Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus phù hợp cho lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS PHÙ HỢP CHO LÊN MEN BÃ SẮN LÀM THỨC ĂN CHĂN NUÔI” HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS PHÙ HỢP CHO LÊN MEN BÃ SẮN LÀM THỨC ĂN CHĂN NUÔI” Sinh viên thực : Mai Thùy Linh Khóa : 63 Ngành : Công nghệ sinh học Người hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không chép kết nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tài liệu, thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Mai Thùy Linh i LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn người hướng dẫn, TS Vũ Thị Hạnh Nguyên, cán Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, cho em hội tuyệt vời để thực đề tài nghiên Cảm ơn cô hướng dẫn bảo tận tình, ln đưa lời khun dẫn lúc em gặp khó khăn Nhờ mà tơi tiếp xúc nhiều với kiến thức thực tế mà trước học sách Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS TS Phí Quyết Tiến tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành đề tài Luận văn thực nhờ hỗ trợ kinh phí Đề tài: “Nghiên cứu xử lý bã thải sắn làm thức ăn chăn nuôi chế phẩm sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường”, Mã số TNMT.2021.553.01, Chủ nhiệm đề tài: TS Vũ Thị Hạnh Nguyên Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh thuộc Bộ môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Viêt Nam Thầy giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu viết luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến CN Lê Phương Chi, ThS Ngyễn Văn Thế cán (Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học) giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam thầy cô Học viện tạo điều kiện cho thực khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ giúp đỡ Một lần cho phép cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình quý báu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Mai Thùy Linh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình sử dụng chế biến bã sắn chăn nuôi 1.2 Nhóm vi sinh vật sử dụng lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi 1.3 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng cho lên men bã sắn 1.3.1 Khả sinh enzyme ngoại bào 1.3.3 Khả phân giải xyanua 1.3.4 Yêu cầu an toàn vi sinh vật sử dụng chăn nuôi 10 1.4 Tình hình sử dụng bã sắn nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi 11 1.4.1 Tình hình sử dụng bã sắn nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi giới 11 1.4.2 Tình hình sử dụng bã sắn nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi Việt Nam 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 20 2.1.2 Hóa chất thiết bị 20 2.1.3 Môi trường nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Giữ giống vi khuẩn 22 iii 2.2.2 Hoạt hóa nhân giống vi khuẩn 23 2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào vi khuẩn 23 2.2.4 Xác định khả phân giải xyanua vi khuẩn 24 2.2.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 25 2.2.6 Phương pháp xử lí số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Sàng lọc khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 29 3.1.1 Sàng lọc vi khuẩn có khả sinh cellulase 29 3.1.2 Sàng lọc vi khuẩn có khả sinh amylase 31 3.1.3 Sàng lọc vi khuẩn có khả sinh protease 34 3.2 Khả phân giải xyanua chủng vi khuẩn 36 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng tuyển chọn 39 3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng tuyển chọn 39 3.3.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh lí chủng tuyển chọn 39 3.3.