MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN DANH MỰC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG LỜI MỚ ĐẦU 1 PHẦN I TÒNG QUAN TÀI LIỆU 4 1 Tống quan về vi khuan Bacillus thuringiensis 4 1 1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụn.
MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN DANH MỰC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG LỜI MỚ ĐẦU PHẦN I: TÒNG QUAN TÀI LIỆU Tống quan vi khuan Bacillus thuringiensis 1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng cùa Bacillus thuringiensis .4 ỉ ỉ I Lịch sử nghiên cứu ứng dụng cùa B thuringiensis trẽn giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng Bt Việt Nam 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2 1.2.4 Vị tri, đặc diêm hình thái sinh thái học B thuringiensis VỊ trí phân loại Đặc diem hình thái ỉ Đặc diêm sinh hóa Đặc diêm phán loại 10 1.3 Hệ gen cùa vi khuân Bacillus thuringiensis 15 1.4 Đặc diêm gen mã hóa protein độc tố diệt trùng 15 1.5 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng cùa Bacillus thuringiensis 16 1.5.4 Độc tố Cry 16 1.5.5 Độc tố Cyt 19 1.5.6 Độc tố Vip 19 1.6 Cơ che tác động cùa protein tình diệt trùng 19 1.7 Các yen to ánh hưởng đen trình hình thành bào từ tính thê độc vi khuân Bacillus thuringiensis 21 Tống quan đậu tương sâu đục quà đậu tương (Etiella zinckenella) 23 l.Tình hình săn xuất đậu tương sâu đục quà đậu tương giới 23 2.1.1 Tình hình sản xuất dậu tương the giới 23 2.2 Tình hình sân xuất đậu tương sâu đục đậu tương Việt Nam 24 2.2.1 Tình hình sán xuất đậu tương Việt Nam .24 2.2.2 Tình hình sâu hại đậu tương Việt Nam .25 2.2 Phân loại nhận dạng sâu đục quà đậu tương .25 2.2.1 Phán loại: 25 2.2.2 Nhận dạng (đặc diêm hình thái) 25 2.2.2.1 Nhận dạng bị sâu hại 25 2.2.2.2 Đặc diêm nhận dạng (đặc diêm hình thái) sâu đục đậu .26 2.3 Tập tính quy luật phat sinh gáy hại ký chủ sâu đục quà đậu 28 2.3.1 Tập tính quy luật phát sinh gãy hại 28 2.3.2 Thời diêm phát sinh 29 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư 30 2.1 Thời gian, địa điêm đối tượng nghiên cứu 30 2.1.1 Thời gian địa diêm 30 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 30 2.2 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm .30 2.2.1 Hóa chất 30 2.2.2 Trang thiết bị thi nghiệm 30 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Phương pháp xác định tông số tế bào chủng Bt 32 2.3.2 Nhóm phương pháp ni cay Bacillus thuringiensis .32 2.3.2.1 Phương pháp hoạt hoá 32 2.3.2.2 Phương pháp tăng sinh khối .32 2.3.3 Phương pháp thừ hoạt tỉnh sinh học .33 2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuân Bt 33 2.3.5 Xác dinh gen mã hóa protein dộc tố cùa chúng Bt bang kỹ thuật PCR 34 2.3.6 Phương pháp điện di DNA gel agarose 36 2.3.7 Phương pháp phân loại typ huyết 37 PHÀN 111: KÉT QUẢ VÀ THÁO LUẬN 39 3.1 .Kết quà hoạt hóa lên men chùng Bt từ Bộ sưu tập Bt Việt Nam: .39 3.2 Kết quà thử hoạt tính diệt sâu đục quà đậu tương cùa chủng Bacillus thuringiensis 44 3.3 Kết khảo sát gen mã hóa protein độc tố diệt sâu chùng B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tưong cao .46 3.4 Phân loại loài chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao lyp huyết 48 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHÁO 51 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Mơ hình cấu trúc chung protein tinh độc tố Cry .17 Hình 1.2: Cơ chế tác động protein tinh độc lên trùng 20 Hình 1.3 Quả đậu tương bị sâu Etiella