Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh một số chủng nấm phân lập trên mẫu chuối bị bệnh thu thập tại tỉnh hà tĩnh và vĩnh phúc (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM PHÂN LẬP TRÊN MẪU CHUỐI BỊ BỆNH THU THẬP TẠI TỈNH HÀ TĨNH VÀ VĨNH PHÚC” Sinh viên thực : HỒ THỊ KHUYÊN Lớp : CNSHB – K62 Mã SV : 620503 Người hướng dẫn : PGS TS NGUYỄN XUÂN CẢNH TS PHẠM HỒNG HIỂN Bộ môn : Công nghệ vi sinh HÀ NỘI, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng cơng bố Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 24 tháng 03 năm 2021 Sinh viên Hồ Thị Khuyên i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp Bộ môn Công nghệ vi sinh, giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy giáo, cán phịng thí nghiệm Bộ môn với cố gắng nỗ lực học tập thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc Học viện, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học tồn thể thầy cô giáo truyền đạt cho kiến thức vơ bổ ích q báu suốt thời gian học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh – Phó khoa Cơng nghệ sinh học định hướng đề tài tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi nhiệt tình suốt tháng làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô ThS Trần Thị Đào, chị Nguyễn Thị Thu, toàn thể anh, chị, bạn bè em thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt trình làm đề tài tốt nghiệp Và cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân ni nấng, động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 03 năm 2021 Sinh viên Hồ Thị Khuyên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KẾT QUẢ x PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu đề tài 1.2.2 Nội dung nghiên cứu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình trồng chuối giới Việt Nam 2.2 Bệnh chuối vi khuẩn gây 2.2.1 Ralstonia solanacearum gây bệnh Moko Bugtok 2.2.2 Ralstonia syzygii Subsp Celebesensis gây bệnh máu chuối 2.2.3 Dickeya paradisiaca gây thối mô phân sinh thân rễ 2.2.4 Bệnh héo rũ thân chuối Xanthomonas campestris pv Musacearum gây ………………………………………………………………………… 2.3 Bệnh chuối Virus gây 10 2.3.1 Bệnh lùn sọc chuối Banana Streak Virus gây 10 2.3.2 Bệnh chùn đọt chuối Banana Bunchy Top Virus gây 11 2.4 Bệnh chuối nấm gây 12 2.4.1 Tổng quan bệnh héo Panama Fusarium oxysporum f sp cubense gây ………………………………………………………………………….12 2.4.2 Tổng quan bệnh thán thư Colletotrichum musae gây 19 2.4.3 Tổng quan bệnh đốm Sigatoka 25 iii PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 3.1 Đối tượng nghiên cứu 27 3.2 Vật liệu nghiên cứu 27 3.2.1 Các mẫu bệnh 27 3.2.2 Mẫu chuối dùng để tái lây nhiễm 27 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 3.4 Các hóa chất môi trường sử dụng để phân lập phân tích đặc điểm nấm gây bệnh chuối 27 3.5 Nội dung nghiên cứu 30 3.6 Phương pháp nghiên cứu 30 3.6.1 Phương pháp thu thập mẫu 30 3.6.2 Phương pháp phân lập mẫu chuối bị bệnh 30 3.6.3 Phương pháp làm 31 3.6.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái bào tử nấm ………………………………………………………………………….31 3.6.5 Phương pháp giữ giống 32 3.6.6 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 32 3.6.7 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch 33 3.6.8 Phương pháp tách chiết DNA 34 3.6.9 Phương pháp chạy điện di gel Agarose 35 3.6.10.Kỹ thuật PCR 35 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết thu thập mẫu chuối bệnh tỉnh Hà Tĩnh tỉnh Vĩnh phúc ………………………………………………………………………….37 4.2 Kết phân lập chủng nấm gây bệnh chuối 39 4.2.1 Kết phân lập 39 4.2.2 Kết tái lây nhiễm 39 a Kết tái lây nhiễm phương pháp tưới dung dịch nấm 39 b Kết tái lây nhiễm 42 iv 4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học 07 chủng nấm 43 4.3.1 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu