KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẢI BIẾN VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GEN cry1Ia CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG SÂU ĐỤC QUẢ ĐẬU TƯƠNG Etiella zinkenella Nguyễn Hữu Kiên1, Nguyễn Thị Hòa1, Lê Thị Mai Hương1, Nguyễn Trung Anh1, Nguyễn Tuấn Minh1, Đinh Thị Mai Thu1, Tống Thị Hường1, Đinh Thị Thu Ngần1, Nguyễn Nhất Linh1, Nguyễn Anh Vũ1, Lê Thị Thu Hiền2, Nguyễn Văn Đồng1* TÓM TẮT Đậu tương (Glycine max L.) trồng quan trọng có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, suất chất lượng đậu tương bị ảnh hưởng nghiêm trọng gây hại sâu đục Etiella zinkenella Treitschke Hiện nay, có nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng độc tố Cry tới sâu đục nhiều đối tượng trồng khác nhau, đậu tương hạn chế Trong nghiên cứu này, cải biến thành công gen cry1Ia đồng thời thiết kế cấu trúc vector biểu gen cry1Ia dạng dại cải biến từ chủng Bacillus thuringiensis TH19 phân lập Việt Nam Nghiên cứu cung cấp vật liệu phục vụ cho việc chuyển gen cry1Ia dạng dại cải biến vào đậu tương nhằm tăng khả kháng sâu đục Etiella zinkenella Từ khóa: Bacillus thuringiensis, cry1Ia, đậu tương, Etiella zinkenella, vector pZY101-Asc ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu tương ( Glycine max L.) trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Hạt đậu tương có hàm lượng dầu protein cao nguồn cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thực phẩm thức ăn chăn ni Ngồi ra, đậu tương cịn có khả cải tạo đất hiệu nên ưu tiên công thức luân canh với trồng khác (Erickson, 2008; Morrison et al., 2017; Mourtzinis et al., 2017) Tại Việt Nam, đậu tương thực phẩm có vai trị quan trọng suất cịn thấp, chưa thể đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước Những năm gần đây, diện tích sản lượng đậu tương nước ta có xu hướng giảm mạnh (Gain, 2018; FAOSTAT, 2019) Một nguyên nhân làm ảnh hưởng đến suất chất lượng đậu tương phá hoại sâu, bệnh hại Trong đó, sâu đục Etiella zinkenella Treitschke trùng thuộc cánh vảy (Lepidoptera) biết tới đối tượng phân bố rộng khắp giới gây hại nhiều loài trồng khác nhau, đặc biệt Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Email: dongjircas@yahoo.com đậu tương non nguồn thức ăn ưa thích chúng (Berg et al., 1998) Để đối phó với sâu đục gây hại trồng, phương pháp phòng trừ sâu hại sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, sinh học trùng thiên địch áp dụng phổ biến giới (Kumar et al., 2008; Tabata et al., 2008; USDA, 2012) Trong đó, việc tạo giống trồng có khả kháng sâu nói chung kháng sâu đục nói riêng kỹ thuật di truyền chuyển gen thực vật đặc biệt quan tâm nhằm nâng cao suất, chất lượng hạt giảm mức độ thiệt hại côn trùng; đồng thời khắc phục hạn chế sử dụng biện pháp trừ sâu hóa học biện pháp sinh học truyền thống Hiện nay, có nhiều gen kháng sâu có giá trị để chuyển vào trồng có nguồn gốc từ động vật, thực vật vi sinh vật Trong đó, gen cry phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đối tượng nghiên cứu nhiều số tác nhân gây độc tố trùng Nhóm gen cry1 mã hóa cho protein Cry1 biết tới nhóm gen cry có hoạt tính diệt trùng cánh vảy (Crickmore et al., 2013) Kết nghiên cứu (số liệu chưa công bố) rằng, protein Cry1Ia thu biểu gen cry1Ia vi khun Escherichia coli Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 29 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ (E coli) có khả diệt sâu đục đậu tương điều kiện nhân tạo Trên sở đó, nghiên cứu tiến hành sửa đổi gen cry1Ia dạng dại nhằm tạo tương thích với hệ gen đậu tương thiết kế cấu trúc vector biểu thực vật mang gen cry1Ia dạng dại cải biến để phục vụ cho việc tạo chuyển gen đậu tương có khả kháng sâu đục chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hình Các vector sử dụng Chú thích: A, Cấu trúc vector pRTL2; B, Cấu trúc