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen 16S rRNA chủng tuyển chọn 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 53 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.2: Hóa chất sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.1: Khả sinh phân giải CMC chủng vi khuẩn 30 Bảng 3.2: Khả sinh amylase chủng vi khuẩn 32 Bảng 3.3: Khả sinh protase chủng vi khuẩn 35 Bảng 3.4: Khả sử dụng hiệu suất phân giải xyanua chủng vi khuẩn 37 Bảng 3.5: Khả đồng hóa nguồn carbon, nito chủng vi khuẩn BCH6 40 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến sinh trưởng BCH6 40 Bảng 3.7: So sánh đặc điểm sinh lí, sinh hóa chủng BCH6 với chủng đối chiếu Bacillus velezensis CBMB205 43 v DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 2.1: Đồ thị đường chuẩn xyanua 25 Hình 3.1: Đường kính vịng phân giải CMC số chủng vi khuẩn 30 Hình 3.2: Khả phân giải tinh bột tan chủng vi khuẩn 32 Hình 3.3: Hình ảnh vịng phân giải protein chủng vi khuẩn 35 Hình 3.4: Sàng lọc sơ cấp chủng vi khuẩn có khả phân giải xyanua 37 Hình 3.5: Hình ảnh khuẩn lạc hình ảnh tế bào chủng BCH6 39 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S Rrna gel Agarose 1% 41 Hình 3.7: Cây phát sinh lồi dựa theo phương pháp Neighbor-joining độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA 42 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BOD Biochemical oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hố COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa học CMC Carboxymethyl Cellulosen CW Sportsueira FAO Foodand Agriculture Organization Tổ chức Lương thực Nước thải từ sắn of the United Nations Nông nghiệp Liên Hợp Quốc LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn lactic LF Liquid Feed, LF Thức ăn lỏng NN&PTNT Nông Nghiệp phát triển nông thôn rDNA Deoxyribonucleic acid ribosome TN&MT Tài nguyên môi trường TNHH Trách nghiệm hữu hạn VK Bacterium Vi khuẩn VSV w/v Vi sinh vật Đơn vị khối lượng/thể tích Weight/volume vii TÓM TẮT Việt Nam nước đứng đầu giới sản xuất xuất lương thực ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi nước ta chưa thực phát triển Từ vấn đề có nhiều nghiên cứu tận dụng phụ phẩm công nông nghiệp làm thức ăn chăn nuôi có nguồn phụ phẩm từ chế biến lương thực thực phẩm đặc biệt từ bã sắn Trong nghiên cứu sử dụng 14 chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải bã sắn thu thập Công ty cổ phần thực phẩm Minh Dương (Hà Nội) sưu tập chủng giống lưu trữ Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào phân giải độc tố xyanua Đánh giá khả sinh amylase, sàng lọc 9/14 chủng (chiếm 64,28%), 10/14 chủng (chiếm 71,43%) có khả sinh cellulase 11/14 chủng (chiếm 78,57%) ó khả sinh protase Với khả phân giải xyanua, sàng lọc 13/14 chủng (chiếm 92,86%) Trong chủng BCH6 có khả sinh enzyme ngoại bào amylase, cellulase protase tốt với đường kính vịng phân giải 14,0 ± 1,0, 20,33 ± 0,58 19,33 ± 1,15, khả phân giải xyanua vượt trội đánh giá thông qua kết phân giải 100% NaCN 1,5 mM ngày nuôi cấy Sử dụng phương pháp phân loại truyền thống kết hợp với phân tích trình tự gene 16S rRNA, chủng BCH6 định danh chủng Bacillus velezensis BCH6 Do chủng B velezensis BCH6 có nhiều tiềm việc lên men bã sắn ứng dụng sản xuất chế phẩm thức ăn chăn nuôi viii Kết cho thấy chủng BCH6 phát triển tốt 30℃ Đây khoảng nhiệt độ gần với nhiệt độ tiến hành lên men thức ăn chăn nuôi Đặc điểm có lợi cho việc sử dụng chủng nghiên cứu vào sản xuất thức ăn chăn nuôi cho lợn Chủng BCH6 sinh trưởng tốt dải pH từ 4-9, tối ưu pH Tại nồng độ muối từ 0- 4% chủng BCH6 phát triển tốt, tối ưu nồng độ 0-2%, sinh trưởng nồng độ muối 6% Từ kết khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, đối chiếu với khóa phân loại Bergey, phân loại chủng vi khuẩn BCH6 thuộc chi Bacillus 3.3.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen 16S rRNA chủng tuyển chọn Vùng gen 16S rRNA vùng gen có tính bảo tồn cao máy phiên mã thường sử dụng để xác định, phân loại vi sinh vật khác bao gồm vi khuẩn bacillus (Schmidt cs, 1991) Các đoạn mồi PCR phổ quát thiết kế để nhắm mục tiêu vào vùng bảo tồn 16S để khuếch đại vùng gen nhằm phân loại chủng vi sinh vật (Cox cs, 2017) ) Khuếch đại vùng 16S rARN chủng tuyển chọn BCH6 với mồi 27F 1492R tạo băng khoảng 1400 bp (Hình 3.5) Kết điện di chủng BCH6 thể Hình 3.5 trình tự gen trình bày phần Phụ lục Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA gel Agarose 1% Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); BCH6: Sản phẩm