Nghiên cứu tuyển chọn chủng bacillus có hoạt tính diệt sâu từ đất

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS CĨ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU TỪ ĐẤT” HÀ NỘI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS CĨ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU TỪ ĐẤT ” Người thực : BÙI THỊ QUÝ Mã sinh viên : 639739 Lớp : KHMTA Khóa : 63 Giảng viên hướng dẫn : ThS NGUYỄN THỊ KHÁNH HUYỀN Địa điểm thực tập : HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn tận tình giáo Th.S Nguyễn Thị Khánh Huyền Các số liệu kết nêu khóa luận chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Các số liệu trích dẫn Khóa luận đảm bảo tính xác, tin cậy trung thực Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh cố gắng thân em nhận nhiều đỡ, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến giúp đỡ Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo, thầy cô môn Vi sinh vật khoa Tài nguyên môi trường giúp đỡ em hồn thành luận văn khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô T.S Nguyễn Thị Khánh Huyền giảng viên môn Vi sinh vật khoa Tài nguyên mơi trường dạy hướng dẫn tận tình em suốt q trình thực luận văn khóa luận tốt nghiệp em Cuối em xin gửi lời cảm ơn trân thành đến quý thầy ngành khoa học Mơi trường tồn thể quý thầy cô khoa Tài nguyên môi trường dạy dỗ truyền đạt kiến thức quan trọng đầy bổ ích thời gian em học tập Học viện nông nghiệp Việt Nam Với hạn chế trình độ thân hạn chế mặt thời gian nên luận văn không tránh khỏi thiếu sót q trình làm, mong nhận đóng góp, ý kiến quý báu để khóa luận hồn thiện ý nghĩa Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu! Hà Nội, ngày.….tháng …năm2022 Sinh viên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng sử dụng thuốc BVTV Việt Nam 1.2 Tổng quan thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis 1.2.1 Đặc điểm đặc tính độc tố Bacillus Thuringiensis 1.2.2 Cơ chế gây độc Bacillus thuringiensis Vai trò thuốc trừ sâu sinh học sản xuất nông nghiệp bảo vệ môi trường 10 1.4 Nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học nước 13 1.3.1 Nghiên cứu giới 13 1.3.2 Nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Phạm vi nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Đối tượng nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 18 2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 19 iii 2.4.3 Xác định hoạt tính diệt sâu 20 2.4.4 Đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn 21 2.4.5 Phương pháp đếm khuẩn lạc 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 Phân lập vi khuẩn 24 3.2 Kết đánh giá hoạt lực diệt sâu vi khuẩn 27 3.3 Đặc tính sinh học chủng vi khuẩn 29 3.3.1 Kết đánh giá khả enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 29 3.3.2 Kết xác định thời gian mọc chủng vi khuẩn phân lập 30 3.3.3 Kết xác định nhiệt độ thích hợp để ni cấy vi khuẩn 31 3.3.4 Kết xác định khoảng pH thích hợp với chủng vi khuẩn 33 3.3.5 Kết đánh giá khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 34 3.3.6 Kết đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn 36 3.4 Kết phân lập tuyển chọn vi khuẩn 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 DANH MỤC THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 43 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 43 PHỤ LỤC 2: ĐỀ CƯƠNG KHOÁ LUẬN 44 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng thành phần môi trường Bacillus 19 Bảng 2.2 Bảng thành phần môi trường enzyme 21 Bảng 3.1: Đặc điểm chủng VK phân lập 25 Bảng 3.2: Hoạt lực diệt sâu chủng vi khuẩn 27 Bảng 3.3: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng VK 29 Bảng 3.4: Mật độ vi khuẩn thời gian nuôi cấy khác 30 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng vi khuẩn 32 Bảng 3.6: Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng vi khuẩn 33 Bảng 3.7: Ảnh hưởng kháng sinh đến chuẩn vi sinh vật 35 Bảng 3.8: Kết tuyển chọn chủng vi sinh vật 37 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Q