vector biểu thực vật pZY101-Asc Gen cry1Ia dạng dại nhóm nghiên cứu Viện Nghiên cứu Hệ gen phân lập từ chủng vi khuẩn Bt TH19 Việt Nam nhân dòng vector pJET1.2 Vector pRTL2 pZY101-Asc (Hình 1) Trung tâm Quốc gia Công nghệ sinh học – Trường Đại học Missouri, Hoa Kỳ cung cấp Các cấu trúc vector tách dòng, vector biểu chủng vi khuẩn E coli Top10 lưu giữ Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp 2.2.1 Cải biến gen cry1Ia Tỷ lệ phần trăm ba mã hóa tối ưu cho gen đậu tương trang web (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=3847) sử dụng cho sửa đổi ba mã hóa gen cry1Ia cơng cụ OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/) 2.2.2 Tổng hợp nhân tạo tách dòng gen cry1Ia cải biến Gen cry1Ia cải biến có kích thước 2160 bp chia thành đoạn ngắn ~75 nucleotide tổng hợp frit tổng hợp gen theo công nghệ Cơng ty Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam) Tiếp theo, đoạn DNA gen cry1Ia cải biến khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi 1Iacb-SytF/1Iacb-Syt-R có 25 nucleotide tương đồng với đầu biên vector pUC19 (Bảng 1) enzyme Phusion™TM High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) với điều kiện phản ứng chu trình nhiệt theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh trực tiếp kít PCR Purification (Jena Bioscience, Đức) sử dụng cho phản ứng nối vào vector pUC19 (đã xử lý enzyme giới hạn SmaI trước đó) theo quy trình eClone Cơng ty Sinh hóa Phù Sa, với thành phần phản ứng: Vector pUC19 100 ng, sản phẩm PCR 300 ng, dung dịch đệm eClone 1,5 µlL enzyme eClone 1,0 µL nước cất lần với tổng thể tích 15 µL Phản ứng ủ 37oC 15 phút đặt đá để sử dụng cho biến nạp vào vi khuẩn E coli Top10 theo phương pháp sốc nhiệt trình bày trước (Froger Hall, 2007) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu STT 30 Tên mồi 1Iacb-Syt-F Trình tự (5’-3’) 1Iacb-Syt-R pUC19-F pUC19-R 1Iacb-Seq CCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCTAATAGCGG CCGCATGAAGCTTAAGA TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATAACTCG AGCTACATATTTCTTTCTATGTGT CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC ATTTCACACAGGAAACAGCTATGA GCGTCCATTTTTGGCAAAGAATG 1Iawt-NcoI-F 1Iawt-SmaI-R 1Iacb-NcoI-F GTGCAG CCATGG ATGAAACTAAAGAATC ATATT CCCGGG CTACATGTTACGCTC AATA CCATGG ATGAAGCTTAAGAATC Vai trò Cặp mồi sử dụng cho tổng hợp gen cry1Aa cải biến Cặp mồi vector tách dòng pUC19 Mồi sử dụng cho giải trình tự gen cry1Ia cải biến Cặp mồi cho tách dòng gen cry1Ia dạng dại Cp mi cho tỏch dũng gen cry1Ia Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 10 11 1Iacb-SmaI-R AA CCCGGG CTACATATTTCTTTCTATG 35S-F CTTCGCAAGACCCTTCCTC pRTL2-R ACTGGTGATTTTTGCGGACT cải biến Mồi xuôi từ vùng promoter 35S mồi ngược từ vùng kết thúc pRTL2 sử dụng cho giải trình tự TTCGCATTGCTAGAAAAACTTTGATGCTTA Cặp mồi cho giải trình tự gen cry1Ia dạng dại ATAGTTAAATACGCGAAGCAACTCCA GCGTTAGAGGAAAAACTCTGATGTTTATCTTGA Cặp mồi cho giải trình tự gen cry1Ia cải biến AAGTACGCGAAGCAACTACACATAGAA 12 13 14 15 Seq_1Iawt-R Seq_1Iawt-F Seq_1Iacb-R Seq_1Iacb-F Sau đó, dịch khuẩn cấy trải lên đĩa mơi trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L kháng sinh Ampicillin nuôi qua đêm 37oC Các khuẩn lạc vector tái tổ hợp pUC19:cry1Ia cải biến mọc đĩa mơi trường có chứa kháng sinh lựa chọn để kiểm tra PCR cặp mồi pUC19-F/R (Bảng 1) sử dụng kít PCR EZ mix-tracking dye (Cơng ty Sinh hóa Phù Sa, Việt Nam) theo hướng dẫn nhà sản xuất Các khuẩn lạc dương tính với PCR lựa chọn đem nuôi tăng sinh khối môi trường LB lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin 37oC qua đêm tách chiết DNA plasmid sử dụng kít Fast-nEasy Plasmid Mini-Prep (Jena Bioscience, Đức) DNA plasmid khuẩn lạc sử dụng để giải trình tự với mồi pUC19-F/R 1Iacb-Seq (Bảng 1) 2.2.3 Tạo vector biểu thực vật mang gen cry1Ia dạng dại cải biến 2.2.3.1 Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại cải biến vào vector pRTL2 Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen mang gen cry1Ia dạng dại cải biến quan tâm, đoạn gen cry1Ia dạng dại cải biến nhân lên PCR từ DNA plasmid vector tách dịng có chứa đoạn gen Cry1Ia quan tâm sử dụng PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại 1IawtNcoI-F/1Iawt-SmaI-R cải biến 1Iacb-NcoI-F/1IacbSmaI-R (Bảng 1) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR cắt với enzyme giới hạn NcoI SmaI (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) kiểm tra điện di gel agarose 1 , sau tinh kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Đức) Sản phẩm tinh đoạn gen cry1Ia dạng dại dạng cải biến sử dụng cho phản ứng ghép nối với vector pRTL2 (đã xử lý với enzyme giới hạn NcoI SmaI) T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.2.3.2 Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cry1Ia dạng dại cải biến PCR Sản phẩm phản ứng ghép nối sử dụng để biến nạp vào vi khuẩn E coli Top10 phương pháp sốc nhiệt Tiếp theo, dịch khuẩn cấy trải lên đĩa mơi trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L kháng sinh Ampicillin nuôi 37oC qua đêm Các khuẩn lạc vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Aa dạng dại cải biến mọc đĩa mơi trường có chứa kháng sinh lựa chọn để kiểm tra trực tiếp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại (1Iawt-NcoI-F/1Iawt-SmaI-R) cải biến (1IacbNcoI-F/1Iacb-SmaI-R) (Bảng 1) sử dụng kit PCR EZ mix-tracking dye Sản phẩm PCR chạy điện di kiểm tra gel agarose 2.2.3.3 Giải trình tự gen Các khuẩn lạc dương tính với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại cải biến lựa chọn đem nuôi tăng sinh khối mơi trường LB lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin 37oC qua đêm tách chiết DNA plasmid sử dụng kit Fast-nEasy Plasmid Mini-Prep DNA plasmid cấu trúc vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại cải biến sử dụng giải trình tự với cặp mồi 35SF/pRTL2-R; thêm vào đó, cấu trúc dạng dại sử dụng thêm cặp mồi Seq_1Iawt-F/Seq_1Iawt-R dạng cải biến sử dụng cặp mồi Seq_1Iacb-F/ Seq_1Iacb-R (Bảng 1) 2.2.3.4 Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại vào vector biểu thực vật pZY101-Asc DNA plasmid vector pRTL2: cry1Ia dạng dại cải biến sau giải trình tự kiểm tra cắt với enzyme giới hạn HindIII Sản phẩm cắt cấu trúc 35S:cry1Ia dạng dại cải biến xử lý tạo đầu với T4 DNA polymerase Tiếp theo, sản phẩm tinh cấu trúc 35S:cry1Ia dạng dại cải biến sử dụng cho phản ứng ghép nối với vector pZY101-Asc (đã cắt với enzyme giới hạn HindIII xử lý đầu bằng) enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm ghép nối vector pZY101-Asc đoạn N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 31 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 35S:cry1Ia dạng dại cải biến sử dụng để biến nạp vào vi khuẩn E coli Top10 phương pháp sốc nhiệt Dịch khuẩn cấy trải lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Spectinomycin 50 mg/L Streptomycin 50 mg/L nuôi 37oC qua đêm Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pZY101:35S:cry1Ia dạng dại cải biến mọc đĩa mơi trường LB có chứa kháng sinh lựa chọn để kiểm tra trực tiếp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại (1Iawt-NcoI-F/1Iawt-SmaIR) cải biến (1Iacb-NcoI-F/1Iacb-SmaI-R) (Bảng 1) sử dụng kít PCR EZ mix-tracking dye Cuối cùng, sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Cải biến gen cry1Ia thể khác đáng kể sinh vật Điều thực tế ba ưa thích có liên quan tới dư thừa tRNA nhận diện có sẵn tế bào Khi gen ngoại lai biểu sinh vật khơng phải vật chủ, trình tự chứa yếu tố hạn chế biểu ba có tần suất thấp sinh vật bị loại bỏ Có mối tương quan định tần số ba mức độ biểu protein ngoại lai Do đó, hiểu xuất ba hiếm, đặc biệt đầu N- protein nên tránh việc thiết