Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh một số chủng nấm phân lập trên mẫu chuối bị bệnh thu thập tại tỉnh hải dương và hà nội (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM PHÂN LẬP TRÊN MẪU CHUỐI BỊ BỆNH THU THẬP TẠI TỈNH HẢI DƢƠNG VÀ HÀ NỘI” Sinh viên thực : Bùi Ngọc Phƣợng Lớp : K62-CNSHA Giảng viên hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh : TS Phạm Hồng Hiển Bộ môn : Công nghệ vi sinh HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cám ơn thơng tin trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Bùi Ngọc Phƣợng i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, Ban chủ nhiệm Khoa, thầy giáo tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Trong suốt q trình thực đề tài tốt nghiệp, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, Cô Trần Thị Đào Chị Nguyễn Thị Thu tận tình, chu đáo, bảo hƣớng dẫn tơi hồn thành đề tài cách tốt Tôi chân thành cảm ơn góp ý dạy bảo nhiệt tình thầy cô Bộ môn Công nghệ vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam giúp tơi có định hƣớng đắn việc thực đề tài Đồng thời, tơi xin cảm ơn toàn thể bạn thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, với tất lịng thành kính biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi nấng, động viên tạo động lực cho suốt trình học tập nghiên cứu Mặc dù cố gắng để hồn thành Khóa luận tốt nghiệp cách hoàn chỉnh Tuy nhiên, số hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm thực tế nên tơi khơng thể tránh khỏi thiếu sót định mà thân chƣa thấy đƣợc Tôi mong đƣợc đóng góp ý kiến quý Thầy, Cơ giáo để khóa luận đƣợc hồn chỉnh Tơi xin chân thành cám ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Bùi Ngọc Phƣợng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT x PHẦN I MỞ ĐẦU 11 1.1 Đặt vấn đề 11 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài: 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tế đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tế PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình sản xuất chuối giới Việt Nam 2.2 Các bệnh thƣờng gặp chuối vi khuẩn gây 2.2.1 Bệnh nốt đen (leaf freckl) 2.2.2 Bệnh sọc nhỏ (Leaf speckle) 2.2.3 Bệnh đốm tròn (Cordana leaf spot) 2.3 Các bệnh thƣờng gặp chuối virus gây 2.3.1 Bệnh chùn đọt (Bunchy top virus) 2.3.2 Bệnh khảm (Cucumber Mosai Vius) 2.3.3 Bệnh sọc chuối (CSV) 11 2.4 Các bệnh thƣờng gặp chuối nấm gây 12 2.4.1 Bệnh héo rũ Panama (FOC) 11 2.4.2 Bệnh đốm hay bệnh cháy 14 2.4.3 Bệnh thán thƣ nấm Colletotrichum sp gây 16 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 iii 3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 3.1.2 Địa điểm thời gian thực 19 3.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 19 3.3 Môi trƣờng nuôi cấy 19 3.4 Nội dung nghiên cứu 19 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 3.5.1 Phƣơng pháp thu nhận mẫu 20 3.5.2 Phƣơng pháp phân lập 20 3.5.3 Phƣơng pháp làm 20 3.5.4 Phƣơng pháp giữ giống 21 3.6 Xác định đặc điểm hình thái học 21 3.6.