Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh chủng xạ khuẩn vnua23 có khả năng đối kháng với nấm fusarium oxysporum gây bệnh panama trên chuối

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG XẠ KHUẨN VNUA23 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH PANAMA TRÊN CHUỐI” Sinh viên thực : VŨ NGỌC DƯƠNG Lớp : K62-CNSHB Mã SV : 620573 Người hướng dẫn : PGS TS NGUYỄN XUÂN CẢNH TS PHẠM HỒNG HIỂN Bộ môn : Công nghệ vi sinh HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 21 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Vũ Ngọc Dương i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn ban Giám đốc Học viện, khoa Công nghệ sinh học thầy, khoa tận tình giảng dạy, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam, giúp tơi trưởng thành nhân cách trình độ chun mơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh – Bộ môn Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy TS Phạm Hồng Hiển – Viện Di truyền Nơng nghiệp tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi q trình triển khai đề tài, hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn chị KS Nguyễn Thị Thu, cô Th.S Trần Thị Đào tận tình giúp đỡ, giải đáp thắc mắc suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè, người tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Vũ Ngọc Dương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT ix Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan chuối (Musa ssp.) 2.1.1 Nguồn gốc chuối 2.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ chuối 2.1.3 Các bệnh gây hại chuối 2.2 Tổng quan nấm Fusarium oxysporum gây bệnh panama chuối 2.2.1 Giới thiệu nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 2.2.2 Phân loại Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 2.2.3 Cơ chế gây bệnh Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 2.2.4 Đặc điểm bệnh panama 2.3 Tổng quan Actinobacteria 2.3.1 Giới thiệu chung phân bố Actinobacteria 2.3.2 Phân loại Actinobacteria 11 2.3.3 Actinobacteria nguồn gốc sản phẩm tự nhiên 19 2.3.4 Tương tác có lợi Actinobacteria với thực vật 20 Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22 iii 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất thí nghiệm 22 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phân lập Actinobacteria 23 3.3.2 Sàng lọc in vitro sơ phân lập xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng 24 3.3.3 Hiệu kiểm soát sinh học in vitro xạ khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh chuối 24 3.3.4 Đánh giá đặc điểm hình thái xạ khuẩn đối kháng 25 3.3.5 Đánh giá đặc điểm sinh hóa xạ khuẩn đối kháng 26 3.3.6 Định danh chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm dựa giải trình tự gen 16S rRNA 27 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Sàng lọc in vitro chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 31 4.2 Hiệu kiểm soát sinh học in vitro xạ khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh chuối 32 4.3 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn VNUA23 có hoạt tính kháng nấm mạnh 34 4.3.1 Đặc điểm hình thái 34 4.5.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 34 4.3.1.2 Đặc điểm hình thái chuỗi sinh bào tử, bào tử 35 4.3.2 Đặc điểm sinh hóa 36 4.3.3 Khả sinh trưởng điều kiện môi trường nuôi cấy 38 4.4 Định danh chủng xạ khuẩn VNUA23 dựa giải trình tự gen 16S rRNA 40 4.4.1 Tách chiết xác định nồng độ DNA tổng số 40 4.4.2 Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA 41 iv 4.4.3 Giải trình tự gen 16S rRNA xây dựng phát sinh chủng loại 42 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 51 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 29 Bảng 3.2 Thành phần cho phản ứng PCR 29 Bảng 4.2 Khả sử dụng nguồn cacbon khác chủng xạ khuẩn VNUA23 38 Bảng 4.3 Tỷ số A260/A280 nồng độ DNA có mẫu VNUA23 40 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.2 Hình thái khuẩn lạc số xạ khuẩn 10 Hình 2.3 Sơ đồ biểu diễn vịng đời xạ khuẩn sinh bào tử 11 Hình 2.4 Hình vẽ sơ đồ loại chuỗi bào tử xạ khuẩn tạo 14 Hình 4.1 Sàng lọc in vitro chủng xạ khuẩn: có hoạt tính kháng nấm (B C); khơng có hoạt tính kháng nấm (A) sau ngày cấy nấm 31 Hình 4.2 Đồng ni cấy chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm với chủng nấm kiểm định Foc (R05) sau ngày cấy nấm 32 Hình 4.3 Hiệu lực ức chế chủng xạ khuẩn đối kháng với chủng nấm kiểm định R05 sau ngày cấy nấm 33 Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn VNUA23 môi trường từ ISP1 đến ISP5 sau ngày nuôi cấy 34 Hình 4.5 Hình thái hệ sợi (A), chuỗi sinh bào tử bào tử (B C) chủng xạ khuẩn VNUA23 36 Hình 4.6 Chủng xạ khuẩn VNUA23 môi trường ISP6 sau ngày nuôi cấy 36 Hình 4.7 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn VNUA23 nguồn cacbon tinh bột 37 Hình 4.8 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn VNUA23 20, 30, 37, 40, 45 50℃ 39 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm DNA tổng số chủng xạ khuẩn VNUA23 gel agarose 1% 41 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn VNUA23 gel agarose 1.5 % 42 Hình 4.11 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gen 16S rRNA 43 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Chữ viết tắt bp Base pair (cặp base) Mbp Mega base pair DNA Deoxyribonucleic Acid et al et alii et aliae FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) gyrB gyrase B rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid sp Species ssp Subspecies STR4 Subtropical race (Chủng cận nhiệt đới 4) TR4 Tropical rase (Chủng nhiệt đới 4) USD United States dollar (đồng la Mỹ) viii TĨM TẮT Đối tượng đề tài nghiên cứu đặc điểm sinh học định danh chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh panama chuối Ba mươi chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập Phương pháp đồng nuôi cấy sử dụng để sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ (VNUA23) tuyển chọn để nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, chuỗi sinh bào tử Sau chủng xạ khuẩn đánh giá số đặc điểm sinh hóa khả sử dụng nguồn cacbon, sinh sắc tố melanin, sinh trưởng điều kiện môi trường nuôi cấy khác Chủng xạ khuẩn tiếp tục tách chiết DNA tổng số, chạy chuỗi phản ứng (PCR) trình tự gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F 1492R, sau đem giải trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Dựa đặc điểm hình thái, sinh hóa trình tự gen 16S rRNA, chủng xạ khuẩn VNUA23 có hoạt tính đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh panama chuối thuộc chi Streptomyces có mối quan hệ họ hàng gần gũi với loài Streptomyces diastatochromogenes ix mềm MEGA X Đây phương pháp xây dựng phát sinh loài dựa phân tích ký tự, khơng đưa chiều dài nhánh mà đưa trật nhánh giá trị boostrap tương ứng Kết phân tích thể hình sau (hình 4.11) Hình 4.11 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gen 16S rRNA Cây phát sinh chủng loại hình thành nhánh thể mối quan hệ loài với nhau, nút thể giá trị bootstrap tương ứng Phân lập xạ khuẩn đối kháng tiềm VNUA23 hình thành nhánh với chủng Streptomyces diastatochromogenes (KJ145874.1) với giá trị bootstrap tương ứng 98 Giá trị bootstrap lớn 70% số lần lặp lại coi có giá trị thống kê cao 95% Do đó, giá trị boostrap 98 nằm khoảng tin cậy Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa phân tích dựa giải trình tự gen 16S rRNA, nhận thấy chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm VNUA23 thuộc chi Streptomyces có nhiều đặc điểm tương đồng với chủng Streptomyces diastatochromogenes (KJ145874.1) Xét độ tin cậy mức độ tương đồng hai chủng coi giống nhau, nhiên 43 giá trị chưa đủ cao có sai khác số đặc điểm sinh học Do đó, chủng xạ khuẩn đối kháng với nấm Foc gây bệnh panama chuối có mối quan hệ họ hàng gần gũi với loài Streptomyces diastatochromogenes 44 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận − Đã sàng lọc 11 chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm Foc gây bệnh panama chuối số 30 chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất thôn Tân Trù, xã Xuân Liên, huyện Nghi Xuân, tỉnh Hà Tĩnh − Đã tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm VNUA23 với hiệu lực ức chế lên tới 47% − Dựa vào đặc điểm hình thái, hóa sinh so sánh vùng trình tự gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn VNUA23 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Streptomyces diastatochromogenes 5.2 Kiến nghị − Nghiên cứu loại môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nồng độ muối…) ảnh hưởng tới hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn − Đánh giá