zinckenella hại .26 Hình 1.4 Ngài trưởng thành sâu Etielỉa zinckenella .27 Hình 1.5 Trứng sâu Etiella zinckenella 27 Hình 1.6: Sâu non Etieỉla zinckenella 28 Hình 3.1: Tăng sinh chủng Bacillus thuríngiensis máy lắc ổn nhiệt 44 Hình 3.2: Một số chủng Bacillus thuringiensis sau 72 lên men 44 Hình 3.3: Hình ảnh thử nghiệm hoạt tính diệt sâu đục quă đậu tuông cùa chủng Bt nghiên cứu 45 Hình 3.4 Thử hoạt tính diệt đục đậu tưong chủng SP10.6 SP13.9 .46 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm PCR gel agarrose 1% .47 Hình 3.6: Hình dạng tinh thể chủng SP10.6 SP13.9 kính hiển vi quang học độ phóng đại 100 lần 48 Hình 3.7: Sản phẩm ngưng kết huyết chủng SP10.6 SP13 dưói kính hiển vi quang hục độ phóng đại 100 lần 49 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao H 11 Bảng 1.2 Đặc điếm số protein độc tố Cry 18 Bảng 2.1: Trình tự mồi khuếch đại số gen nhóm cryl 35 Bảng 3.1: Kết quă hoạt hóa tăng sinh khối chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 39 Bảng 3.2: Hoạt tính diệt sâu đục đậu tương chủng Bt sau 72 giò'thử nghiệm 45 DANH MỤC NHỮNG CHŨ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleotide Bp Base pair Bt Bacillus thuringỉensỉs dH2O Nước khử ion dNTP deoxyribonucleotide 5’ - triphosphate LB Luria-Bertani PCR Polymcraza Chair reaction SDS Sodium đoecyl sulphat SOL Solution TAE Tri- acid acetic EDTA LỜI MỞ ĐÀU Đậu tương nhóm trồng quan trọng hàng đầu giới Đây loại trồng có tác dụng việc luân xen canh, cải tạo đất hiệu Trong sán lượng đậu tương giảm đáng kể 10 năm trờ lại đây, từ mức xấp xi 0,3 triệu năm 2005 xuống 0,2 triệu năm 2014 nhu cầu đậu tương nước lại tăng đột biến, yếu phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi, khiến lượng đậu tương nhập tăng cao (khoảng 1,2-1,5 triệu năm gần đây) Những số cho thấy thị trường tiềm cho sản xuất đậu tương nước cao Tuy nhiên hình thức sán xuất nhỏ lé, thiếu tập trung, khó giới hố, tự động hố nên giá thành đậu tương nước khó cạnh tranh với đậu tương giới Năng suất đậu tương trung bình cùa Việt Nam thấp, dao động khoảng 1415 tạ/ha, so với the giới (Hoa kỳ ~24 tạ/ha) Các yếu tố ảnh hưởng đến suất yếu bao gồm cỏ dại Năng suất giám 37% cỏ dại, 11% loại mầm bệnh, 1% virus 11% sâu hại Mức giâm cỏ dại thay đổi không lớn khu vực (35-40%), nhiên mức thiệt hại mầm bệnh sâu hại cao, tương ứng dao động 7-16% mầm bệnh 4-20% sâu hại khác biệt sâu hại vùng, miền (Ocrkc, 2006) Thiệt hại sâu bệnh chi phí bảo vệ thực vật hạn chế đáng kể suất cạnh tranh cúa đậu tương sàn xuất nước Việc phát triển giống đậu tương có khả kháng sâu tốt góp phần tăng suất đậu tương đồng thời giám ánh hưởng cùa việc sử dụng thuốc trừ sâu đến môi trường sức khoé người Nhiều biện pháp khác thực nhằm hạn chế tần phá sâu bệnh Một nhũng biện pháp dượng sử dụng rộng rãi sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Bên cạnh lợi ích cúa thuốc trừ sâu hóa học đcm lại trừ sâu bệnh nhanh chóng phạm vi rộng lớn cịn bộc lộ hạn chế như: chúng tiêu diệt trùng có ích vi sinh vật ký sinh sâu bọ có hại, gây độc cho người, động vật, phá húy cân sinh thái, môi trường Xa sâu bệnh kháng lại ta sử dụng loại thuốc hóa học nhiều lần Do biện pháp an toàn hiệu dùng thuốc trừ sâu sinh học, chúng có tác dụng tiêu diệt hiệu quà mầm bệnh, lại vừa thân thiện với người, môi trường sinh thái Trong vòng 100 năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis đối tượng nghiên cứu nhiều số tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng Hiện nay, chế