kế gen ngoại lai Như vậy, gen quan tâm tổng hợp cách thay ba không sử dụng thường xuyên ba ưa thích đậu tương mà khơng làm thay đổi trình tự axit amin protein chức (Hudson et al., 2011; Murray et al., 1989; Zhang et al., 2011) Trên thực tế, việc biểu protein chức bên ngồi vật chủ tự nhiên gặp Trong nghiên cứu này, để cải biến gen nhiều trở ngại Trong đó, thơng tin di truyền cry1Ia thích hợp cho việc chuyển gen vào đậu mã hóa khung đọc mở khơng đơn giản tương, sử dụng công cụ OPTIMIZER thứ tự axit amin protein sinh vật (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/) kết hợp với khác thường thể ưa thích đặc biệt với tỷ lệ phần trăm ba mã hóa tối ưu cho gen số ba khác mã hóa cho axit đậu tương amin tạo protein chức Hiện tượng (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgigọi sai lệch ba mã hóa xác định bin/showcodon.cgi?species=3847) để tiến hành yếu tố quan trọng biểu gen Mức độ chỉnh sửa gen cry1Ia dạng dại ban đầu ba định xuất mã di truyền có Bảng Kết qu ci bin gen cry1Ia 32 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 KHOA HC CễNG NGH Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 11/2020 33 KHOA HỌC CƠNG NGH 34 Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 11/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ (Chú thích: *: thay đổi Purines Pyrimidines; #: thay đổi Purine Purine Pyrimidine Pyrimidine; aa: amino acid; 1Ia-wt: cry1Ia dạng dại; 1Ia-cb: cry1Ia cải biến) Kết cho thấy, gen cry1Ia cải biến có thay gen cry1Ia cải biến tăng lên 43,9 so với 36,6 đổi nucleotide số ba mã hóa axit amin gen cry1Ia dạng dại ban đầu (Bảng 2) chuỗi trình tự DNA khơng có thay Sự thay đổi nucleotide ba mã đổi chiều dài trình tự DNA so với gen cry1Ia dạng hóa dẫn tới thay đổi số lượng ba mã dại (2160 bp) mã hóa cho 720 axit amin hóa gen cry1Ia cải biến so với dạng dại ban đầu giống Cụ thể, gen cry1Ia cải biến có 264 tổng số 64 ba mã hóa cho 20 axit amin Cụ tráo đổi vị trí Purines cho Pyrimidines ngược thể, ba CTC mã hóa cho Leucine (L) tăng lại so với dạng dại, có 255 thay đổi nhiều với 15 lần, từ có cry1Ia dạng dại lên 18 Purine với Purine Pyrimidine với cải biến, ngược lại ba GTA mã hóa cho Valine Pyrimidine với gen cry1Ia cải biến so với (V) giảm nhiều với 20 lần từ có 22 dạng dại dạng dại ban đầu Sự thay đổi diễn tất xuống cải biến; đó, có ba ATG mã vị trí ba (vị trí nucleotide đầu tiên, thứ hai, hóa cho Methionine (M), GGG mã hóa cho Glycine thứ ba); ngồi ra, có trường hợp thay đổi (G), TGG mã hóa cho Trytophan (W) ba kết nucleotide xảy vị trí ba mã thúc TAG khơng có thay đổi dạng dại hóa Chính thay đổi này, dẫn đến tỷ lệ GC cải biến (Bảng 3) Bảng Các ba mã hóa cho gen cry1Ia dạng dại cải biến Các Các ba cry1I cry1I Các ba cry1 cry1Ia- Các ba cry1 cry1Iacry1Ia cry1Iaba mã mã hóa a-wt a-cb mã hóa Ia-wt cb mã hóa Ia-wt cb -wt cb hóa GCA (A) 22 10 GCC (A) 12 GCG (A) GCT (A) 12 17 TGC (C) TGT (C) GAC (D) 13 GAT (D) 26 21 GAA (E) 28 25 GAG (E) 15 18 TTC (F) 13 19 TTT (F) 24 18 GGA (G) 21 10 GGC (G) 12 GGG (G) 7 GGT (G) 15 CAC (H) CAT (H) 19 10 ATA (I) 12 11 ATC (I) 11 ATT (I) 20 AAA (K) 23 21 AAG (K) 10 TTA (L) 27 23 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 14 35 ... Tạo vector biểu thực vật mang gen cry1Ia dạng dại cải biến 2.2.3.1 Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại cải biến vào vector pRTL2 Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen mang gen cry1Ia dạng dại cải biến. .. 1Ia-wt: cry1Ia dạng dại; 1Ia-cb: cry1Ia cải biến) Kết cho thấy, gen cry1Ia cải biến có thay gen cry1Ia cải biến tăng lên 43,9 so với 36,6 đổi nucleotide số ba mã hóa axit amin gen cry1Ia dạng... (E coli) có khả diệt sâu đục đậu tương điều kiện nhân tạo Trên sở đó, nghiên cứu tiến hành sửa đổi gen cry1Ia dạng dại nhằm tạo tương thích với hệ gen đậu tương thiết kế cấu trúc vector biểu thực