bị bệnh héo rũ Panama 43 4.3.1.1 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm R05 43 4.3.1.2 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm HT39 44 4.3.1.3 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm L05n 46 4.3.1.4 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm TG1t 47 4.3.1.5 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm VP1(2) 49 4.3.1.6 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm VP1(5) 50 4.3.1.7 Đặc điểm hình thái tản nấm, hình thái sợi nấm, hình thái bào tử nấm phân lập từ mẫu nấm VP2(6) 52 4.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 54 4.3.3 Đánh giá khả sinh trưởng chủng nấm tuyển chọn môi trường PDA 57 4.3.4 Khả sinh emzyme ngoại bào 58 4.3.5 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển chủng nấm ………………………………………………………………………….61 4.4 Định danh chủng nấm phương pháp sinh học phân tử 63 4.4.1 Tách chiết DNA chủng nấm 63 4.4.2 Kết trình PCR 63 4.4.3 Xây dựng phân loại 64 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 5.1 Kết luận 66 5.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 v PHỤ LỤC 76 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết thu thập mẫu chuối nghi bị bệnh héo rũ Panama, thán thư đốm tỉnh Hà Tĩnh Vĩnh Phúc 38 Bảng 4.2 Kết tái lây nhiễm nấm chuối tiêu hồng 40 Bảng 4.3 Đặc điểm chung hình thái bào tử chủng nấm môi trường PDA, pH=6.0, nhiệt độ nuôi cấy 30ºC 54 Bảng 4.4 Đặc điểm chủng nấm nuôi loại môi trường khác sau ngày, nuôi cấy 30ºC 55 Bảng 4.5 Khả sinh trưởng chủng nấm tuyển chọn môi trường PDA 58 Bảng 4.6 Khả sinh enzyme ngoại bào 07 chủng nấm 59 Bảng 4.7 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sợi nấm môi trường PDA 61 vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Hình ảnh mẫu chuối bị bệnh thu thập từ tỉnh Hà Tĩnh 37 Hình 4.2 Hình ảnh mẫu thân giả rễ chuối bị bệnh thu thập tỉnh Vĩnh Phúc 38 Hình 4.3 Kết tái lây nhiễm sau 30 ngày 41 Hình 4.4 Kết tái lây nhiễm chủng nấm 42 Hình 4.5 Hình thái chủng nấm R05 44 Hình 4.6 Hình thái chủng nấm HT39 45 Hình 4.7 Hình thái chủng nấm L05n 47 Hình 4.8 Hình thái chủng nấm TG1t 48 Hình 4.9 Hình thái chủng nấm VP1(2) 50 Hình 4.10 Hình thái chủng nấm VP1(5) 51 Hình 4.11 Hình thái sợi nấm VP2(6) 53 Hình 4.12 Sự sinh trưởng chủng nấm VP1(5) loại môi trường khác sau ngày 57 Hình 4.13 Khả sinh enzyme Cellulase Chitinase 07 chủng nấm 60 Hình 4.14 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng nấm R05 62 Hình 4.15 Kết điện di DNA tổng số chủng nấm 63 Hình 4.16 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi ITS1/ITS4 gel Agarose 1,5% 63 Hình 4.17 Cây phân loại chủng nấm VP1(5) 64 Hình 4.18 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi Foc TR-F/ Foc TR-R gel Agarose 1.5% 65 viii DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ BBTV Banana bunchy top virus C musae Colletotrichum musae CS Cộng ĐC Đối chứng ĐVT Đơn vị tính Foc Fusarium oxysporum f sp cubense Ha Hecta M emusae Mycosphaerella emusae M fijensis Mycosphaerella fijensis M musicola Mycosphaerella musicola P fijensis Pseudocercospora fijensis PDA Potato Dextrose Agar STR4 Chủng cận nhiệt đới TR4 Chủng nhiệt đới WA Water Agar Xcm Xanthomonas campestris pv Musacearum ix plantain and enset production in central and east Africa over the past decade Mol Plant Pathol 19(3): 525-536 64.Wardlaw C W (1972) Banana Diseases Including Plantain and Abaca Harlow: Longman; 878 65.WU Kai-li, CHEN Wei-zhong, YANG Shuai, WEN Ya, ZHENG Yu-ru, Wilfred Mabeche Anjago, YUN Ying-zi, WANG Zong-hua (2019) Isolate and identification of Fusarium oxysporum f.sp cubense in Fujian Province, China Jourmal of Integrative Agriculture, 2019, 18(8): 19051913 66.Xian Dong, Min Wang, Ning Ling, Qirong Shen and Shiwei Guo (2016) Effects of iron and boron combinations on the suppression of Fusarium wilt in banana Published online 67.Yaouba Aoudou and Mpounze Essoua Gaelle Phalone (2017) Isolation and Pathogenicity Evaluation of Postharvest Fungal of Some Fruits in Cameroon International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology (IJEAB), pp 56-60 68.Ying-Hong Lin1, Yi-Jia Lin, Tsai-De Chang, Li-Ling Hong, Tzu-Yu Chen, Pi-Fang Linda Chang (2016) Development of a TaqMan ProbeBased Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (iiPCR) Assay for Detection of Fusarium oxysporum f sp cubense Race Plos one 75 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh hình thái chủng nấm phân lập TG1t VP1(5) VP2(6) R05 HT39 VP1(2) VP1 VP1(1) VP1(3) VP3(1) VP3(2) VP8(2) 76 HK08T HK47 T05 MN20 TG1c L03 L05đ R02 L05n TT10 L03c TC1m 77 • Hình thái tản nấm chủng nấm phân lập STT Tên chủng Triệu chứng bệnh Hình thái, màu sắc tản nấm HK08t Mẫu nấm Tản nấm trịn, có màu xanh đen phân lập từ bị màu trắng xum quang bệnh đốm Hà viền bên ngồi Sợi nấm xốp, bơng Tĩnh T05 Mẫu ít, ăn sát bề mặt mơi trường nấm Tản nấm trịn, có màu nâu phân lập từ bị màu trắng viền xum quang, sợi bệnh đốm Hà nấm bông, xốp Tĩnh MN20 Mẫu nấm Tản nấm trịn, có vịng đồng tâm, phân lập từ bị màu cam, sợi nấm bông, thưa bệnh thán thư Hà Tĩnh HK47 Mẫu nấm Tản nấm tròn, có vịng đồng tâm, phân lập từ bị màu cam nhạt chuyển sang màu bệnh thán thư Hà đen già, sợi nấm bông, thưa Tĩnh TT10 Mẫu nấm Tản nấm trịn, màu trắng, có vòng phân lập từ bị đồng tâm, sợi nấm bông, thưa bệnh thán thư Hà Tĩnh TG1c Mẫu nấm Tản nấm trịn, màu cam, có hạt phân lập từ thân nhỏ bề mặt, sợi nấm thưa mọc giả bị bệnh thán sát bề mặt môi trường thư Hà Tĩnh HT39 Mẫu nấm Tản nấm trịn, màu tím giữa, 78 phân lập từ thân củ trắng xum quang, sợi nấm bị bệnh héo vàng mịn, dày, tiết sắc tố màu vàng Hà Tĩnh L03 Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu cam nhạt, sợi phân lập từ bị nấm bông, mịn bệnh héo vàng Hà Tĩnh L03c Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu cam giữa, phân lập từ bị xum quanh viền màu trắng, sợi nấm bệnh héo vàng vừa, dày Hà Tĩnh 10 L05đ Mẫu nấm Tản nấm trịn, có vịng đồng tâm, phân lập từ bị màu trắng bên màu cam bệnh héo vàng đậm giữa, sợi nấm bông, mịn Hà Tĩnh 11 L05n Mẫu nấm Tản nấm tròn, có màu trắng đơi phân lập từ bị có chút ánh tím, sợi nấm bệnh héo vàng bông, mịn Hà Tĩnh 12 R02 Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, mặt phân lập từ rễ bị đĩa màu vàng, sợi nấm bông, mịn bệnh héo vàng Hà Tĩnh 13 R05 Mẫu nấm Tản nấm trịn, màu tím, sợi nấm phân lập từ rễ bị bông, mịn bệnh héo vàng Hà Tĩnh 79 14 TG1t Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, sinh sắc phân lập từ thân tố màu tím giữa, sợi nấm bơng, giả bị bệnh héo dày vàng Hà Tĩnh 15 TC1m Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, phân lập từ thân củ màu vàng, sợi nấm bông, mịn bị bệnh héo vàng Hà Tĩnh 16 VP1 Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, sợi nấm phân lập từ thân bông, mịn giả chuối tiêu bị bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 17 VP1(1) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, phân lập từ thân vàng, sợi nấm bông, dày giả chuối tiêu bị bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 18 VP1(2) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, sợi nấm phân lập từ thân bông, mịn giả chuối tiêu bị bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 19 VP1(3) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, vàng phân lập từ thân giữa, sợi nấm bơng ít, dày giả chuối tiêu bị bệnh héo vàng 80 Vĩnh Phúc 20 VP1(5) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, sợi nấm phân lập từ thân bông, mịn giả chuối tiêu bị bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 