phẩm sinh học Bt diệt côn trùng chiếm tới 90% thị trường thuốc trừ sâu sinh học Tìr gcn mã hoá protein tinh the diệt sâu Bt tách dịng đọc trình tự năm 1981 hàng loạt gen mã hóa protein độc tố Bt (cry, vip, cyt) nghiên cứu Năm 1985, thuốc giới chuyền gen cry vi khuẩn Bt đế diệt sâu mờ kỷ nguyên chọn tạo giống trồng biến đổi gen mang tính trạng mong muốn Hiện nay, độc tố Bt bao gồm khoáng 800 gcn mã hố, chúng phân loại thành 80 họ Các loại độc tố cùa Bt khác tính đặc hiệu loại côn trùng thuộc cánh vảy (Lcpidoptcra), hai cánh (Diptera), cánh cứng (Coleoptera), cánh ngửa (Homopera), tuyến trùng (Nematoda) Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu sinh học Bt quan tâm nghiên cứu ứng dụng từ năm 1973, lồi phụ B thuringiensis var kurstakivà B thuringiensis var thuringiensis Đốn nay, có nhiều nghiên cứu phân lập, sàng lọc úng dụng chúng Bt Viêt Nam sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tạo trồng biến đồi gen Tuy nhiên, nghiên cứu Bt diệt sâu dục qua dậu tương chưa có cơng bố Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis địa có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương (Etiella Zinckennellay nhằm tìm kiếm chúng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương cao Tạo nguyên liệu cho trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học diệt sâu đục đậu tương tạo đậu tương mang gen kháng sâu đục đậu tương sau Mục tiêu đề tài: - Sàng lọc chủng Bt địa có hoạt tính cao diệt sâu đục đậu tương - Khảo sát gen mã hóa protein độc tố diệt sâu chủng chọn Nội dung nghiên cứu đề tài: Hoạt hóa lên men chủng Bt từ Bộ sưu tập Bt Việt Nam Thứ hoạt tính diệt sâu đục đậu tương cùa chúng Bt Khảo sát gen mã hóa protein độc tố diệt sâu chùng Bt có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương 111 112 113 SP7.10 SP7.11 SP7.12 Lào Cai Lào Cai Lào Cai 114 SP7.15 Lào Cai 115 SP7.2 Lào Cai 116 SP7.3 Lào Cai 117 SP7.4 Lào Cai 118 SP7.6 Lào Cai 119 SP7.8 Lào Cai 120 SP7.9 Lào Cai 121 SP8.1 Lào Cai 122 SP8.3 Lào Cai 123 SP9.1 Lào Cai 124 SP6.3 Lào Cai SP17.3 Lào Cai 125 126 SP15.7 Lào Cai 127 SP7.2 Lào Cai 128 SP4.1 Lào Cai 129 SP3.3 Lào Cai 130 SP15.3 Lào Cai 131 SP7.4 Lào Cai 132 SP6.4 Lào Cai 133 SP3.1 Lào Cai 134 SP12.1 Lào Cai 135 SP22.16 Lào Cai 136 N4 Lào Cai 72,6.1 0s 61,9.1 0s 24,5.1 0s 15,3.1 0s 25,7.1 0s 12,4.1 0s 53,4.1 0s 23,4.1 0s 23,7.1 0s 23,4.1 0s 26,5.1 0s 36,5.1 0s 7,8.1 0s 6,2.1 0s 35,7.1 s 45,2.1 0s 3,4.1 0s 33,4.1 s 25,4.1 0s 3,5.1 0s 4,4.1 0s 25,3.1 s 4,3.1 0s 4,5.1 0s 15,9.1 0s 26,8.1 0s Hình 3.1: Tăng sinh chủng Bacillus thuringiensis máy lắc ổn nhiệt Hình 3.2: Một số chủng Bacillus thuringiensis sau 72 lên men Từ bảng 3.1 cho ta thấy, 136 chúng nghiên cứu sinh trướng phát triển tốt, nồng độ tế bào đạt > 10s cfu/ml Đảm bảo cho thí nghiệm sau thứ hoạt tính sinh học với sâu đục quà đậu tương 3.2 Kết thù’ hoạt tính diệt sâu đục đậu tuong chủng Bacillus th uringìensis Tiến hành thử hoạt tính diệt sâu 136 chúng Bt tiến hành hoạt hóa xác định mật độ tế bào phần 3.1 phương pháp trình bày phần 2.3.3 Kết ti lệ sâu chết tổng hợp lại báng 3.2, hình 3.3 Bảng 3.2: Hoạt tính diệt sâu đục đậu tuong chủng Bt sau 72 giị- thử nghiệm Hoạt tính diệt sâu (% ) Số chủng có hoạt tính Tỉ lệ ( % ) 0-20 52 38,2 21 -40 40 29,4 41 -60 37 27,2 61 -70 3,72 71 -80 0 81-90 (SP13.9 86.4%) 0,74 91-100 (SP10.6 93,7%) 0,74 Tơng 136 100 Hình 3.3: Hình ảnh thử nghiệm hoạt tính diệt sâu đục đậu tương chủng Bt nghiên cứu Từ bảng 3.2 cho thấy sau 72 thứ hoạt