trình tinh thể độc vào ruột sâu chuyển hóa thành độc tố 10 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc số chủng VK phân lập 24 Hình 3.2: Khả diệt sâu chủng vi khuẩn 28 Hình 3.3: Sâu chết nhiễm độc từ chủng VK 28 Hình 3.4: Vịng phân giải tinh bột, cellulose, protein chủng VK 30 Hình 3.5: Phát triển chủng B1A theo thời gian 31 Hình 3.6: Mật độ khuẩn lạc chủng B1A khoảng nhiệt độ 32 Hình 3.7: Khả thích ứng với pH chủng B5C B6C 34 Hình 3.8: Khả thích ứng với pHcủa chủng B1A 34 Hình 3.9: Khả kháng KS 500 mg/l chủng VK 35 Hình 3.10: Tác động chủng VK lên hình thành vết bệnh mẫu rau 36 Hình 3.11: Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào B1A 37 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cs Cộng VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn SXNN Sản xuất nông nghiệp TTĐT Thông tin điện tử CNSH Công nghệ sinh học BVTV Bảo vệ thực vật Bt Bacillus Thuringiensis ATSH An toàn sinh học KS Kháng sinh vii TĨM TẮT KHĨA LUẬN Trồng trọt ln giữ vị trí quan trọng sản xuất nơng nơng nghiệp phát triển kinh tế đất nước Tuy nhiên việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật hóa học môt nguyên nhân dẫn tới cân sinh thái nông nghiêp, ô nhiễm môi trường, chất lượng nông sản ảnh hưởng đến sức khỏe người Chính vậy, đề tài tập trung vào phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính diệt sâu từ đất để làm giống sản xuất chể phẩm sinh học diệt sâu thay cho thuốc trừ sâu hóa học Từ mẫu đất, mẫu rau đề tài phân lập 18 chủng vi sinh vật, có chủng có đặc điểm hình thái gần với chi Bacillus bào gồm chủng B1A, B4B, B3C, B4C, B5C, B6C Đa số chủng thuộc nhóm mọc nhanh (khuẩn lạc xuất sau 24 giờ) Tiến hành đánh thử hoạt lực diệt sâu chủng kết thu có chủng chọn có hoạt tính diệt sâu đạt u cầu chủng B1A, B5C, B6C (từ 80% trở lên) Tiếp tục đánh giá đặc điểm sinh học chủng chủng sinh trưởng phát triển tốt khoảng nhiệt từ 30 - 40°C, khả thích ứng với kháng sinh rộng (4-8), khả kháng kháng sinh mức trung bình (300 - 500 mg/L) Đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng cho kết chủng B5C B6C gây bệnh cho rau củ (làm khoai tây bị thối nhũn), có chủng B1A đảm bảo an tồn sinh học Vì đề tài tuyển chọn chủng B1A để bảo quản lưu trữ giống phục vụ cho nghiên cứu tương lai viii PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 43 PHỤ LỤC 2: ĐỀ CƯƠNG KHỐ LUẬN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS CĨ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU TỪ ĐẤT Người thực : Bùi Thị Quý Mã sinh viên : 639739 Lớp : K63KHMTA Khóa : 63 Giảng viên hướng dẫn : Th.S Nguyễn Thị Khánh Huyền Địa điểm thực tập : Bộ môn Vi sinh vật - Học viện nông ngiệp Việt Nam Hà Nội, 2022 44 Họ tên sinh viên: Bùi Thị Quý Tel: 0338900596 Email: quyb1331@gmail.com Chuyên ngành: Khoa học mơi trường Lớp: K63KHMTA Khố: 63 Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Khánh Huyền Tel: 0985020690 Email: ntkhuyen@vnua.edu.vn Tên đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus từ đất có hoạt tính diệt sâu Loại đề tài: Đề tài điều tra Đề tài khoa học thực nghiệm Địa điểm thực hiện: Bộ môn Vi sinh vật - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Người thực (Ký ghi rõ họ tên) Bùi Thị Quý 45 MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Nơng nghiệp ngành kinh tế chính, giữ vai trị làm tảng phát triển kinh tế - xã hội Việt Nam Trong đó, ngành trồng trọt chiếm vị trí quan trọng sản xuất nơng nghiệp, với nhiệm vụ cung cấp lương thực thực phẩm cho người, nguyên liệu cho ngành chế biến, phát triển chăn nuôi Giá trị sản xuất ngành trồng trọt chiếm từ 64 - 68% giá trị sản xuất toàn ngành nơng nghiệp, rau màu có diện tích khoảng 1,12 triệu đạt sản lượng 18,6 triệu tấn/năm(Tổng Cục thống kê, 1/1/2022) Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) hóa học trồng trọt nói chung trồng rau nói riêng diễn ngày nhiều ảnh gây hậu qủa vô nghiêm trọng đến chất lượng môi trường sức khỏe người Bên cạnh việc sử dụng thuốc BVTV hóa học cịn làm chết lồi thiên