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc thạch 21 3.6.2 Quan sát đặc điểm vi học 21 3.6.3 Phƣơng pháp nuôi cấy lỏng 22 3.7 Phƣơng pháp tách chiết DNA nấm 22 3.8 Kỹ thuật PCR 23 3.9 Kỹ thuật điện di DNA gel agarose 23 3.9.1 Đổ gel agarose 1% 23 3.9.2 Chạy điện di 24 3.9.3 Chụp ảnh 24 3.10 Giải trình tự vùng ITS - rDNA 24 3.11 Phân tích số liệu 24 3.12 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh trƣởng chủng nấm 25 3.13 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến môi trƣờng đến khả sinh trƣởng chủng nấm 25 3.14 Khảo sát ảnh hƣởng dinh dƣỡng môi trƣờng đến khả sinh trƣởng chủng nấm 25 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 iv 4.1 Kết thu mẫu: 26 4.2 Phân lập chủng nấm gây bệnh chuối 27 4.2.1 Kết phân lập 27 4.2.2 Kết tái lây nhiễm nhân tạo chủng nấm phân lập đƣợc 28 4.3 Một số đặc điểm sinh học chủng nấm HD01 ML02.2 32 4.3.1 Đặc điểm hình thái 32 4.3.2 Đặc điểm sinh lí sinh hóa hai chủng nấm HD01 ML02.2 36 4.4 Kết định danh 45 4.4.1 Kết điện di tổng số 45 4.4.2 Kết phản ứng PCR để giải trình tự vùng gen ITS định danh chủng nấm gây bệnh chuối 46 4.4.3 Xây dựng giản đồ phát sinh loài 50 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết phân lập nấm từ mẫu bệnh thu đƣợc 27 Bảng 4.2 Thông tin mẫu đƣợc tiến hành nghiên cứu 28 Bảng 4.3 Kết tái lây nhiễm chủng nấm HD01 ML02.2 31 Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái tản nấm chủng nấm HD01 ML02.2 33 Bảng 4.5 Đặc điểm vi học chủng nấm HD01 ML02.2 36 Bảng 4.6 Kết theo dõi ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng nấm sau ngày nuôi cấy 37 Bảng 4.7 Kết theo dõi ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng chủng nấm sau ngày nuôi cấy 41 Bảng 4.8 Kết theo dõi ảnh hƣởng chất dinh dƣỡng đến sinh trƣởng chủng nấm sau ngày nuôi cấy 43 Bảng 4.9 Mối tƣơng quan di truyền dòng nấm phân lập với dòng nấm có ngân hàng Gen (NCBI) dựa vào trình tự ITS 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bệnh nốt đen chuối vi khuẩn Phyllosticta Musarum Hình 2.2 Bệnh sọc nhỏ vi khuẩn Acrodontium simlex (Maugenot) De Hoog Hình 2.3 Bệnh đốm trịn vi khuẩn Cordana Murae Hình 2.4 Bệnh chùn đọt chuối Bunchy top virus gây Hình 2.5 Bệnh khảm virus Cucumber Mosai gây nên Hình 2.6 Cây chuối bị bệnh héo rũ (héo vàng) nấm FOC 12 Hình 2.7 Các dạng bào tử nấm Fusarium oxyporum 12 Hình 2.8 Biểu đặc trƣng bệnh Sigatoka vàng 14 Hình 2.9 Biểu đặc trƣng bệnh Sigatoka đen 14 Hình 2.10 Khuẩn lạc nấm Colletotrichum 17 Hình 4.1 Một số hình ảnh mẫu lá, thân chuối bị bệnh đƣợc thu thập tỉnh Hải Dƣơng Mê Linh, Hà Nội 27 Hình 4.2 Kết tái lây nhiễm chủng HD01 29 Hình 4.3 Kết tái lây nhiễm chủng ML02.2 31 Hình 4.4 Kết sau ngày tái lây nhiễm chuối tiêu 32 Hình 4.5 Đặc điểm hình thái đặc điểm vi học chủng nấm HD01 34 Hình 4.6 Đặc điểm hình thái đặc điểm vi học chủng nấm MNL02.2 36 Hình 4.7 Biều đồ thể ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 ML02.2 37 Hình 4.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 sau ngày nuôi cấy 38 Hình 4.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm ML02.2 sau ngày nuôi cấy 39 Hình 4.10 Biểu đồ thể ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 ML02.2 40 Hình 4.11 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 sau ngày nuôi cấy 41 vii Hình 4.12 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm ML02.2 sau ngày nuôi cấy 42 Hình 4.13 Biểu đồ thể ảnh hƣởng dinh dƣỡng môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 ML02.2 43 Hình 4.14 Ảnh hƣởng dinh dƣỡng mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 sau ngày nuôi cấy 44 Hình 4.15 Ảnh hƣởng dinh dƣỡng mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm ML02.2 sau ngày nuôi cấy 45 Hình 4.16 Kết điện di DNA tổng số chủng nấm 46 Hình 4.17 Sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ DNA số dòng nấm với mồi ITS gel Agarose 1% 46 Hình 4.18 Cây phân loại chủng nấm HD01 gây bệnh chuối đƣợc phân tích ITS1 ITS4 49 Hình 4.19 Cây phân loại chủng nấm ML02.2 gây bệnh chuối đƣợc phân tích ITS1 ITS4 49 viii DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt PDA PDB FAO DNA RNA WA SDA CGA PCR Giải nghĩa Potato Dextrose Agar Potato Dextrose Food and Agriculture Organization Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid Water Agar Sabouraud Dextrose Agar Carot glucose agar Polymerase Chain Reaction ix Bảng 4.7 Kết theo dõi ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng chủng nấm sau ngày nuôi cấy Đƣờng kính tản nấm (cm) pH Sau ngày ni Sau ngày nuôi Sau ngày nuôi HD01 ML02.2 HD01 ML02.2 ±0.1 1.5±0.1 ±0.1 2.7±0.1 ±0.1 4.6±0.1 2.1±0.1 4.2±0.1 3.2±0.1 6.8±0.1 5.7±0.1 8.7±0.1 3.4±0.1 4.7±0.1 4.6±0.1 7.3±0.1 8.2±0.1 10.0±0.1 3.2±0.1 3.7±0.1 4±0.1 6.9±0.1 8.3±0.1 8.2±0.1 1.2±0.1 1.8±0.1 2.2±0.1 2.3±0.1 3.4±0.1 3.7±0.1 0.8±0.1 ±0.1 1±0.1 ±0.1 1.2±0.1 ±0.1 10 ±0.1 ±0.1 ±0.1 ±0.1 ±0.1 ±0.1 10 4 sau ngày pH sau ngày 10 Đƣờng kính tản nấm, cm ML02.2 Đƣờng kính tản nấm, cm HD01 12 10 4 10 pH sau ngày sau ngày sau ngày sau ngày HD01 ML02.2 Hình 4.10 Biểu đồ thể ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 ML02.2 Qua nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 ML02.2 có khả sinh trƣởng tốt pH từ 5-7 Tuy nhiên, có sinh trƣởng khơng đồng pH=4 Tại pH=4 chủng HD01 không sinh trƣởng Ngƣợc lại với chủng ML02.2, pH=4 sinh trƣởng bình thƣờng Xét pH=9, chủng HD01 sinh trƣởng bình thƣờng, nhƣng chủng ML02.2 lại không thấy dấu hiệu sinh trƣởng Cả hai chủng HD01 ML02.2 không sinh trƣởng pH=10 40 pH = pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH=9 pH=10 Hình 4.11 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 sau ngày nuôi cấy 41 pH = pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH=9 pH=10 Hình 4.12 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm ML02.2 sau ngày nuôi cấy c)Ảnh hưởng dinh dưỡng đến khả sinh trưởng nấm Dinh dƣỡng yếu tố tất yếu môi trƣờng nuôi cấy chủng nấm Chúng tác động đến sinh trƣởng phát triền bình thƣờng chủng nấm Khả sinh trƣởng chủng nấm đƣợc tiến hành khảo sát môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau: CGA, SDA WA PDA với pH=6 nhiệt độ 30 o C sau 2,4,6 ngày theo dõi Kết khảo sát đƣợc thể bảng sau: 42 Bảng 4.8 Kết theo dõi ảnh hƣởng chất dinh dƣỡng đến sinh trƣởng chủng nấm sau ngày ni cấy Đƣờng kính tản nấm (cm) Thời gian CGA nuôi cấy SDA HD01 ML02.2 Ngày 2.5±0.1 5.3±0.1 ngày 5.4±0.1 7.6±0.1 ngày 7.2±0.1 9.8±0.1 HD01 2.3±0 4.5±0 6.2±0 WA ML02.2 HD01 ML02.2 HD01 ML02.2 4.4±0.1 ±0.1 ±0.1 1.8±0.1 4.7±0.1 6.5±0.1 ±0.1 ±0.1 3.7±0.1 7.3±0.1 9.4±0.1 ±0.1 ±0.1 6.5±0.1 10.0±0.1 12 Đƣờng kính tản nấm, cm Đƣờng kính tản nấm, cm PDA 10 CGA sau ngày SDA WA Chất dinh dƣỡng sau ngày PDA CGA sau ngày sau ngày HD01 SDA WA Chất dinh dƣỡng sau ngày PDA sau ngày ML02.2 Hình 4.13 Biểu đồ thể ảnh hƣởng dinh dƣỡng môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 ML02.2 Qua bảng 4.5 biểu đồ cho thấy chủng nấm HD01 ML02.2 sinh trƣởng đồng môi trƣờng SDA PDA khơng có dấu hiệu sinh trƣởng mơi trƣờng WA Tuy nhiên môi trƣờng CGA hai chủng có dấu hiệu sinh trƣởng yếu Kết phù hợp với nghiên cứu Vy Thế Vũ cộng sự, 2014 43 CGA SDA WA PDA Hình 4.14 Ảnh hƣởng dinh dƣỡng môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm HD01 sau ngày nuôi cấy 44 CGA SDA PDA WA Hình 4.15 Ảnh hƣởng dinh dƣỡng môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng nấm ML02.2 sau ngày nuôi cấy 4.4 Kết định danh 4.4.1 Kết điện di tổng số Sản phẩm điện di DNA tổng số tổng số DNA bƣớc khởi đầu quan trọng, định thành công cho phản ứng PCR sau Quy trình điện di tổng số DNA theo kít nhà sản xuất đạt hiệu tốt DNA điện di có độ tinh khiết cao Do đó, DNA thu đƣợc tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy 45 Áp dụng quy trình điện di tổng số DNA, tiến hành điện di DNA chủng nấm có biểu tái lây nhiễm rõ để thực phản ứng PCR Kết định lƣợng DNA gel agarose 1% cho thấy mẫu thu đƣợc sản phẩm DNA Hình 4.16 Kết điện di DNA tổng số chủng nấm 4.4.2 Kết phản ứng P R để giải trình tự vùng gen ITS định danh chủng nấm gây bệnh chuối Vùng liên gen ITS (internally transcribed spacers) cụm gen rDNA vùng gen phổ biến để nghiên cứu đa dạng phân loại nấm (Schoch cộng sự, 2012) Hình 4.17 Sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ DNA số dòng nấm với mồi ITS gel Agarose 1% Giải trình tự gen ITS tra cứu BLAST SEARCH có kết nhƣ sau: Tất chủng nấm có kết PCR dƣơng tính với mồi ITS1 ITS4, kết giải trình tự vùng gen ITS chủng nấm cho tín hiệu tốt với số nucleotide lớn 500 bp Kết phù hợp với nghiên cứu Ying Hong Lin cộng đƣợc công bố vào năm 2016 46 Bảng 4.9 Mối tƣơng quan di truyền dòng nấm phân lập với dịng nấm có ngân hàng Gen (NCBI) dựa vào trình tự ITS Số TT Chủng nấm Chiều dài bp Các loài quan hệ Mã số Tƣơng đồng (%) Collectotrichum ZYNV0VCJ013 99 % gloeosporioides ML02.2 891 bp Fusarium equiseti ZYP5W208013 100 % N24 914 bp Fusarium equiseti ZYPBJNW1016 100 % ML04.1 891 bp Fusarium sp ZYPER30X016 100 % ML02 826 bp Fusarium oxyporum ZYPXMM2Y013 100 % ML04 834 bp Fusarium equiseti ZYR2KXNF013 99 % ML06 929 bp Fusarium oxyporum ZYR779BD016 99 % Tất trình tự DNA chủng nấm đƣợc phân tích so sánh với trình tự cơng bố ngân hàng gen (NCBI) cơng cụ BLAST nucleotid Kết phân tích đƣợc so sánh với xây dựng phân loại chủng dịng nấm đƣợc phân lập  Trình tự 5’-3’, 882 bp chủng HD01 AAATTGGTTCTAACCTGATCCGAGGTCAACCTTTGGAAAATTGGGGG TTTTACGGCAAGAGTCCCTCCGGATCCCAGTGCGAGACGTAAAGTTA CTACGCAAAGGAGGCTCCGGGAGGGTCCGCCACTACCTTTGAGGGCC TACATCAGCTGTAGGGCCCCAACACCAAGCAGAGCTTGAGGGTTGAA ATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAAT GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAC TTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCC GTTGTTAAAAGTTTTGATTATTTGCTTGTACCACTCAGAAGAGACGTC GTTAAATCAGAGTTTGGTTATCCTCCGGCGGGCGCCGACCCGCCCGG AGGCGGGAGGCCGGGAGGGTCGCGGAGACCCTACCCGCCGAAGCAA CAGTTATAGGTATGTTCACAAAGGGTTGTAGAGCGTAAACTCAGTAA TGATCCCTCCGCAGGTTCACCCTACGGAAGGATCATTACTGAGTTTA CGCTCTACAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGG TAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGC GCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTCTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTGGCAACGGATCTCATGGTT CTGACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCAATAAGTAATGTGAAT HD01 882 bp 47 TGCAGAATTCAGTGAATCATCGCATCTTNGTAACGCGCATTGCACCC GGCCAGCATNCTGGCGGCCATGCCGGTACAACCAT  Trình tự 5’-3’, 891 bp chủng ML02.2 AAATTGGNTCTAACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGG TTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGTGTATGATTA CTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCGATTTGGGGAACGC GGGTTACCGCGAGTCCCAACACCAAGCTGAGCTTGAGGGTTGAAATG ACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTG CGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTA TCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTT GTTGAAAGTTTTGATTTATTTGTTTGTTTTACTCAGAAGTTCCACTAA AAACAGAGTTTAGGGGTCCTCGGGCGGGCCGTCCCGTTTTACGGGGC GCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACGTATAGGTATGTTCACAGGGGTTT GGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTCACCCTACGGA AGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCT ATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGC CCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAA AACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTG GCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGC AGAATTCAGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAG TATTCTGGCGGCCATGCCTGTTGAGCGTCATTCCACCTCTCAAGCTCA GCGTGNTCTTGGAACTCGCGGTAACCCNCGTACGCAAATCGA 4.4.3 Xây dựng phân loại Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 chủng nấm HD01 ML02.2 đƣa giải trình tự Bioedit7.2, sau có chuỗi đồng thuận đƣợc so sánh với trình tự DNA khác GenBank phần mềm BLAST, liệu theo phần mềm Mega phân tích bootstrap 1000 lần lặp lại để quan sát mối quan hệ di truyền qua phân loại nấm với phần mềm Mega cho thấy chủng HD01 thuộc lồi Colletotrichum gloeosporiodes với mức trình tự cao 98% chủng ML02.2 thuộc lồi Fusarium sp với mức trình tự tƣơng đồng 82% Cho thấy, mức độ tin cao Kết phân loại loài hai chủng đƣợc thể sau (chỉ số bootstrap đƣợc ghi đầu nhánh giản đồ): 48 Hình 4.18 Cây phân loại chủng nấm HD01 gây bệnh chuối đƣợc phân tích ITS1 ITS4 Hình 4.19 Cây phân loại chủng nấm ML02.2 gây bệnh chuối đƣợc phân tích ITS1 ITS4 49 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận  Từ mẫu chuối bị bệnh thu thập phân lập đƣợc 16 chủng nấm  Xác định dƣợc đặc điểm vi học chủng nấm phân lập đƣợc Hệ sợi nấm chủng HD01 phân mảnh, khơng màu có vách ngăn, hệ sợi nấm có gian bào, khơng bào, tế bào chứa nhiều nhân, chứa nhiều hạt dầu, bào tử nhỏ trụ thon bờn cú nhiu nhõn kớch thc 2-3àmì3-4àm v bào tử lớn trụ thon tù hai u bờn cú nhiu nhõn kớch thc 15-18àmì3-5àm i với chủng ML02.2, hệ sợi nấm phân nhánh, không màu có vách ngăn, hệ sợi nấm có gian bào, khơng bào, tế bào chứa nhiều nhân, bào tử nhỏ cú 1-2 vỏch ngn, hỡnh oval cú kớch thc 5-7àmì2-3àm, bào tử lớn đa bào có 3-4 vách ngăn có hỡnh dng li lim c trng kớch thc 30-36àmì3-5àm Tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm HD01 ML02.2 Kết cho thấy chúng sinh trƣởng tốt môi trƣờng PDA SDA, sinh trƣởng yếu môi trƣờng CGA không sinh trƣởng môi trƣờng WA Hai chủng nấm HD01 ML02.2 sinh trƣởng tốt ngƣỡng nhiệt độ 20-30oC Ở nhiệt độ 35oC hai chủng sinh trƣởng chậm Và 40oC, khơng có dấu hiệu sinh trƣởng hai chủng nấm Xét đến ảnh hƣởng pH môi trƣờng cho thấy chủng nấm HD01 ML02.2 có khả sinh trƣởng tốt pH từ 5-7 không sinh trƣởng pH=10  Định danh 7/16 chủng nấm phân lập đƣợc  Đã xây dựng phân loại hai chủng nấm HD01 ML02.2: chủng HD01 thuộc lồi Colletotrichum gloeosporiodes với mức trình tự cao 98% chủng ML02.2 thuộc lồi Fusarium sp với mức trình tự tƣơng đồng 82% 5.2 Kiến nghị - Thu thập thêm dòng nấm gây bệnh chuối địa bàn tỉnh Hải Dƣơng Mê Linh, Hà Nội - Tiếp tục xây dựng thêm phân loại chủng lại - Xác định chế gây bệnh chủng nấm gây bệnh chuối - Tiến hành nghiên cứu biện pháp sinh học để tạo chế