khuếch đại vùng 16S rRNA 41 Sau giải trình tự 16S rRNA chủng BCH6, liệu so sánh với trình tự gen ngân hàng sở liệu GenBank công cụ BLAST NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), từ xây dựng phát sinh lồi dựa phương pháp Neighbor-joining Hình 3.7: Cây phát sinh lồi dựa theo phương pháp Neighbor-joining độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA Kết cho thấy trình tự đoạn 16S rRNA chủng BCH6 có độ tương đồng với trình tự gen NCBI 99,17% 99,16% với chủng Bacillus velezensis KKP 3661 Bacillus velezensis CBMB205, cho thấy chủng vi khuẩn BCH6 thuộc loài B velezensis Kết cho thấy tương ứng đánh giá đặc điểm sinh học nhằm phân loại phương pháp truyền thống bao gồm xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, nhuộm Gram khả đồng hóa nguồn cacbon, nito Như vậy, chủng vi khuẩn BCH6 nghiên cứu định danh Bacillus velezensis BCH6 42 Bảng 3.7: So sánh đặc điểm sinh lí, sinh hóa chủng BCH6 với chủng đối chiếu Bacillus velezensis CBMB205 Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc Bacillus velezensis CBMB205 (Ruiz- BCH6 García cs, 2005) Màu trắng, bề mặt khô Màu trắng, phẳng, bề mặt nhăn, viền nhăn, viền , bề mặt cưa cắt ngang có độ lõm Tế bào Hình que Hình que Bào tử Hình thành bào tử Hình thành bào tử Nhiệt độ (℃) 20 – 40 20 – 45 pH 4-9 5- 10 0-4 0-3 Nồng độ muối (%) Khả đồng Có khả đồng hóa hóa nguồn số nguồn cacbon, cacbon, nito nito Có khả đồng hóa số nguồn cacbon, nito Theo nghiên cứu gần Quách Ngọc Tùng cộng (2021) chủng B velezensis VTX9 phân lập từ phân lợn chứng minh số đặc tính probiotic bao gồm khả kháng mM H2O2, 0,6 mM muối mật, pH thấp, hoạt động kháng sinh, phân tích gen cho thấy khơng có gen chức mã hóa độc tố ruột khả kháng kháng sinh truyền được, điều khẳng định tính an tồn B velezensis VTX9 có tiềm trở thành ứng cử viên lợi khuẩn (Quách Ngọc Tùng cs, 2021) Ở nghiên cứu khác tác giả Vũ Thị Hạnh Nguyên cộng (2021) chủng phân lập B velezensis VTX20 đánh giá khả sản xuất Exopolysaccharides (EPS) chức từ Bacillus velezensis, Chủng VTX20 tạo suất EPS tối đa 75,5 ± 4,8 g/L từ 200 g/L sacarose ban đầu sau 48 ni cấy Thơng qua phân tích gen, ls-lev Boperon lần phát chịu trách nhiệm sản xuất EPS loại levan B velezensis Đặc điểm cấu trúc sinh hóa khẳng định thêm 43 phần lớn levan, mức độ cực thấp chất tạo sinh dextran Chỉ số hòa tan nước khả giữ nước EPS 81,9 ± 3,4% 100,2 ± 3,4% Các phân tích hoạt động chống oxy hóa in vitro cho thấy hoạt động thu gom mạnh mẽ giá trị gốc 1,1 ‐ diphenyl ‐ ‐ picrylhydrazyl hydroxyl 40,1–64,0% 16,0–40% Những phát làm sáng tỏ trình sinh tổng hợp EPS B velezensis cấp độ cấu trúc di truyền ứng dụng tiềm EPS chất chống oxy hóa tự nhiên cho ngành cơng nghiệp dược phẩm y sinh (Vũ Thị Hạnh Nguyên cs, 2021) Chủng B velezensis lần phân lập từ mẫu môi trường lấy từ cửa sông Vélez Torredelmar thuộc tỉnh Málaga, Tây Ban Nha (Ruiz cs, 2005) Trong nhiều nghiên cứu công bố chủng B velezensis thường tìm thấy thực phẩm lên men, nước thải đất Chúng xem chủng vi khuẩn khởi đầu có khả bảo vệ để sản xuất thực phẩm lên men kiềm (Chaves‐López cs, 2015) B velezensis áp dụng rộng rãi cho ứng dụng kiểm soát sinh học (Ye cs, 2018), chẳng hạn phân bón sinh học thương mại thuốc trừ sâu sinh học sử dụng chủng SQR9 (Zhang cs, 2015), 9912D (Pan cs, 2017), LM2303 (Chen cs, 2018), FZB42 (Fan cs, 2018) Trong đó, nhiều nghiên cứu báo cáo gần hỗ trợ việc sử dụng B velezensis lĩnh vực kiểm soát sinh học thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Adeniji cs, 2019) Cho đến nay, có số nghiên cứu báo cáo việc xử lý chất thải công nghiệp nông nghiệp cách sử dụng cặp sinh vật để tối ưu hóa chất lượng thức ăn lên men, chẳng hạn Bacillus subtilis Enterococcus faecium (Shi cs, 2017), Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae (Chen cs, 2009), Bacillus subtilis Bacillus coagulans (Yeh cs, 2018) Tuy nhiên, ứng dụng liên quan đến trình lên men thức ăn B velezensis chưa báo cáo tác động có lợi tiềm tàng q trình lên men Ngoài B velezensis đề nghị cho danh sách QPS với tiêu chuẩn