HN5 tiến hành nhuộm Gram chủng, kết thu đƣợc bảng 4.3 hình 4.7 Bảng 4.3: kết quan sát hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn Ký hiệu Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn chủng Màu sắc Hình dạng Bề mặt Mép HN5 Trắng sữa Trịn Nhẵn, bóng Nhăn HD3 Trắng sữa Trịn Lồi Trơn HD3 HN5 Hình 4.7: Kết nhuộn Gram chủng HD3 HN5 Kết hình 4.7 cho thấy hình thái chủng HD3 HN5 hình que, Gram (+) 27 4.5.2 Phản ứng catalase Kết thử nghiệm phản ứng catalase cuađƣợc thể hình 4.8 Vi khuẩn lactic Vi khuẩn đối chứng Hình 4.8: Hình ảnh minh họa hoạt tính catalase chủng vi khuẩn lactic chủng vi khuẩn đối chứng Enzyme catalase xúc tác cho phản ứng: H2O2 → H2O + O2 dẫn đến tƣợng sủi bọt (hình b) Trong vi khuẩn lactic khơng có enzyme catalase nên khơng xuất bọt khí (hình a) HN5 HD3 Hình 4.9: Khả di động vi khuẩn lactic Kết cho thấy chủng vi khuẩn tuyển chọn không mọc lan xung quanh vết cấy, chứng tỏ chủng khơng có khả di động 28 4.5.3 Khả sinh axit lactic Bảng 4.4: Kết khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn Giá trị pH sau khoảng thời gian Ký hiệu STT chủng 12h 15h 18h 21h HN5 4,57 4,34 4,25 4,24 HD3 4,89 4,59 4,38 4,22 Kết cho thấy giá trị pH thay đổi cho thấy khả sinh acid lactic chủng vi khuẩn thí nghiệm 4.5.4 Khả chịu axit Bảng 4.5: Kết thử khả chịu axit chủng vi khuẩn tuyển chọn pH 0h 0,171 0,262 0,276 0,212 3h 0,204 0,298 0,299 0,398 6h 0,294 0,367 0,377 0,394 9h 0,392 0,390 0,405 0,485 0h 0,225 0,370 0,247 0,419 3h 0,251 0,251 0,306 0,470 6h 0,280 0,302 0,336 0,499 9h 0,370 0,307 0,359 0,665 (h) HD3 HN5 29 Kết cho thấy, thời điểm 0h chủng pH khác có giá trị OD 620nm gần tƣơng tự Điều chứng tỏ ban đầu chủng vi khuẩn lactic không bị ảnh hƣởng pH thấp Sau khoảng thời gian 3h, 6h, 9h chủng HN5 HD3 sinh trƣởng bình thƣờng giá trị pH, nhƣng tốt mơi có giá trị pH 30 PHẦN V – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận ❖ Từ mẫu ruột gà lấy từ tỉnh thành khác thu đƣợc 15 chủng vi khuẩn ❖ Tuyển chọn đƣợc chủng có khả đối kháng mạnh với vi khuẩn kiểm định là: E coli Salmonella sp ❖ Đánh giá đƣợc khả sinh bacteriocin chủng chọn lọc phƣơng pháp xử lý nhiệt xử lý enzyme proteinase K ❖ Định danh chủng HN5 HD3, dựng đƣợc phân loại thấy đƣợc chủng HN5 HD3 giống với nhóm vi khuẩn lactobacillus fermentum, nhóm lợi khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến làm chế phẩm sinh học ❖ Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng định danh - Gram (+) - Phản ứng catalase âm tính - Khơng có khả di động - Có khả sinh axit lactic - Khả chịu axit tốt 5.2 Kiến nghị ❖ Nghiên cứu điều kiện thích hợp để chủng vi khuẩn có khả kháng tốt với vi khuẩn gây bệnh ❖ Nghiên cứu khả đối kháng với chủng vi khuản gây bệnh khác nhƣ Shigella sp (gây bệnh kiết lị), vibrio, … ❖ Đánh giá khả kháng kháng sinh để sử dụng kết hợp kháng sinh LAB phòng trị bệnh 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dƣơng Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, Đan Duy Pháp, Vũ Thanh Thảo, Trần Cát Đông (2011) Phân lập sàng lọc số vi khuẩn lactic có tiềm làm probiotic Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo (2006) Các nhóm vi khuẩn chủ yếu Vietsciences Nguyễn Thị Hồng Nhung, Lê Thị Thƣơng, Nguyễn Thị Thu Hằng Nguyễn Thị Huyền (2019) Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có tiềm ứng dụng tạo chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung vào thức ăn chăn ni Tạp chí khoa học công nghệ lâm nghiệp Nguyễn Thị Minh Hằng Nguyễn Minh Thƣ (2013) Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp amylase bacteriocin Tạp chí khoa học công nghệ lâm nghiệp Nguyễn Thị Thanh Huế (2017) Nguyên cứu bacteriocin vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao Huế Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn Trần Anh Thƣ (2018) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tôm Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM 32 Tài liệu tiếng anh: Azhar N S, Md Zin N H, Hamid THTA (2017) Lactococcus lactis strain A5 producing nisinlike bacteriocin active against Gram positive and negative bacteria Trop Life Sci Res 28, 107–118 Butin N, S Chanthachum, T Hongpattarskere (2008) Screening of lactic bacteria from gastrointestinal tracts of marine fish for their potential use as probiotic Songklanakarin J Sci Technol, 30: 141-148 Calo-Mata P, S Arlindo, K Boehme, T Miguel, A Pascoal, J Barros-Velazquez (2008) Current applications and future trends of lactic acid bacteria and their bacteriocins for the biopreservation of aquatic food products Food and Bioprocess Technology Chen