tính, chúng SP10.6 có hoạt tính diệt sâu cao 93,7%; sau chúng SP13.9 với tỉ lệ 86,4% (hình 3.4) Các chúng cịn lại cho ti lệ sâu chết ơn ( 0-20 có 52 chúng chiếm 38,2%; 21-40 có 40 chúng chiếm 29,4%; 41-60 có 37 chúng chiếm 27,2%; 61-70 có chủng chiếm 3,72% ) L -/WW 'I SP10.6 SP13.9 Hình 3.4 Thử hoạt tính diệt đục đậu tương chung SP10.6 SP13.9 Ket sàng lọc cho thấy, chủng SP13.9 SP10.6 chủng có ti lệ sâu chết cao Hai chủng tiếp tục nghiên cứu, khảo sát gcn độc tố protein diệt sâu có chúng 3.3 Kết khảo sát gen mã hóa protein độc tổ diệt sâu cùa chủng thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương cao Các chùng Bt khác có hoạt tính diệt trùng khác Các gen mã hóa protein độc tố khác thường có tính đặc hiệu cho lồi sâu Protein độc tố nhóm Cryl có hoạt tính chống lại lồi thuộc cánh vảy; Nhóm Cry2 có độc tính với cá hai lồi cánh vảy hai cánh; Nhóm Cry3 có hoạt tính chống lại lồi thuộc cánh cứng; Nhóm Cry4 có hoạt tính với lồi thuộc hai cánh [41] Trong đó, sâu đục đậu tưcmg E zinckenella thuộc cánh vẩy (Lcpidoptcra) Vì vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát nhóm gen cryl mã hóa protein độc tố diệt sâu Cryl chủng B thuringiensis SP10.6 SP13.9 có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương cao (trên 85%) Tiến hành tách chiết ADN tổng số chúng SPI3.9 10.6 ADN tách chiết được dùng làm sợi khn đế tiến hành phàn ứng PCR với nhóm cặp mồi đặc hiệu cho gen thuộc nhóm gen cryl( bảng 2.1 ) đề phát gcn cryl theo phương pháp multiplex PCR Tiến hành chạy phán ứng PCR với chu trình nhiệt trình bày phần phương pháp Sản pham PCR kiềm tra phương pháp điện di gel agarose 1% (hình 3.5) 1000 bp - _.cryỉB (830 bp) — cryỉAa (724 pb) 500 bp _cry Ị Ac (487 bp) _cryỉD (414 bp) — cryỉC (288 bp) — cryỉAb (238 bp) 200 bp Hình 3.5: Kết điện di sản phấm PCR gel agarrose 1% (M: Marker; I: chúng SP 13.9; 2: chúng SP10.6) Ket hình 3.4 cho ta thấy chủng SP13.9 SP10.6 mang gen crylAa (724pb), crylAb (238pb), cryỉAc (487pb) Ngồi chủng SP 13.9 cịn mang thêm gen crylB (830pb), crylC (288pb), crylD (414pb) Trong đó, gen crylAc công bố diệt sâu đục đậu tương Etiella zinckeneỉỉa Các gen gen crylAb có the diệt loài sâu cánh vây Maruca vitrata, Spodoptera exỉgua', gen cry ỉ Ac, ỈC diệt loài Etieỉỉa zinckenella, Spodoptera exigua, Spodoptera litura, Omiodes indicata, Helicoverpa armigera, Helicoverpci zea, Pseudoplusia includens (Palma et al., 2012) Ờ Việt Nam chưa có cơng bổ chủng Bt gen mã hóa protein độc tố diệt sâu từ chủng Bt có diệt sâu đục đâu tương 3.4 Phân loại loài chung Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao typ huyết Bacillus thuringiensis có khả sinh tinh thê trinh hình thành bào từ Tinh thề có nhiều hình dạng khác tùy lồi Chính vậy, chúng tơi tiến hành xác định hình thành tinh độc tố cùa chủng SP10.6 SP 13.9 kính hiến vi quang học (hình 3.6) Tinh thồ Tinh SP10.6 SP13.9 Hình 3.6: Hình dạng tinh thể chủng SP10.6 SP13.9 kính hiển vi quang học độ phóng đại 100 lần (1: tế bào, 2: bào tứ, 3: tinh thề) Từ hình 3,5 cho thấy, chúng SP10.6 có sinh tinh thể hình cầu, chúng SP13.9 sinh tinh thê hình lường tháp Hai chủng tiếp tục phân loại loài phương pháp typ huyết Phân loại loài theo phương pháp huyết cùa Barjac Bomefoi chùng nghiên cứu Bacillus thuringiensis chia làm nhiều loài khác nhau, mồi loài mang đặc điềm riêng biệt Đe phân loại loài chúng SP10.6 SP13.9 thử với 55 typ huyết Kct cho thấy, chủng SP10.6 ngưng kết với kháng nguyên H7 tương ứng với loài B.thuringiensis