khơng có tiềm gây độc tố khơng có khả sản xuất aminoglycoside, Cục Quản lý 44 Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), Cơ quan An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đánh giá an toàn sử dụng bổ sung vào thực phẩm, thức ăn chăn nuôi mang lại lợi ích kinh tế cao, có triển vọng ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi phụ gia lên men (Koutsoumanis cs, 2020) Như nghiên cứu khẳng định công bố chủng B velezensis phân lập từ bã thải sắn có khả phân giải số chất khơng tiêu hóa chất kháng dinh dưỡng xyanua Từ chứng minh tiềm ứng dụng vào lên men sản xuất thức ăn chăn nuôi chủng B velezensis BCH6 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận • Sàng lọc 14 chủng vi khuẩn phân lập từ bã thải sắn lấy nhà máy chế biến sắn (Hà Nội) có khả sinh enzyme ngoại bào thu được: + 10 chủng (chiếm 71,43%) 14 chủng có khả sinh cellulase với đường kính vịng phân giải CMC từ 6,0-20,33 mm + (chiếm 64,28%) chủng 14 chủng có khả sinh amylase phân giải tinh bột với đường kính vịng phân giải từ – 14 mm + 11 chủng (chiếm 78,57%) tổng số 14 chủng có khả sinh protase với đường kính vịng phân giải giao động từ 9,0 - 19,33mm • Sàng lọc chủng có khả phân giải xyanua thu 13/14 chủng VK có khả phân giải xyanua, với chủng có hiệu suất phân giải xyanua tối đa (100%) • Kết hợp phương pháp phân loại hình thái trình tự gen 16S rRNA, chủng BCH6 định danh Bacillus velezensis BCH6 4.2 Kiến nghị • Tiếp tục nghiên cứu động thái lên men chủng B velezensis BCH6 đánh giá khả phân giải xyanua nồng độ môi trường khác • Thực nghiệm lên men bã sắn sản xuất thức ăn chăn ni quy mơ phịng thí nghiệm chủng B velezensis BCH6 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Quang Tuấn (2005), “Nghiên cứu ủ chua bã sắn làm thức ăn dự trữ cho trâu bị”, Tạp chí Chăn ni, số 9, 2005 Bùi Tuấn Anh, Phạm Văn Hùng, Nguyễn Thanh Phong (2018) Nghiên cứu sử dụng bột sắn để sản xuất viên thức ăn chăn nuôi Int J Adv Khoa học Anh Inf Technol , (1), 242-249 Đặng Thị Thu (1995) Làm giàu protein cho bột sắn sống phương pháp lên men môi trường rắn dùng làm thức ăn gia súc Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 33(1): 1-4 Nguyễn Hữa Văn, Nguyễn Xuân Bả (2008) Đánh giá giá trị dinh dưỡng ủ chua với phụ gia làm thức ăn cho gia súc nhai lại Tạp chí Khoa học Đại học Huế 46 Nguyễn Thị Hồng Hạnh Nguyễn Hưng Quang (2008), Hiện trạng sử dụng sắn phụ phẩm từ sắn chăn ni gia súc nhai lại Việt Nam, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 82 (06), 59 – 63 Nguyễn Văn Thế (2019) Nghiên cứu đặc tính sinh học vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng phục vụ chăn nuôi lợn Từ Việt Phú , Phạm Kim Đăng , Nguyễn Công Oánh , Chu Kỳ Sơn (2016) Đánh giá tiềm sử dụng phụ phẩm ngành rượu cồn để sản xuất thức ăn chăn nuôi Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển 14(1): 93-100 Trần Thu Trang (2016) Xử lý chất thải từ chế biến tinh bột sắn phương pháp sinh học Tài liệu tiếng Anh Abbas, B A., Khudor, M H., & Saeed, B M (2014) Detection of hbl, nhe and bceT toxin genes in Bacillus cereus isolates by multiplex PCR Int J Curr Microbiol App Sci, 3(11), 1009-1016 Abriouel H, Franz CM, Omar NB, cs: Diversity and applications of Bacillus bacteriocins FEMS Microbiol Rev 2011;35:201–232 Adeniji, A A., Loots, D T., & Babalola, O O (2019) Bacillus velezensis: phylogeny, useful applications, and avenues for exploitation Applied microbiology and biotechnology, 103(9), 3669-3682 Ajao, K R., & Adegun, I K (2009) Performance evaluation of a locally fabricated mini cassava flash dryer Journal of Science PublicationVol, 1(3), 54-60 Akcil, A (2003) Destruction of cyanide in gold mill effluents: biological versus chemical treatments Biotechnology Advances, 21(6), 501-511 Bayane, A., Roblain, D., Dauphin, R D., Destain, J., Diawara, B., & Thonart, P (2006) Assessment of the physiological and biochemical characterization of a Lactic acid bacterium isolated from chicken faeces in sahelian region African Journal of Biotechnology, 5(8), 