khả sinh siderophores, sinh enzyme ngoại bào amylase, protease, lipase, chitinase, pectinase − Đánh giá ảnh hưởng xạ khuẩn đối kháng tới hình thái sợi nấm nảy mầm bào tử nấm − Sàng lọc thứ cấp chất chuyển hóa kháng nấm − Đánh giá ổn định hoạt tính dịch chiết xạ khuẩn tác động điều kiện môi trường khác − Đánh giá hiệu kiểm soát sinh học in vivo chủng xạ khuẩn chống lại nấm Foc (R05) 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Andrew Chen, Jiaman Sun, Andrea Matthews, Liz Armas-Egas, Ning Chen, Sharon Hamill, Sharl Mintoff, Lucy T.T Tran-Nguyen, Jaqueline Batley and Elizabeth A.B Aitken (2019) Assessing Variations in Host Resistance to Fusarium oxysporum f sp cubense Race in Musa Species, With a Focus on the Subtropical Race Frontier in Microbiology Vol 10 (1062) Ann M Hirsch, Maria Valdés (2010) Micromonospora: An important microbe for biomedicine and potentially for biocontrol and biofuels Soil Biology & Biochemistry Vol 42 pp 536-542 Antonino Malacrinó, Kim Hian Seng, Chanratha An, Socheath Ong, Megan E O’Rourke (2019) Integrated pest management for yard-long bean (Vigna unguiculata subsp Sesquipedalis) in Cambodia Crop Protection Baltz R.H (2010) Genomics and the ancient origins of the daptomycin biosynthetic gene cluster The Journal of Antibiotics Vol 63 pp 506 –511 Britschgi T.B., & Giovannoni S.J (1991) Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing Applied and Environmental Microbiology Vol 57 pp 17071713 Buddenhagen I (2009) Understanding strain diversity in Fusarium oxysporum f sp cubense and history of introduction of “Tropical race 4” to better manage banana production Acta horticulturae Vol 828 pp 193–204 Butler M.S., Hansford K.A., Blaskovich M.A., Halai R., Cooper M.A 2014 Glycopeptide antibiotics: back to the future The Journal of Antibiotics Vol 67 pp 631–644 Chen X., Zheng Y., Shen Y (2008) Bioassay method for the quantitative determination of tautomycin in the fermentation broth with Sclerotinia clerotiorum J Rapid Methods Autom Microbiol Vol 16 pp 199–209 46 Dhanasekaran D., Thajuddin N., Panneerselvam A (2012) Applications of actinobacterial fungicides in agriculture and medicine Fungic Plant Anim Vol pp 29–54 10 Dhanasekaran Dharumadurai, Nooruddin Thajuddin and Panneerselvam Annamalai (2012) Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine ResearchGate Vol pp 29-54 11 FAO (2019) Banana Market Review Preliminary Results for 2019 Retrieved on 28 February 2021 at: http://www.fao.org/economic/est/estcommodities/bananas/en/ 12 Girard G., Willemse J., Zhu H., Claessen D., Bukarasam K., Goodfellow M., van Wezel G.P (2014) Analysis of novel kitasatosporae reveals significant evolutionary changes in conserved developmental genes between Kitasatospora and Streptomyces Antonie Van Leeuwenhoek Vol 106 pp 365– 380 13 Ilic S.B., Konstantinovic S.S., Todorovic Z.B., Lazic M.L., Veljkovic V.B., Jokovic N., and Radovanovic B.C (2007) Characterization and antimicrobial activity of the bioactive metabolites in streptomycete isolates Mikrobiologiia Vol 76 pp.480 – 487 14 Jodi Woan-Fei Law, Hooi-Leng Ser, Tahir M Khan, Lay-Hong Chuah, Priyia Pusparajah, Kok-Gan Chan, Bey-Hing Goh and Learn-Han Lee (2017) The Potential of Streptomyces as Biocontrol Agents against the Rice Blast Fungus, Magnaporthe oryzae (Pyricularia oryzae) Frontier in Microbiology Vol (3) 15 Kang Q., Shen Y., Bai L (2012) Biosynthesis of 3,5-AHBA-derived natural products Vol 29 pp 243–263 16 Kharel M K., Pahari P., Shepherd M D., Tibrewal N., Nybo S E., Shaaban K.A., & Rohr J (2012) Angucyclines: Biosynthesis, mode-ofaction, new natural products, and synthesis Vol 29 (2) pp 264–325 47 17 Maldonado L.A., Stach J.E.M., Pathom-aree W., Ward A.C., Bull A.T., & Goodfellow M (2005) Diversity of cultivable actinobacteria in geographically widespread marine sediments Antonie van Leeuwenhoek Vol 87(1) pp 11–18 18 Maryani N., Lombard L., Poerba Y.S., Subandiyah S., Crous P.W., and Kema G.H.J (2019) Phylogeny and genetic diversity of the banana Fusarium wilt pathogen Fusarium oxysporum f sp cubense in the Indonesian centre of origin Studies in mycology Vol 92 pp 155–194 19 Mohamed E Zain (2011) Impact of mycotoxins on humans and animals Journal of Saudi Chemical Society Vol 15 (2) pp 