địch có lợi cho trồng, làm gia tăng tỉ lệ sâu bệnh từ gây cân sinh thái đe dọa đến nông nghiệp bền vững Mặt khác, việc lạm dụng loại thuốc BVTV hóa học cịn dẫn đến việc sản phẩm nơng nghiệp có chứa dư lượng hóa chất cao ngun nhân khiến hàng hóa nơng nghiệp nước ta không đáp ứng tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm nước giới Hiện nay, vấn đề quản lý sử dụng thuốc BVTV nhiều tồn bất cập người dân có kiến thức hạn chế loại hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật dẫn tới tình trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thiếu hiệu an toàn, làm tăng chi phí sản xuất nguy an tồn thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe môi trường Theo đánh giá chuyên gia quốc tế, có tới 80% thuốc BVTV Việt Nam sử dụng không cách, không cần thiết lãng phí 30% người dân sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không quy định không đảm bảo lượng nước, khơng có bảo hộ lao động, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không nồng độ Để tránh dịch bệnh lây lan, nhà nông thường xuyên sử dụng thuốc trừ sâu 46 liệu pháp dập dịch nhanh chóng mà khơng nghĩ đến hậu lâu dài (Báo Nam định, 5/7/2019) Hiện tỷ lệ thuốc BVTV sinh học sử dụng chiếm khoảng 5% so với tổng lượng thuốc BVTV hàng năm ( Lê Xuân Định, 2015) Trong việc sử dụng sản phẩm sinh học thay sản phẩm hóa học BVTV phương án lâu dài ưu tiên áp dụng phát triển nông nghiệp bền vững Thuốc trừ sâu sinh học chế phẩm sinh học có vi sinh vật chất có nguồn gốc từ vi sinh vật, động vật, thực vật làm hoạt chất, dùng để phịng trừ trùng gây hại cho trồng Các chế phẩm sinh học vô hại thể người sinh vật có ích, đồng thời đảm bảo cân sinh học tự nhiên Theo nghiên cứu Võ Minh Phát (2010), Bacillus thuringiensis (Bt) tác nhân sinh học nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh giới, sản phẩm tiếng giới Vi khuẩn Bacilius với hoạt lực diệu sâu hiệu quả: sau xâm nhập vào ấu trùng sâu qua đường tiêu hóa, protein Bt hoạt hóa tác động mơi trường kiềm ruột côn trùng, chọc thủng ruột gây nên tổn thương làm chúng ngừng ăn Kết sâu chết sau vài ngày Với khả sản sinh protein độc tố có khả diệt sâu Các chế phẩm sinh học từ Bt sử dụng rộng rãi nông nghiệp, đem lại hiệu cao thân thiện với môi trường Từ lí tơi tiến hành nghiên cứu thực đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính diệt sâu từ đất” Mục tiêu nghiên cứu đề tài Tuyển chọn 1-2 chủng vi khuẩn có khả diệt sâu 47 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng sử dụng thuốc BVTV Việt Nam 1.2.Tổng quan thuốc trừ sâu sinh học Bt 1.2.1 Đặc điểm đặc tính độc tố Bacillus thuringiensis 1.2.2.Cơ chế gây độc Bacillus thuringiensis Vai trò thuốc trừ sâu sinh học sản xuất nông nghiệp bảo vệ môi trường 1.4 Nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học nước 1.3.1 Nghiên cứu giới 1.3.2 Nghiên cứu nước 48 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi nghiên cứu không gian: môn Vi sinh vật, Khoa Tài nguyên Môi trường - Phạm vi nghiên cứu thời gian: từ tháng 1/2022 đến tháng 6/2022 - Giới hạn nội dung: Nghiên cứu hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) vi khuẩn Bacillus phân lập từ số mẫu đất trồng rau mầu 2.3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus - Đánh giá khả diệt sâu tơ chủng vi khuẩn phân lập - Đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Vi khuẩn Bacillus - Sâu tơ (Plutella xylostella) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu đất lấy theo tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7538-06:2010 (ISO 10381-6:2009) Chất lượng đất - Lấy mẫu - Hướng dẫn thu thập xử lý bảo quản mẫu đất điều kiện hiếu khí để đánh giá qáu trình hoạt động, sinh khối tính đa dạng vi sinh vật phịng thí nghiệm Mẫu đất mẫu rau lấy khu thí nghiệm khoa Tài nguyên môi trường, Học viện nông nghiệp Việt Nam Với địa hình phẳng, đất khu vực trồng thực nghiệm loại rau màu theo mùa vụ, trồng ăn dược liệu Đất đất thịt pha cát, có độ kết dính cao, màu mỡ lại canh tác theo hướng nơng