629-634 Bernardeau, M., Lehtinen, M J., Forssten, S D., & Nurminen, P (2017) Importance of the gastrointestinal life cycle of Bacillus for probiotic functionality Journal of Food Science and Technology, 54(8), 2570-2584 47 Bernardeau, M., Lehtinen, M J., Forssten, S D., & Nurminen, P (2017) Importance of the gastrointestinal life cycle of Bacillus for probiotic functionality Journal of Food Science and Technology, 54(8), 2570-2584 Bierbaum G, Sahl HG (2009) Lantibiotics: mode of action, biosynthesis and bioengineering Curr Pharm Biotechnol 2009;10:2–18 10 Chaves‐López, C., Serio, A., Gianotti, A., Sacchetti, G., Ndagijimana, M., Ciccarone, C., & Paparella, A (2015) Diversity of food‐borne Bacillus volatile compounds and influence on fungal growth Journal of applied microbiology, 119(2), 487-499 11 Chen, L., Heng, J., Qin, S., & Bian, K (2018) A comprehensive understanding of the biocontrol potential of Bacillus velezensis LM2303 against Fusarium head blight PLoS One, 13(6), e0198560 12 Cotter PD, Ross RP, Hill C (2013) Bacteriocins – a viable alternative to antibiotics? Nature Rev Microbiol 11:95–105 13 Cox, M J., Turek, E M., Hennessy, C., Mirza, G K., James, P L., Coleman, M., … Loebinger, M R (2017) Longitudinal assessment of sputum microbiome by sequencing of the 16S rRNA gene in non-cystic fibrosis bronchiectasis patients 14 Dewiyanti, I., Darmawi, D., Muchlisin, Z A., Helmi, T Z., Arisa, I I., Rahmiati, R., & Destri, E (2022) Cellulase enzyme activity of the bacteria isolated from mangrove ecosystem in Aceh Besar and Banda Aceh In IOP Conference Series: Earth and Environmental Science (Vol 951, No 1, p 012113) 15 EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), Koutsoumanis, K., Allende, A., Alvarez‐Ordóđez, A., Bolton, D., Bover‐Cid, S., & Herman, L (2020) Scientific Opinion on the update of the list of QPS‐recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA (2017–2019) EFSA Journal, 18(2), e05966 16 Elshaghabee, F M., Rokana, N., Gulhane, R D., Sharma, C., & Panwar, H (2017) Bacillus as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives Frontiers in microbiology, 1490 17 Ezekiel, O.O., Aworh, O.C., Du Preez, J.C., Steyn, L (2012) Cultivation of candida utilis on cassava peel hydrolysates for single-cell protein production J Food Sci Eng 2, 452–461 18 Fan, B., Wang, C., Song, X., Ding, X., Wu, L., Wu, H., & Borriss, R (2018) Bacillus velezensis FZB42 in 2018: the gram-positive model strain for plant growth promotion and biocontrol Frontiers in microbiology, 9, 2491 19 Fasiku,A., S A., Ogunsola, O F., Fakunle, A., & Olanbiwoninu, A (2020) Isolation of Bacteria with potential of producing extracellular enzymes (amylase, cellulase and protease) from soil samples Adv Appl Microbiol, 21-26 20 Florencia, V., López, O V., & García, M A (2020) Exploitation of by-products from cassava and ahipa starch extraction as filler of thermoplastic corn starch Composites Part B: Engineering, 182, 107653 21 G Pant, A Prakash, J.V.P Pavani, S Bera, G.V.N.S Deviram, A Kumar, M Panchpuri & R Prasuna (2015) Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis, Journal of Taibah University for Science, Vol 9(1), 50-55 22 Gadd, G M., & Gadd, G M (Eds.) (2001) Fungi in bioremediation (No 23) Cambridge University Press 48 23 Gori, K., Kryger Bjørklund, M., Canibe, N., Oyan Pedersen, A., & Jespersen, L (2011) Occurrence and identification of yeast species in fermented liquid feed for piglets Microbial ecology, 61(1), 146-153 24 Gunam, I B W., Sujana, I G A., Wijaya, I M M., Setiyo, Y., Putra, I W W P., & Suriati, L (2021) Isolation and selection of amylase-producing microbes isolated from ragi tape and cassava tape available on the markets In IOP Conference Series: Earth and Environmental Science (Vol 913, No 1, p 012041) 25 Gupta, A K., & Westney, D E (2003) Smart globalization: designing global strategies, creating global networks San Francisco: Jossey-Bass 26 Gusils, C., Cuozzo, S., Sesma, F., & Gonzalez, S (2002) Examination