129–144 20 Mongkutkarn Udompongsuk and Kasem Soytong (2016) Isolation, Identification, and Pathogenicity Test from Fusarium oxysporum f.sp cubense Causing Banana Wilt International Journal of Agricultural Technology Vol 12(7.2) pp 2181-2185 21 Omura S., Crump A (2014) Ivermectin: panacea for resource-poor communities? Trends in Parasitol Vol 30 (9) pp 445–455 22 Pal K.K and B McSpadden Gardener (2006) Biological Control of Plant Pathogens The Plant Health Instructor Vol pp 1117–1142 23 Panchanathan Manivasagan, Jayachandran Venkatesan, Kannan Sivakumar, Se-Kwon Kim (2013) Marine actinobacterial metabolites: Current status and future perspectives Microbiological Research Vol 168 (6) pp 311–332 24 Pérez-Vicente L., Dita A.M and Martínez E., (2014) Technical Manual Prevention and diagnostic of Fusarium Wilt (Panama disease) of banana caused by Fusarium oxysporum f sp cubense Tropical Race (TR4) Food and agriculture organization of the united nations 48 25 Pridham T.G and David Gottlieb (1948) The utilization of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for species determination Vol 56 pp 107-114 26 Rahman M.A., Begum M.F and Alam M.F (2009) Screening of Trichoderma Isolates as a Biological Control Agent Against Ceratocystis paradoxa Causing Pineapple Disease of Sugarcane Mycobiology Vol 37(4) pp 277-285 27 Rahman M.A., Islam M.Z and Islam M.A (2011) Antibacterial activities of Actinomycete isolates collected from soils of Rajshahi, Bangladesh Biotechnol Res Int Vol 2011 (857925) pp 1-6 28 Ralph Kirby (2011) Chromosome diversity and similarity within the Actinomycetales FEMS Microbiology Letters Vol 319 (1) pp 1–10 29 Shirling E.B., Gottlieb D (1966) Methods for characterization of Streptomyces species Int J Syst Bacteriol Vol 16 pp 313-40 30 Someya N Biological control of fungal plant diseases using antagonistic bacteria J Gen Plant Pathol 2008;74:459–60 31 Van Dissel D., Claessen D., & van Wezel, G P (2014) Morphogenesis of Streptomyces in Submerged Cultures Advances in Applied Microbiology Vol 89 pp 1–45 32 Ventura M., Canchaya C., Fitzgerald G F., Gupta R S., & Van Sinderen D (2007) Genomics as a means to understand bacterial phylogeny and ecological adaptation: the case of bifidobacteria Antonie van Leeuwenhoek Vol 91 (4) pp 351–372 33 Ventura M., Canchaya C., Fitzgerald G.F., Gupta R.S., & Van Sinderen D (2006) Genomics as a means to understand bacterial phylogeny and ecological adaptation: the case of bifidobacteria Antonie van Leeuwenhoek Vol 91 (4) pp 351–372 49 34 Wolfgang Ludwig, Jean Euzéby, Peter Schumann, Hans-Jürgen Busse, Martha E Trujillo, Peter Kämpfer, & William B Whitman (2015) Road map of the phylum Actinobacteria Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria pp 1–37 35 Xiao-Yang Zhi, Wen-Jun Li and Erko Stackebrandt (2009) An update of the structure and 16S rRNA gene sequence-based definition of higher ranks of the class Actinobacteria, with the proposal of two new suborders and four new families and emended descriptions of the existing higher taxa International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology Vol 59 pp 589–608 36 Yeon Ju Kim, Jae-heon Kim and Jae-Young Rho (2019) Antifungal Activities of Streptomyces blastmyceticus Strain 12-6 Against Plant Pathogenic Fungi Mycobiology Vol 47 (3) pp 329–334 50 PHỤ LỤC Phụ lục Các phân lập xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất D1 D2 VNUA29 VNUA28 VNUA15 VNUA27 VNUA44 VNUA49 VNUA22 VNUA26 VNUA33 VNUA11 VNUA48 VNUA36 51 VNUA6 VNUA31 VNUA5 VNUA37 VNUA2 VNUA23 VNUA30 VNUA34 VNUA38 VNUA9 VNUA32 VNUA50 52 VNUA25 VNUA35 VNUA20 VNUA41 VNUA16 VNUA24 53 Phụ lục Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn sau ngày cấy nấm VNUA5 VNUA27 VNUA48 VNUA2 VNUA24 VNUA30 VNUA25 VNUA38 VNUA23 VNUA20 VNUA33 54 Phụ lục Khả đồng hóa nguồn đường chủng xạ khuẩn VNUA23 Fructose D – mannitol D – galactose Cellulose Rhamnose D – ribose D – xylose Glycerol Maltose 55 Phụ lục Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn VNUA23 pH pH pH pH pH pH pH 10 pH 11 pH 12 56 Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ muối (NaCl) tới khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn VNUA23 NaCl 0% NaCl 1% NaCl 2% NaCl 3% NaCl 4% NaCl 5% NaCl 6% NaCl 7% 57