subsp konkukian chúng SP13.9 ngưng kết với kháng nguyên H34 tương ứng với lồi B thuringiensis subsp aizawai (hình 3.7) Hình 3.7: Sản phẩm ngưng kết huyết chung SP10.6 SP139 kính hiển vi quang học độ phóng đại 100 lần (A: Trước nhò huyết thanh, B: Sau nhỏ huyết thanh) Như kết quà sơ cho thấy, từ 136 chủng Bt phân lập Sơn La lào Cai xác định chúng SP10.6 SP13.9 có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương cao > 85% Trong chủng SP10.6 sinh tinh thể hình cầu thuộc lồi Bacillus thuringiensis var kokukian mang gen mã hóa crylAa, cỉylAh, cry Ac Chủng SP13.9 sinh tinh thể hình tháp thuộc loài Bacillus crylAb, crylAc, thuringiensis crylB, var crylC, aizawai crylD Miừng mang kết gen đạt mã hóa crylAa, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt diệt sâu đục đậu tương tạo trồng có khả kháng lại sâu đục đậu tương lai PHẦN IV: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 4.1 KÉT LUẬN: Từ 136 chúng Bacillus thuringiensis phân lập Sơn La lào Cai xác định đuợc chúng có hoạt tính điệt sâu đục đậu tương cao >85% Trong đó, chủng SP10.6 có hoạt tính diệt sâu 93,7% chủng SP13.9 86,4% Đã xác định chúng SP10.6 thuộc loài subsp konkukian, chủng SP13.9 mang thuộc gcn loài độc tố Bacillus diệt sâu thuringiensis Bacillus thuringiensis crylAa, subsp crylAb, aizawai, crylAc mang gen độc tố diệt sâu crylAa, crylAb, cryỉAc, cryỉB, crylC, cryỉD 4.2 KIẾN NGHỊ: Cần nghiên cứu sâu đặc điềm sinh học đặc điếm gen cùa chúng SP10.9 SP13.9 nhằm làm nguyên liệu cho nghiên cứu săn xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt tạo trồng biển đôi gen kháng sâu đục đậu sau TÀI LIỆU THAM KHẢO */ TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban 2006.Công nghệ gen NXB khoa học kỹ thuật Trang 153 Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỳ thuật gcn NXB Khoa học Kỳ thuật Trang 137-140, 206-210 Ngô Đình Bính 2005 Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miền dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 2000-2001 296-303 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringicnsis Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 2000-2001:296-303 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thướng, Phạm Minh Huong, Vì Thị Đoan Chính 1995 Nghiên cứu bảo quản lâu dài chủng giống vi sinh vật Kỷ yếu NXB Khoa học kĩ thuật, trang 378-383 Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng 2003 Phân lập chúng Bacillus thuringicnsis kurstaki Việt Nam Di truyền học ứng dụng, 3, 52-59 Nguyễn Xuân Cảnh,, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính 2004 Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuấn Bacillus Thuringiensis Việt Nam Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghiệp miền núi, Thái Nguyên 2004 NXB KHKT 59-62 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Dặng Hữu Lanh Di truyền, tập NXB Đại học Sư phạm Trang 49-53 */ TÀI LIỆU TIẾNG ANH 10 Barjac, D H & Frachon, E.1990 Classification of Bacillus thuringiensis strains Entomophaga 35, 233-240 11 Barjac, D H 1981 Indcntification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis 36-42 Burges H.D (edited) In microbial control of pests and plant Diseasis 1970- 1980 12 Bernhard, K., p Jarrett, M Meadows, J Butt, D J Ellis, G M Roberts, s Pauli, p Rodgers, and H D Burges 1997 Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests J Invertebr Pathol 70:59-68 13 Bietlot, H p., J p Schernthaner, R E Milne, F R Clairmont, R s Bhella, and H Kaplan 1993 Evidence that the CrylA crystal protein from Bacillus thuringiensis is associated with DNA J Biol Chern 268:82408245 14 Bravo, A 1997 Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis 8- endotoxin family proteins anh their functional domains J Bacterio!., 179, 2793-2801 15 Burges, H D 2001 Bacillus thuringiensis in Pest Control Pesticide Outlook, p 90- 98 16 Carlson, C R., and A.