of adhesive determinants in three species of Lactobacillus isolated from chicken Canadian journal of microbiology, 48(1), 34-42 27 Joysowal, M., Saikia, B N., Dowarah, R., Tamuly, S., Kalita, D., & Choudhury, K D (2018) Effect of probiotic Pediococcus acidilactici FT28 on growth performance, nutrient digestibility, health status, meat quality, and intestinal morphology in growing pigs Veterinary world, 11(12), 1669 28 Kaufmann, U., Kunzer, M., Maier, M., Obloh, H., Ramakrishnan, A., Santic, B., & Schlotter, P (1998) Nature of the 2.8 eV photoluminescence band in Mg doped GaN Applied physics letters, 72(11), 1326-1328 29 Kosaric, N., Nguyen, H T., & Bergougnou, M A (1974) Growth of Spirulina maxima algae in effluents from secondary waste‐water treatment plants Biotechnology and Bioengineering, 16(7), 881-896 30 Kumar S, Stecher G and Tamura K (2016), MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets, Mol Biol Evol, 33(7): 1870-1874 31 Latorre, J D., Hernandez-Velasco, X., Wolfenden, R E., Vicente, J L., Wolfenden, A D., Menconi, A., & Tellez, G (2016) Evaluation and selection of Bacillus species based on enzyme production, antimicrobial activity, and biofilm synthesis as direct-fed microbial candidates for poultry Frontiers in veterinary science, 3, 95 32 Limon, R L (1992) Ensilage of cassava products and their use as animal feed In; Roots, tubers, plantains and bananas in animal feeding (Editors: D Machin and A W Speedy) FAO Animal Production and Health Paper No 95: 99-110 33 Linde, G A., Luciani, A., Lopes, A D., Valle, J S D., & Colauto, N B (2018) Longterm cryopreservation of basidiomycetes brazilian journal of microbiology, 49, 220231 34 Ludzack, F J (1960) Laboratory model activated sludge unit Journal (Water Pollution Control Federation), 605-609 35 Luque-Almagro, V M., Huertas, M J., Martínez-Luque, M., Moreno-Vivián, C., Roldán, M D., García-Gil, L J., & Blasco, R (2005) Bacterial degradation of cyanide and its metal complexes under alkaline conditions Applied and environmental microbiology, 71(2), 940-947 36 Marjuki, Sulistyo, H.E., Rini, D.W., Artharini, I., Soebarinoto and Howeler, R (2008) The use of cassava leaf silage as a feed supplement in diets for ruminants and its introduction to smallholder farmers LRRD Vol 20 No.6 37 Mekuto, L., Jackson, V A., & Ntwampe, S K O (2013) Biodegradation of free cyanide 49 using Bacillus sp consortium dominated by Bacillus safensis, Lichenformis and Tequilensis strains: A bioprocess supported solely with whey 38 Mer, R K., Prajith, P K., H Pandya, D., & Pandey, A N (2000) Effect of salts on germination of seeds and growth of young plants of Hordeum vulgare, Triticum aestivum, Cicer arietinum and Brassica juncea Journal of Agronomy and Crop Science, 185(4), 209-217 39 Mingmongkolchai, S and W Panbangred (2017) In vitro evaluation of candidate Bacillus spp for animal feed J Gen Appl Microbiol 63(2): 147-156 40 N Laili, S Antonius, (2017) Production and Characterization of Extracellular Protease from Bacillus sp 140-B Isolated from Pineapple Plantation in Lampung, Indonesia, ICBS Conference Proceedings, International Conference on Biological Science, Vol 2(2), 170-176 41 Oboh, G (2006) Nutrient enrichment of cassava peels using a mixed culture of Saccharomyces cerevisae and Lactobacillus spp solid media fermentation techniques Electronic Journal of Biotechnology, 9(1), 0-0 42 Oboh, G., & Akindahunsi, A A (2003) Biochemical changes in cassava products (flour & gari) subjected to Saccharomyces cerevisae solid media fermentation Food chemistry, 82(4), 599-602 43 Ogbo, F (2010) Conversion of cassava wastes for biofertilizer production using phosphate solubilizing fungi Bioresourc Technol 101 (11), 4120–4124 44 Olanbiwoninu, A A., S A Odunfa (2012) Enhancing the production of reducing sugars from cassava peels by pretreatment methods Int J Sci Technol 2: 650-665 45 Pan, H Q., Li, Q L., & Hu, J C (2017) The complete genome sequence of Bacillus velezensis 9912D