21 VP2(6) Mẫu nấm Tản nấm trịn, màu tím, mặt phân lập từ thân đĩa màu vàng nhạt, sợi nấm bông, giả chuối tây bị dày bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 22 VP3(1) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng ngả phân lập từ thân vàng, có vịng trịn đồng tâm sợi giả chuối tây bị nấm bông, dày bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 23 VP3(2) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, sợi nấm phân lập từ thân bông, thưa giả chuối tây bị bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 24 VP8(2) Mẫu nấm Tản nấm tròn, màu trắng, sợi nấm phân lập từ thân mịn giả chuối tiêu bị bệnh héo vàng Vĩnh Phúc 81 Phụ lục 2: Kết tái lây nhiễm phương pháp tưới dung dịch nấm sau 60 ngày 82 Phụ lục 3: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khác tới sinh trưởng nấm A B C D Chủng nấm L05n A B C Chủng nấm TG1t 83 D A C B D Chủng nấm VP1(2) A B C D Chủng nấm HT39 84 A B C D Chủng nấm VP2(6) A C B D Chủng nấm R05 Kí hiệu: A: Môi trường PDA; B: Môi trường SDA; C: Môi trường Czapek; D: Môi trường WA 85 Phụ lục 4: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sợi nấm môi trường PDA pH4 pH6 pH5 pH7 Chủng nấm L05n 86 pH8 Phụ lục 5: Cây phân loại chủng nấm đại diện 99% 99% Fusarium oxysporum isolate A2S3-D1 Fusarium equiseti strain UMAS MS25 100% Fusarium oxysporum f sp lentis isolate FLS58 100% Fusarium sp isolate JP39B-1X 100% Fusarium sp isolate ALO-IIHR L05n Fusarium oxysporum isolate EEF1 Fusarium oxysporum isolate NJ3256 99% Fusarium oxysporum culture MUTITA :3720 99% Fusarium oxysporum isolate MR4003 99% 99% Fusarium oxysporum isolate IS3488 Cây phân loại chủng nấm L05n 100% 100% Fusarium oxysporum clone SF 53 Fusarium sp ZH80 100% Fusarium oxysporum isolate 370 100% Fusarium oxysporum isolate ASF-186 100% Fusarium oxysporum isolate ASF-187 100% Fusarium oxysporum isolate HBS4 Fusarium oxysporum f sp cubense race strain B2 95% Fusarium oxysporum strain XGJKWJ4 Fusarium oxysporum f cubense 100% Fusarium oxysporum f cubense isolate F-py-08 92% VP1(2) Cây phân loại chủng nấm VP1(2) 87 Fusarium oxysporum genomic DNA isolate CIB 17 95% 100% Fusarium oxysporum isolate YBC01 100% Fusarium oxysporum isolate MM3-EGY Fusarium oxysporum isolate ANP19 99% 100% Fusarium oxysporum strain sharmi12 100% Fusarium oxysporum isolate MR4003 99% Fusarium oxysporum culture MUTITA :3720 99% Fusarium oxysporum isolate EEF1 100% Fusarium oxysporum isolate F21 TG1t Fusarium oxysporum genomic DNA isolate DBT-99 Cây phân loại chủng nấm TG1t 93% 94% 94% Fusarium oxysporum isolate Curi3.3 Fusarium oxysporum isolate Fo0101 Fusarium oxysporum isolate Be8.3 95% Fusarium oxysporum strain S81 94% Fusarium oxysporum strain LD200416 94% Fusarium oxysporum isolate CSB F282 88% Fusarium sp FOC7 92% Fusarium oxysporum isolate R13 43 89% Fusarium oxysporum f sp cubense R05 Fusarium oxysporum isolate Fo2711 Cây phân loại chủng nấm R05 88 Fusarium oxysporum isolate POZ125 92% 92% Fusarium oxysporum strain MF22393 92% Fusarium oxysporum strain YQ1 92% Fusarium oxysporum strain HHNDZ02 92% Fusarium oxysporum strain F345 92% Fusarium oxysporum f sp cubense isolate NP2 92% Fusarium oxysporum f sp cubense 92% Fusarium oxysporum strain S81 100% Fusarium oxysporum strain IHB F 1637 VP2(6) Fusarium oxysporum isolate EEF1 Cây phân loại chủng nấm VP2(6) Fusarium solani isolate S-0900 97% 98% Fusarium solani strain PWQ2162 98% Fusarium solani strain FS-2 98% Fusarium solani strain endophytic fungi 98% Fusarium solani isolate 215 94% Fusarium solani strain KUYZ001B-2-1 Fusarium solani strain BJ25.1 100% 91% Fusarium solani strain LZ070001 Fusarium solani strain AVARP19 94% Fusarium solani strain KFS 18S HT39 Cây phân loại chủng nấm HT39 89