-B Kolsto 1993 A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome J Bacteriol 175:1053-1060 17 Chicott, C N., Wigley, p J 1993 Insecticidal activity of Bacillus thuringicnsis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting, p 43-52 18 Crickmore N, Wheeler VC, Ellar DJ 1994 Use of an opcron fusion to induce expression and crystallization of a Bacillus thuringiensis 8endotoxin encoded by a cryptic gene Mol Gen Genet 242: 365-368 19 Crickmore, N D R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, and D H, Dean 1998 Revision of the 20 nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins Microbiol Mol Biol Rev 62:807-813 21 Dankocsik, c Donovan WP, Jany cs 1990 Activation of a cryptic protein gene of Bacillus thuringicnsis subspecies kurrstaki by gene fusion and determination of the crystal protein insecticidal specificity Mol Microbiol 4: 2087- 2094 22 De Barjac, H.D., E Frachon 1990 Entomophaga, Vol.35 233240 23 Deacon, J The microbial world: Bacillus thuringicnsis www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 24 Donovan, WP, Dankocsik cc, Gilbert MP, Gawron- Burke MC, Groat RG, Carlton BC 1988 Amino acid sequence and entomocidal activity of the P2 crystal protein J Biol Chern 263: 561-567 25 Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, AND AI Aronson 1991 Scqucnsing of an operon containing a novel Ỗ- endotoxin gene from Bacillus thuringiensis FEMS microbial Lctt.81-31-36 26 Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M Diversity of bacillus thuringiensis toxin and genes In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice Dited by P.F Entwistle, J.s Cory, M J bailey andS Higgs 1993,37-60 27 Eugene w Nester, linda s Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002) 100 years of bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with wide spectrum of activities against lepidoptcran insects”, Proc Natl Acad Sci USA 93, 5389-5394 28 Faiza Saleem and Abdul Rauf Shakoori 2010 Characterization of cry2A-type Gene(s) from Pakistani Isolates of Bacillus thuringiensis Toxic to Lepidopteran and Dipteran Insects Pakistan J Zool., vol 42(3), pp 181193 29 Feitelson, J s 1993 The Bacillus thuringiensis family tree, p 6371 In L Kim (cd.), Advanced engineered pesticides Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y 30 Grochulski, p., L Masson, s Borisova, M Pusztai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler 1995 Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation J Mol Biol 254:447-464 31 Kalman, s., K L Kiehne, N Cooper, M s Reynoso, and T Yamamoto 1995 Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes AppL Environ Microbiol 61:3063-3068 32 Kronstad, J w., and H R Whiteley 1986 Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes Gene 43:29-40 33 Lee, M K., Walters, F s., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S 2003 The Mode of Action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of CrylAb S-Endotoxin Appl Environ Microbiol 69: 4648-4657 34 Lee, M K., Walters, F s., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S Shotkoski, F 2003 Vip3A: A novel Insceticidal protein with broad spectrum lepidoteran activity 35 Lereclus, D., G Menou, and M.