ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI 2019[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRẦN VĂN TUẤN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY HÀ NỘI – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn TS Trần Văn Tuấn PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc cơng bố Tạp chí Khoa học, phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn, Trƣởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN ngƣời thầy cho hội đƣợc thực luận án, tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Trƣởng Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, ngƣời thầy tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, ủng hộ giúp đỡ q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đặc biệt PGS.TS Bùi Thị Việt Hà TS Phạm Thế Hải giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức luôn tạo điều kiện để tơi hồn thành đƣợc khóa học Tơi xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, Giám đốc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein tập thể cán Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện để hoàn thành nghiên cứu Để hoàn thành luận án này, nhận đƣợc hỗ trợ từ đề tài NAFOSTED (mã số: 106-NN.04-2014.75 106.04-2018.36) Tôi trân trọng hỗ trợ Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Trƣờng Cuối tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời thân ngƣời ln ln bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum………………………………………………………… 1.1.1 Sơ lƣợc chi nấm Aspergillus 1.1.2 Nấm Aspergillus niger 1.1.3 Sơ lƣợc chi nấm Penicillium 1.1.4 Nấm Penicillium chrysogenum .9 1.1.5 Nấm Penicillium digitatum 12 1.2 PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT) 15 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens .16 1.2.2 Cơ chế chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 17 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens 19 1.2.4 Vector dùng chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 20 1.2.5 Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23 1.2.6 Promoter điều hòa biểu gen nấm sợi 25 1.2.7 Gen thị DsRed GFP dùng chuyển gen nấm sợi 26 1.2.8 Ƣu điểm phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens .28 1.2.9 Sử dụng phƣơng pháp ATMT nghiên cứu chuyển gen nấm sợi 29 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI 32 1.3.1 Protein LaeA tƣơng tác phức hệ protein velvet nấm sợi 32 1.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA nấm sợi 33 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 VẬT LIỆU 36 2.1.1 Chủng vi sinh vật 36 2.1.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 2.1.3 Thiết bị hóa chất .38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Thu bào tử hệ sợi nấm 39 2.2.2 Đánh giá khả mẫn cảm kháng sinh 40 2.2.3 Tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA 40 2.2.4 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 41 2.2.5 Tối ƣu quy trình chuyển gen nấm A niger, P digitatum P chrysogenum thông qua vi khuẩn A tumefaciens 49 2.2.6 Xóa phục hồi gen laeA nấm sợi nghiên cứu 50 2.2.7 Sàng lọc xác nhận thể chuyển gen 51 2.2.8 Điều tra vai trị gen laeA lồi nấm sợi nghiên cứu 52 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 55 3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT marker gen kháng kháng sinh 55 3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao nấm P chrysogenum P digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh 57 3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum 68 3.2.1 Tạo thành công chủng A niger N402 P chrysogenum VTCC-F1172 đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil 68 3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil 74 3.3 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum 80 3.3.1 Nghiên cứu vai trò gen laeA A niger 80 3.