reveals its biocontrol mechanism as a novel commercial biological fungicide agent Journal of biotechnology, 247, 2546 Pandey, A., Soccol, C R., Nigam, P., Soccol, V T., Vandenberghe, L P., & Mohan, R (2000) Biotechnological potential of agro-industrial residues II: cassava bagasse Bioresource technology, 74(1), 81-87 47 Pant, G., Prakash, A., Pavani, J V P., Bera, S., Deviram, G V N S., Kumar, A., & Prasuna, R G (2015) Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis Journal of Taibah University for Science, 9(1), 50-55 48 Peres, S., Monteiro, M R., Ferreira, M L., & Nascimento Junior, A F (2019) Anaerobic digestion process for the production of biogas from cassava and sewage treatment plant sludge in Brazil BioEnergy Research, 12(1), 150-157 49 Phister, T., D O'Sullivan and L McKay (2004) Identification of bacilysin, chlorotetaine, and iturin A produced by Bacillus sp strain CS93 isolated from pozol, a Mexican fermented maize dough Appl Environ Microbiol 70(1): 631-634 50 Prajapati V S., Trivedi U B., Patel K C (2015) A statistical approach for the production of thermostable and alklophilic alpha-amylase from Bacillus amyloliquefaciens KCP2 under solid-state fermentation Biotech, 5, 211-220 51 Aro, S O (2008) Improvement in the nutritive quality of cassava and its by-products through microbial fermentation African Journal of Biotechnology, 7(25) 52 Quach, N T., Vu, T H N., Nguyen, N A., Bui, T L., Ky, S C., Le, T L., & Phi, Q T (2021) Phenotypic features and analysis of genes supporting probiotic action unravel 50 underlying perspectives of Bacillus velezensis VTX9 as a potential feed additive for swine Annals of Microbiology, 71(1), 1-14 53 Ramarathnam, R., S Bo, Y Chen, W Fernando, G Xuewen and T De Kievit (2007) Molecular and biochemical detection of fengycin-and bacillomycin D-producing Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat Canadian Journal of Microbiology 53(7): 901-911 54 Reformanda, S., Darwis, W., Wibowo, R H., Supriati, R., & Siboro, R (2021) Isolation and Identification of Cellulase-Producing Encophytic Bacteria From Yellow Root Plants (Arvangelisia flava (L.) Merr) From Enggano Island In 3rd KOBI Congress, International and National Conferences (KOBICINC 2020) (pp 523-528) 55 Ruiz-Garcia, C., Bejar, V., Martinez-Checa, F., Llamas, I., & Quesada, E (2005) Bacillus velezensis sp nov., a surfactant-producing bacterium isolated from the river Velez in Malaga, southern Spain International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55(1), 191-195 56 Sahni T K.and Dr Goel A (2015) Microbial enzymes with special reference to αamylase BioEvolution, 19-25 57 Sánchez, A S., Silva, Y L., Kalid, R A., Cohim, E., & Torres, E A (2017) Waste biorefineries for the cassava starch industry: New trends and review of alternatives Renewable and Sustainable Energy Reviews, 73, 1265-1275 58 Sankaranarayanan, A., & Gowthami, M (2015) Cyanide degradation by consortium of bacterial species isolated from sago industry effluent J Environ Treat Tech, 38(1), 4146 59 Scholten, R., C van der Peet-Schwering, L den Hartog, M Balk, J Schrama and M Verstegen (2002) Fermented wheat in liquid diets: Effects on gastrointestinal characteristics in weanling piglets Journal of animal science 80(5): 1179-1186 60 Smith, T., S Blackman and S Foster (2000) Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple functions Microbiology 146(2): 249-262 61 Suman S and Ramesh K (2010) Production of a thermostable extracellular amylase from thermophilic Bacillus species Journal of Pharmaceutical, 2(2), 149-154 62 Sundarram, A and T Murthy (2014) α-amylase production and applications: a review Journal of Applied & Environmental Microbiology 2(4): 166-175 63 Thirabunyanon, M and N Thongwittaya (2012) Protection activity of a novel probiotic strain of Bacillus subtilis against Salmonella Enteritidis infection Research in veterinary science 93(1): 74-81 64 Tsuge, K., T Akiyama and M Shoda (2001) Cloning, sequencing, and characterization