-M Lecadet 1983 Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faccalis plasmid pAM Mol Gen Genet.l91:307-313 36 Li, J., J Carroll, and D J Ellar 1991 Crystal structure of insecticidal 5- endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Â resolution Nature 353:815-821 37 M-M Lecadet, E Frachon, V Cosmao Dumanoir, Ripouteaus, s Hamon, p Laurent and I Thiery 1999 Updating the H- H 38 antigen classification society of Bacillus thuringiensis for The Applied Microbiology Journal of Applied Microbiology 660:672 39 Moar, W.J., Trumble,J.T., Hice, R.H and Backman, P.A 1994 Insecticidal activity of the CryllA protein from NRD- 12 isolate of Bacillus thuringiensis subsp kurstaki expressed in Escherichia coli an Bacillus thuringiensis and in a leaf- colonizing strain of Bacillus cereus Applied and Environmental Microbiology 60, 896-902 40 Ohba, M., and Aizawa, 1986 K Distribution of Bacillus thuringicnsis in soil of Japan J invertebr Pathol Vol.47, 12-20 41 Ruud A de Maagd, Alejandra Bravo, Neil Crickmore 2001 How Bacillus thuringicnsis has evolved specific toxins to colonize the insect world TRENDS in Genetics, p 193-199, Vol 17, No 42 Shimizu, T., and K Morikawa 1996 The P-prism: a new folding motif Trends Biochcm Sci 21:3-6 43 Takashi thuringicnsis Yamamoto Crystal Proteins: and Gary Recent K Advances Powell in 1993 Bacillus Understanding Its Insecticidal Activity Advanced Engineered Pesticides Edited by Leo Kim Marcel Dekker, Inc., NY 3-42 44 Thiery and E Frachon 1997 Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bacteria Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology A academic press 55-57 45 Windner WR, Whiteley HR 1989 Effect of a 20-kilodalton protein from bacillus thuringicnsis subsp israclcnsis on production of the CytA protein by Escherichia coli J Bacteriol 173: 1748-1756 46 Yamamoto T, McLaughlin RE 1981 Isolation of a protein from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var kurstaki toxic to the mosquito larva, Aedes taeniorhynchus Biochem Biophys Res Commun 103: 414-421; 47 Yamamoto Bacillus thuringicnsis T by 1983 Indentiíĩcation high-performance of liquid entomocidal toxin of chromatography ACS Symp Ser 432:46-60; 2595-2603 48 */ TÀI LIỆU WEBSITE: 49 http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal 50 http://www.impehcm.org.vn/index 51 http://en.wikipedia.org/wiki/Muscidae 52 http://www.promege.com/vectors/ 53 http://www.ptomege.com pGEM- T Easy Vector Systems Technical Manual No 042 Instruction for use of products A1360, Al380, A3600 and A3610 54 l.http://text.l 23doc.org/document/2873778-sau-duc-qua-dau-tuongeticlla-zinckenclla.htm ... thuốc trừ sâu sinh học diệt sâu đục đậu tương tạo đậu tương mang gen kháng sâu đục đậu tương sau Mục tiêu đề tài: - Sàng lọc chủng Bt địa có hoạt tính cao diệt sâu đục đậu tương - Khảo sát gen... có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương (Etiella Zinckennellay nhằm tìm kiếm chúng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tương cao Tạo nguyên liệu cho trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh... gen mã hóa protein độc tố diệt sâu chùng B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tưong cao .46 3.4 Phân loại loài chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao lyp huyết