nghiệp hữu nên có thành phần vi sinh vật đất cao không tồn dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật hay phân bón hóa hoc Tiến hành thu thập vào hôm thời tiết tạnh ráo, đất không bị ngập nước không bị khô hạn 49 Phần mẫu đất cách bề mặt5 cm, gạt bỏ phần rễ cây, sỏi đá lẫn đất Mẫu rau: lấy phần lá, thân, rễ mẫu rau cần thu thập Mẫu rau tươi phát triển bình thường khơng bị chết hay thối hỏng Sau thu thập đủ mẫu, bảo quản túi zip sử dụng sau vừa lấy 2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Phân lập vi sinh vật theo phương pháp pha lỗng Koch, ni cấy mơi trường chun tính bán rắn Chuẩn bị dãy pha loãng Mẫu đất sau lấy lọc, rây qua dụng cụ để loại bỏ rễ cây, sỏi đá lẫn đất.Với 10g đất đem pha với 90ml nước cất vơ trùng Sau đem lắc lắc 30 phút tốc độ lắc để lắng 30 phút Tiếp tục pha loãng đến nồng nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Chuẩn bị môi trường Để thực nghiên cứu, sử dụng môi trường Bt để nuôi cấy Bảng 2.1Thành phần môt trường bt Môi trường Nuôi cấy Bt Thành phần Định lượng Thạch 20g Peptone 10g Cao nấm men 10g Nước cất 1000 ml Cấy mẫu: Hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng nồng độ nhỏ vào đĩa petri có mơi trường Bt dạng rắn Dùng que chang thủy tinh khử trùng trải dịch cấy khắp mặt thạch Sau đó, tiếp tục sử dụng que chang gạt mẫu cho khắp mặt thạch đĩa petri thứ đĩa thứ Đặt đĩa petri 1, 2, vào tủ nuôi nhiệt độ 28°C xuất khuẩn lạc điển hình 50 Nhận diện phân loại khuẩn lạc phân lập Sau đó, tiến hành tách riêng khuẩn lạc khác làm chủng vi khuẩn Các chủng phân lập làm môi trường chuyên tính tương ứng theo phương pháp cấy ria pha môi trường bán rắn, giữ giống môi trường thạch nghiêng 4°C Tiến hành sàng lọc ban đầu thông qua việc nhuộm tế bào quan sát hình thái VSV qua kính hiển vi 2.4.3 Xác định hoạt tính diệt sâu Phương pháp thử hoạt tính diệt dựa theo TCCS-09:2010/BVTV thuốc BVTV chứa vi khuẩn Bacillus Thuringiensis – Yêu cầu kỹ thuật phương pháp thử nghiệm Để thử hoạt tính diệt sâu chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn môi trường nuôi cấy Bacillus lỏng 30°C, lắc 150 vịng/phút 40h Sau đó, xử lý mẫu 70°C vòng 10 phút Tiếp theo, tiến hành pha loãng dịch lên men chủng vi khuẩn đạt đến nồng độ 109 bào tử/ml Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu bố trí đĩa Petri, đĩa 10 sâu (tương đối đồng kích thước, tuổi) tiến hành lặp lại lần (Dương Kim Hà cs, 2019) Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24h, 48h 72h (tính theo cơng thức Abbott): E (%) = (C – T)/C*100 Trong đó: - E: Tỷ lệ (%) sâu chết - C: Số sâu sống lô đối chứng - T: Số sâu sống lô thí nghiệm Nếu hiệu lực sâu chết tối đa ngày đạt 80% đạt yêu cầu 2.4.4 Đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn - Hoạt tính enzyme: Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (William, 1983; Balouiri, M cs, 2016) 51 Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với vịng que cấy chứa vi sinh vật, đưa lên máy lắc 150 vòng/phút Sau 72 vi sinh vật, dịch nuôi cấy đánh giá hoạt tính sinh enzym phân giải chất hữu Chuẩn bị mơi trường: Đánh giá hoạt tính loại enzym Amylase, cellulose, Protease vi sinh vật Thành phần môi trường thể Bảng 2.2 Bảng 2.2:Thành phần mơi trường enzyme Enzym Hóa Amylase Cellulose Protease Tinh bột Thạch CMC Thạch Getalyl Thạch 0,2% 2% 0,3% 2% 0,2% 2% chất Định lượng - Thời gian nuôi cấy: Bổ sung 1ml dịch vi khuẩn chuẩn bị tương tự phần phương pháp lựa chọn môi trường ni cấy vào ống nghiệm có chứa 9ml mơi trường thích hợp đem ni 30oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, sau 24 giờ, 48giờ, 72 giờ, xác định mật độ tế bào Kết xác định thời gian ni cấy thích hợp để thực nghiên cứu Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc - Nhiệt độ nuôi cấy: Bổ sung 1ml dịch vi khuẩn chuẩn bị tương tự phần vào ống nghiệm có chứa 9ml mơi trường thích hợp đem ni lắc 150 vịng/phút, với thời gian thích hợp nhất, nhiệt độ: 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C 40°C Sau xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc Kết xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp để thực nghiên cứu - Xác định pH mơi trường thích hợp: vi khuẩn ni cấy với thời gian, nhiệt độ thích hợp tìm thấy thí nghiệm ni lắc 150 52 vịng/phút mơi trường phù hợp có pH từ đến 8; Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc - Khả kháng kháng sinh: Chuẩn bị môi trường Bt dạng bán rắn bổ sung thêm kháng sinh Streptomycin nồng độ: 0, 300, 500, 600, 800, 1000 mg/L mơi trường Chuẩn bị dãy pha lỗng VSV: lấy vịng que cấy cho vào 9ml nước vơ trùng nồng độ 10-1, pha loãng đến nồng độ 10-6, lắc Tiến hành chang VSV với thể tích cấy 0,05 mlở nồng độ 10-6 Đem nuôi 37°C Sau xác định mật độ vi sinh vật sau khoảng 72 - 96 nuôi cấy - Đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn: Mẫu rau, củ, lựa chọn bao gồm: rau bắp cải, cải thìa, cà rốt, khoai tây, hành tây, mẫu đảm bảo tươi lấy từ mẫu khỏe mạnh Sau rửa ngâm dung dịch nước dịch NaClO 1% phút, rửa lại nước vô trùng; làm khô mẫu giấy hút ẩm đặt đĩa petri; Dùng kim tiêm cấy trích chủng vi khuẩn thử nghiệm lên mơ thực vật để nhiệt độ phòng; Theo dõi hình thành vết bệnh sau 24 - 48h so sánh với đối chứng không nhiễm 2.4.5 Phương pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị dãy pha loãng đến nồng độ 10-6 Hút 50µL dịch vi khuẩn (ở nồng độ 10-4,10-5,10-6) nhỏ lên môi trường bán rắn, chang dịch vi khuẩn bề mặt môi trường Nuôi 30oC, vịng 24 - 48h (ni đến xuất khuẩn lạc điển hình vi khuẩn) Sau đó, thực đếm khuẩn lạc xác định mật độ vi khuẩn Mật độ vi khuẩn tính theo cơng thức: Tính số lượng vi khuẩn (CFU) ml gram mẫu cách chia số lượng khuẩn lạc cho hệ số pha lỗng CFU/ml, (CFU/g) tính cơng thức: 53 A (CFU/g hay CFU/ml) = n/V*10-x Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu n: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn 10-x: nồng độ pha lỗng V: thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml)2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu 2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu thu thập, nghiên cứu tổng hợp xử lý phần mềm excel 54 CHƯƠNG III DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus Đánh giá khả diệt sâu tơ chủng vi khuẩn Bacillus phân lập Đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn Bacillus 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Báo Nam Định (2019) Báo động tình trạng thuốc BVTV nước ta nay.http://baonamdinh.com.vn/channel/5097/201907/bao-dong-tinh-trang-lam-dungthuoc-bao-ve-thuc-vat-o-nuoc-ta-hien-nay-2531680/index.htm Cục Thông tin Khoa học Công nghệ quốc gia (2015) Tổng luận: Thuốc trừ sâu sinh học hướng tới nông nghiệp bền vững Nguyễn Thiện Phú & Trần Thanh Thủy (2013) Phân lập, tuyển chon Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu Tạp chí Khoa học ĐHSP TPHCM số TS Trần Minh Chí & Mà Song Nguyễn (2016) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải mặn Biên soạn: Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP HCM Viện hàn Lâm Khoa học Việt Nam (05/10/2010) 35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam Truy cập từ https://vast.gov.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/35-nam-nghien-cuu-va-phat-trien-thuoctru-sau-sinh-hoc-bacillus-thuringiensis-tai-viet-nam-2291-463.htmlngày 15/1/2022 Trung tâm kiến thức toàn cầu trồng CNSH (2006) Công nghệ Bt kháng côn trùng (Pocke6) Tài liệu tiếng Anh Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S K (2016) Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of pharmaceutical analysis, 6(2), 71- 56 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU STT Nội dung Chuẩn bị đề cương Bảo vệ đề cương Tiến hành khóa luận,lập kế hoạch Báo cáo tiến độ Xử lí số liệu,viết khóa luận Nộp khóa luận Báo cáo khóa luận Thời gian thực 13/1-19/1/2022 20/1/2022 Tháng 2-Tháng6/2021 4/2022 3/2022-6/2022 13/06/2022 29/06/2022 Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực đề tài (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) Bùi Thị Quý 57