phẩm sinh học có khả ức chế đƣợc mầm bệnh 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nhân Dũng Nguyễn Vũ Linh (2011) Giáo trình Tin sinh học Nhà xuất Đại học Cần Thơ Lƣơng Đức Phẩm (2004) Công nghệ sinh vật NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2000) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng (2006) Vi sinh vật NXB Giáo dục Vy Thế Vũ, Đào Un Trân Đa, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2014) Đặc điểm Collectotrichum Musae gây bệnh Thán thư chuối già Laba trồng Lâm Đồng Tài liệu Tổng cục Thống kê Tổng cục Hải quan 2001-2009 Đặng Thị Kim Uyên, Trần Nhân Dũng Nguyễn Văn Hòa (2017) Kết bước đầu xây dựng phát sinh loài nấm Colletotrichum spp Gây bệnh thán thư long tỉnh phía Nam Hoàng Bằng An, Nguyễn Văn Nghiêm, Hoàng Việt Anh, Lê Nhƣ Thịnh, Nguyễn Hoàng Yến (2018) Đánh giá bước đầu trạng đề xuất số giải pháp kinh tế thị trường phát triển sản xuất chuối tiêu xuất Việt Nam Tài liệu tiếng Anh Kumar, MM (2004) Rank Difference Analysis of Microarrays (RDAM), a novel approach to statistical analysis of microarray expression profiling data BMC Bioinformatics, 5: 148 10 Nilsson RH, Tedersoo L, Abarenkov K, Ryberg M, Kristiansson E, Hartmann M, Schoch CL, Nylander JAA, Bergsten J, Porter TM, Vaishampayan AJP, Ovaskainen O, Hallenberg N, Bengtsson-Palme J, Eriksson KM, Larsson HK, Larsson E, Koljalg U., (2012) Five simple guidelines for establishing basic authenticity and reliability of newly generated fungal ITS sequences Myco Keys, 4: 37-63 11 UNCTAD Secretariat from FAO statistics 2001-1007 12 Zhang Lei, Yuan Tinglu, Wang Yanzhang, Zhang Dong Tingting Bai Shengtao Xu, Yunyue Wang, Weihua Tang , Si-Jun Zheng (2018) Identification and evaluation of resistance to Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race in Musa acuminata Pahang 51 13 Abd-Elsalam KA, Roshdy S, Amin OE, Rabani M (2010) First morphogenetic identification of the fungal pathogen Colletotrichum musae (Phyllachoraceae) from imported bananas in Saudi Arabia Gen Mol Res., 9(4): 2335-2342 14 Butler D (2013) Fungus threatens top banana Nature 504(7479):195–196 15 Mak, C., Mohamed, A A., Liew, K W., and Ho, Y W (2004) “Early screening technique for Fusarium wilt resistance in banana micropropagated plants,” in Banana Improvement: Cellular, Molecular Biology, and Induced Mutations, eds R Swennen and M S Jain (Enfield, NH: Science Publishers, Inc.),219–227 16 Bani, M., Rubiales, D., and Rispail, N (2012) A detailed evaluation method to identify sources of quantitative resistance to Fusarium oxysporum f sp pisi race within a Pisum spp germplasm collection Plant Pathol 61, 532–542 doi: 10.1111/j.1365-3059.2011.02537.x 17 Ismet Ara, Rizwana H., M.R.Al-Othamn and Bakir M.A (2012) Studies of actinomycetes for biological control of Colletotrichum musae pathogen during post harvest anthracnose of banana 18 Andrew Chen, Jiaman Sun, Andrea Matthews, Liz Armas-Egas, Ning Chen, Sharon Hamil, Shart Mintoff, Lucy T.T Tran-Nguyen, Jaqueline Batley and Efizabeth A.B Aithen (2019) Assessing Variations in Host Resistance to Fusarium oxysporum f sp cubense Race in Musa Species, With a Focus on the Subtropical Race 19 Hasan N.A., Zanuddin N.A.M (2018) Molecular identification of isolated fungi from banana, mango and pineapple spoiled fruits 20 Yaouba Aoudou, Mpounze Essoua Gaelle Phalone (2017) Isolation and