S W, C H Liu, S Y Hu, (2019) Dietary administration of probiotic Paenibacillus ehimensis NPUST1 with bacteriocin-like activity improves growth performance and immunity against Aeromonas hydrophila and Streptococcus iniae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) Fish Shellfish Immunol 84, 695–703 Chen Y J, K S Son, B J Min, J H Cho, O S Kƣơn and I H Kim (2005) Effects of dietary probiotic on growth performance, nutrients digestibility, blood characteristics and fecal noxious gas content in growing pigs Asian-Aust J Anim Sci, 18: 1464-1468 Deegan L H, P D Cotter, C Hill, P Ross (2006) Bacteriocins: biological tools for biopreservation and shelf-life extension Int Dairy J 16, 1058–1071 Feliatra F, Z A Muchlisin, H Y Teruna, W R Utamy, N Nursyirwani, A Dahliaty (2018) Potential of bacteriocins produced by probiotic bacteria isolated from tiger shrimp and prawns as antibacterial to Vibrio, Pseudomonas, and Aeromonas species on fish, 415 Florie D, D Difer, N Bourgougnon, B Brillet, P L Chevalier, Y.Fleury (2010) Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic Natinoal Centrer for Biotechnology Information Irfan A Rather, Richelle Galope, Vivek K Bajpai, Jeongheui Lim, Woon Kee Paek and Yong-Ha Park (2017) Diversity of Marine Bacteria and Their Bacteriocins: Applications in Aquaculture Reviews in Fisheries Science & Aquaculture 10 Jinsong W, S Zhang, Y Ouzang and R Li (2019) Current developments of bacteriocins, screening methods and their application in aquaculture and aquatic 33 products Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 11 Kimura M (1980) Asimple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotid sequences Mol Evol, 16: 111120 12 Lin W-H, B Yu, J Sheng-Hon and T Hau-Yang (2007) Different probiotic properties for Lactobacillus fermentum strains isolated from swine and poultry Anaerobe, 13: 107-113 13 Lin Y.H, Y S Chen, H C Wu, S F Pan, B Yu, C M Chiang, C.M Chiu, F Yanagida (2013) Screening and characterization of LAB-produced bacteriocin-like substances from the intestine of grey mullet (Mugil cephalus L.) as potential biocontrol agents in aquaculture J Appl Microbiol 114, 299–307 14 Murry A C, A Hinton and H Morrison (2004) Inhibition of growth of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Clostridium perfringens on chicken feed media by Lactobacillus salivarius and Lactobacillus plantarum Int J Poult Sci, (9): 603607 15 Nissen-Meyer J, C Oppegård, P Rogne, H S Haugen, P E Kristiansen (2011) The two-peptide (Class-IIb) bacteriocins: genetics, biosynthesis, structure, and mode of action In: Drider, D., Rebuffat, S (Eds.), Prokaryotic Antimicrobial Peptides: from Genes to Applications Springer New York, New York, NY, pp 197–212 16 Paula M O’Connor, T M Kuniyoshi, R Ps Oliveira, C Hill, R P Ross, P D Cotter (2020) Antimicrobials for food and feed; a bacteriocin perspective Natinoal Centrer for Biotechnology Information 17 Reuter G (2001) Probiotics-pssibilities and limitations of their application in food, animal feed, and in pharmaceutical preparations for men and animals Berl Munch Tierarztl Wochenschr 114: 410-419 18 Rim E.J, E B Monia, C M Pilar, B Karola, F.-N Inmaculada, B.-V Jorge, B.-Z Balkiss (2016) In vitro probiotic profiling of novel Enterococcus faecium and Leuconostoc mesenteroides from Tunisian freshwater fishes Can J Microbiol 62, 60–71 19 Rine C R, P C Roy, S L Sarkar, R.-UI Alm and I K Jahid (2019) Isolation, characterization, and assessment of lactic acid bacteria toward their selection as poultry probiotics Natinoal Centrer for Biotechnology Information 20 Sahar A, J S Tan, T A T Ibrahim, F Bashokouh, N R Ramakrishnan, S Mustafa and A B Ariff (2017) Diversity of Marine Bacteria and Their Bacteriocins: 34 Applications in AquaculturFermentation factors influencing the production of bacteriocins by lactic acid bacteria: a review RSC Advances 21 Suphan Bakkal, Sandra M Robinson and Margaret A Riley (2012) Bacteriocins of Aquatic Microorganisms and Their Potential Applications in the Seafood Industry University of Massachusetts Amherst USA 22 Tapasa K S, A K Patel, P K Jena and S Seshadri (2014) Bacteriocins and their applications for the treatment of bacterial diseases in aquaculture: A review Aquaculture Research 23 Zhen K, L Xue, X Chun, Y Xian, C Hai, M Instrument, T Shanghai, S Fisheries, F S Shanghai, M Fishery, F P Ningde (2019) Research progress of bacteriocins from lactic acid bacteria and its application in aqua culture and processing Sci Technol Food Ind 292–298 35