of the iturin A operon Journal of bacteriology 183(21): 6265-6273 65 Versino, F., Urriza, M., & García, M A (2019) Eco-compatible cassava starch films for fertilizer controlled-release International journal of biological macromolecules, 134, 302-307 66 Vu, T H N., Quach, N T., Nguyen, N A., Nguyen, H T., Ngo, C C., Nguyen, T D., & Phi, Q T (2021) Genome mining associated with analysis of structure, antioxidant activity reveals the potential production of levan-rich exopolysaccharides by foodderived Bacillus velezensis VTX20 Applied Sciences, 11(15), 7055 51 67 Wongskeo, P., Rangsunvigit, P., & Chavadej, S (2012) Production of glucose from the hydrolysis of cassava residue using bacteria isolates from thai higher termites J Word Acad Sci Eng Technol, 64, 353-35 68 Wongskeo, P., Rangsunvigit, P., & Chavadej, S (2012) Production of glucose from the hydrolysis of cassava residue using bacteria isolates from thai higher termites J Word Acad Sci Eng Technol, 64, 353-35 69 Ye, M., Tang, X., Yang, R., Zhang, H., Li, F., Tao, F., & Wang, Z (2018) Characteristics and application of a novel species of Bacillus: Bacillus velezensis ACS chemical biology, 13(3), 500-505 70 Ye, X., Li, P., Yu, Q., & Yang, Q (2013) Bacillus subtilis inhibition of enterotoxic Escherichia coli-induced activation of MAPK signaling pathways in Caco-2 cells Annals of microbiology, 63(2), 577-581 71 Yeh, R H., Hsieh, C W., & Chen, K L (2018) Screening lactic acid bacteria to manufacture two-stage fermented feed and pelleting to investigate the feeding effect on broilers Poultry science, 97(1), 236-246 72 Zhang, N., Yang, D., Wang, D., Miao, Y., Shao, J., Zhou, X., & Zhang, R (2015) Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates BMC genomics, 16(1), 1-20 52 PHỤ LỤC Trình tự gen 16S chủng BCH6 LOCUS ORIGIN EMBOSS_001 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 GGCGGCGGCC GGCGGACGGG CCGGGGCTAA GCTACCACTT AGGCGACGAT CCAGACTCCT GCAACGCCGC AAGTGCCGTT ACGTGCCAGC AAGGGCTCGC TCATTGGAAA GAAATGCGTA ACGCTGAGGA TAAACGATGA AAGCACTCCG CGCACAAACG TG 962 bp TATACATGCA TGAGTAACAC TACCGGATGG ACAGATGGAC GCGTAGCCGA ACGGGAGGCA GTGAGTGATG CAAATAGGGC AGCCGCGGTA AGGCGGTTTC CTGGGGAACT GAGATGTGGA GCGAAAGCGT GTGCTAAGTG CCTGGGGAGT GTGGAACATG AGTCGAGCGG GTGGGTAACC TTGTCTGAAC CCGCGGCGCA CCTGAGAGGG GCAGTAGGGA AAGGTTTTCG GGCACCTTGA ATACGTAGGT TTAAGTCTGA TGAGTGCAGA GGAACACCAG GGGGAGCGAA TTAGGGGGTT ACGGTCGCAA TGGTTTATTT DNA ACAGATGGGA TGCCTGTAAG CGCATGGTTC TTAGCTAGTT TGATCGGCCA ATCTTCCGCA GATCGTAAAG CGGTACCTAA GGCAAGCGTT TGTGAAAGCC AGAGGAGAGT TGGCGAAGGC CAGGATTAGA TCCGCCCCTT GACTGAAACT CGAAGCAACG linear UNC 04-JUL-2022 GCTTGCTCCC ACTGGGATAA AGACATAAAA GGTGAGGTAA CACTGGGACT ATGGACGAAA CTCTGTTGTT CCAGAAAGCC GTCCGGAATT CCCGGCTCAA GGAATTCCAC GACTCTCTGG TACCCTGGTA AGTGCTGCAG CAAAGGAATT CGAAAAACCT TGATGTTAGC CTCCGGGAAA GGTGGCTTCG CGGCTCACCA GAGACACGGC GTCTGACGGA AGGGAAGAAC ACGGCTAACT ATTGGGCGTA CCGGGGAGGG GTGTAGCGGT TCTGTAACTG GTCCACGCCG CTAACGCATT GACGGNGGCC TACCAGGTCT // Bảng 1: Các chủng vi khuẩn phân lập từ bã thải sắn Hà Nội STT Kí hiệu chủng BWH1 Mơ tả Trắng ngà, trịn khơng đều, nhăn ẩm, bên đậm màu, viềm mờ cưa BWH2 Trắng kem, trơn bóng, tròn đều, mép tròn BWH3 Trắng ngà, tròn đều, nhăn ướt, mép không mờ BWH4 Trắng ngà, khơng trịn đều, trơn ẩm, viền tròn BWH5 Trắng ngà đậm, nhăn ẩm, trịn khơng đều, mép cưa BWH6 Kem, trịn đều, trơn bóng, mép BWH7 0,1 BWH8 Trắng ngà trong, nhăn ẩm, trịn khơng đều, viền sóng Trắng ngà trong, trơn bóng, trịn khơng đều, viền cưa BCH1 Trịn khơng đều, trơn bóng, viền trịn 0,1 10 BCH2 Trịn, trơn, đậm, mép mờ lan rộng 0,3 11 BCH3 Trịn khơng đều, mép cưa, 0,1 12 BCH4 Trịn khơng đều, mờ dần phí mép 0,1 13 BCH5 14 BCH6 Trịn khơng đều, trắng ngà, trơn, viền sóng Trịn khơng đều, màu trắng sữa, bề mặt nhăn thô, viền cưa 53 Kích thước (mm) 0,2 0,5 Hình 1: Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng BCH6 Hình 2: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng BCH6 54 Hình 3: Khả đồng hóa nguồn cacbon Hình 4: Khả đồng hóa nguồn nito 55