Pathogenicity Evaluation of Postharvest Fungal of Some Fruits in Cameroon 21 Mongkutkarn Udompongsuk and Kasem Soytong (2016) Isolation, Identification, and Pathogenicity Test from Fusarium oxysporum f.sp cubense Causing Banana Wilt 22 Surridge A K J., Viljoen A., Crous P W and Wehner F C (2003) Identification of the pathogen associated with Sigatoka disease of banana in South Africa 52 23 Lixiang Cao, Zhiqi Qiu, Jianlan You, Hongming Tan, Shining Zhou (2005) Isolation and characterization of endophytic streptomycete antagonists of fusarium wilt pathogen from surface-sterilized banana roots 24 Li CY, Mostert G, Zuo CW, Beukes I, Yang QS, Sheng O, Kuang RB, Wei YR, Hu CH, Rose L, Karangwa P, Yang J, Deng GM, Liu SW, Gao J Viljoen and Yi GJ (2013) Diversity and Distribution of the Banana Wilt Pathogen Fusarium oxysporum F Sp cubense in China 25 Majid Amani, Gayane Avagyan (2014) Isolation and Identification of Fungal Pathogens on Banana Trees (Musa acuminata L.) in Iran 26 Muhammad Abdullahi Sani, Muhammad Kasim (2019) Isolation and identification of fungi associated with postharvest Deterioration of banana (Musa paradisiaca L.) 27 Smith L J., Smith M K., Tree D., D O’Keefe and Galea V J (2008) Development of a small-plant bioassay to assess banana grown from tissue culture for consistent infection by Fusarium oxysporum f sp cubense 28 Gert H J Kema, Andre Drenth, Miguel Dita, Kees Jansen, Sietze Vellema and Jetse J Stoorvogel (2021) Editorial: Fusarium Wilt of Banana, aRecurring Threat to Global Banana Production 29 Zhenfang Li, Tong Wang, Chenling He, Kelin Cheng, Rensen Zeng and Yuanyuan Song (2020) Control of Panama disease of banana by intercropping with Chinese chive (Allium tuberosum Rottler): cultivar differences 30 Yi-Jia Lin, Hsuan-Kai Lin, Ying-Hong Lin (2020) Construction of Raman spectroscopic fingerprints for the detection of Fusarium wilt of banana in Taiwan 31 Kenneth G Pegg, Lindel M Coates, Wayne T O’Neill1 and David W Turner (2019) The Epidemiology of Fusarium Wilt of Banana 32 Kristle Grace , Aguilar-Hawod , Fe M de la Cueva and Christian Joseph R Cumagun (2020) Genetic Diversity of Fusarium oxysporum f sp.cubense Causing Panama Wilt of Banana in the Philippines 33 Shuta Asai, Ayukawa Yu, Pamela Gan, Sachiko Masuda, Ken Komatsu, Ken Shirasu, Tsutomu Arie (2019) High-Quality Draft Genome Sequence of Fusarium oxysporum f sp cubense Strain 160527, a Causal Agent of Panama Disease 53 34 Fernando A García-Bastidas, Alexander J T van der Veen, Giuliana Nakasato-Tagami, Harold J G Meijer, Rafael E Arango-Isaza and Gert H J Kema (2019) An Improved Phenotyping Protocol for Panama Disease in Banana 35 Giovanni Bubici, Manoj Kaushal, Maria Isabella Prigigallo,Carmen GómezLama Cabanas and Jesus Mercado-Blanco (2019) Corrigendum: Biological Control Agents Against Fusarium Wilt of Banana 36 Daniel P Bebber (2019) Climate change effects on Black Sigatoka disease of banana Nguồn internet https://nongsanviet.nongnghiep.vn/benh-heo-ru-panama ke-huy-diet-chuoihang-loat-d268348.html https://tailieuxanh.com/vn/tlID479078_phong-tru-benh-panama-chochuoi.html https://123doc.net/document/317554-chuoi.htm www.fao.org/statistics http://www.Tiennong.vn https://dongangia.com/tu-van/cach-dieu-tri-benh-thuong-gap-o-cay-chuoinam-my-6 https://plantix.net/en/library/plant-diseases/200039/cucumber-mosaic-viruson-banana 54