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA P chrysogenum 94 3.3.3 Nghiên cứu vai trò gen laeA P digitatum .106 KẾT LUẬN 117 KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA 5-fluoroorotic acid A nidulans Aspergillus nidulans A niger Aspergillus niger A oryzae Aspergillus oryzae A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) CD Czapek-Dox cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (ADN bổ trợ) DNA Deoxyribonucleic acid DsRed Red fluorescent protein (Protein huỳnh quang đỏ) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ) GFP Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (môi trƣờng cảm ứng) ITS Internal transcribed spacer kb Kilobase pair LaeA Loss of aflR-expression A (Mất biểu aflR) LB Luria- Bertani (môi trƣờng LB) / Left Border (biên trái) MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid MM Minimal medium (môi trƣờng tối thiểu) ORF Open reading frame (khung đọc mở) P chrysogenum Penicillium chrysogenum P digitatum Penicillium digitatum PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PDA Potato dextrose agar PEG Polyethylen glycol RB Right Border (biên phải) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate S aureus Staphylococcus aureus SM Synthetic medium (Môi trƣờng tổng hợp) ura Uracil uri Uridine vir Virulence gene (gen gây bệnh /gen độc lực) WT Wild type (chủng tự nhiên) DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 36 Bảng 2.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 3.1 Kết xác định số gen laeA chủng A niger 92 biểu q mức gen laeA DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus Hình 1.2 Hình ảnh hiển vi A niger Hình 1.3 Hình thái số nấm mốc thuộc chi Penicillium Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc P chrysogenum mơi trƣờng 10 Hình 1.5 Hình thái nấm P digitatum 12 Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn A tumefaciens dƣới kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.7 Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 18 Hình 1.8 Mốc thời gian quan trọng nghiên cứu phát triển vector từ năm 21 1970 đến Hình 1.9 Cấu trúc vector đồng tích hợp 22 Hình 1.10 Mơ hình tổng qt hệ thống vector nhị thể 23 Hình 1.11 Biểu gen GFP nấm sợi A oryzae 27 Hình 1.12 Biểu gen DsRed nấm sợi A.oryzae 28 Hình 1.13 Các protein velvet hình thành phức hệ phân tử ảnh hƣởng 33 chúng đến phát triển sản sinh chất trao đổi bậc hai nấm Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 39 Hình 3.1 Chuyển gen vào A niger thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử 56 dụng marker gen kháng hygromycin Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra vector pPK2-Red, pGreen3 pPK2-Red2 58 cắt với enzym giới hạn Hình 3.3 Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P chrysogenum P 60 digitatum Hình 3.4 Biểu gen huỳnh quang DsRed GFP P digitatum PdVN1 63 Hình 3.5 Xác nhận biểu gen GFP P chrysogenum VTCC-F1172 64 Hình 3.6 Biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker gen 65 kháng phleomycin P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 Hình 3.7 Sự xâm nhiễm nấm P digitatum PdVN1 mang gen DsRed 67 GFP cam dƣới kính hiển vi huỳnh quang Hình 3.8 Cấu trúc xóa gen pyrG A niger P chrysogenum 69 Hình 3.9 Xác nhận chủng xóa gen pyrG A niger N402 71 Hình 3.10 Khả khuyết dƣỡng uridine/uracil kháng 5-FOA 73 chủng P chrysogenum chuyển gen xóa pyrG Hình 3.11 Cấu trúc cắt kiểm tra vector pEX2A enzym giới hạn 75 Hình 3.12 Quy trình chuyển gen hiệu cao cho nấm A niger P 78 chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil Hình 3.13 Biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed chủng A niger khuyết 79 dƣỡng uridine/uracil Hình 3.14 Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen laeA A niger 81 Hình 3.15 Xác nhận xóa gen laeA A niger 83 Hình 3.16 Cắt kiểm tra vector phục hồi gen laeA A niger 85 Hình 3.17 Xác nhận phục hồi gen laeA A niger 86 Hình 3.18 Xác nhận biểu mức gen laeA A niger 87 Hình 3.19 Sự sinh trƣởng chủng A niger nguồn cacbon 88 Hình 3.20 Sự hình thành bào tử chủng A niger nguồn 89 cacbon Hình 3.21 Sự sinh trƣởng hình thành bào tử chủng A niger 90 nguồn nitơ nitrat amon Hình 3.22 Khả tạo tủa sữa chủng A niger xóa phục hồi gen 90 laeA Hình 3.23 Khả tạo tủa sữa chủng A niger biểu mức 91 gen laeA Hình 3.24 Biểu số gen chủng xóa gen laeA so với chủng tự 93 nhiên N402 Hình 3.25 Tạo cấu trúc xóa gen laeA P chrysogenum 94 Hình 3.26 Xác nhận chủng xóa gen laeA PCR 96 Hình 3.27 Xác nhận phục hồi gen laeA nấm P chrysogenum 98 Hình 3.28 Xác nhận biểu mức gen laeA nấm P chrysogenum 99 khuyết dƣỡng uridine/uracil Hình 3.29 Sự hình thành bào tử chủng P chrysogenum nguồn 101 nitơ nitrat amon Hình 3.30 Khả chịu stress chủng P chrysogenum nguồn 103 nitơ nitrat amon Hình 3.31 Sự sinh trƣởng sinh kháng sinh kháng khuẩn chủng P 104 chrysogenum nguồn nitơ nitrat amon Hình 3.32 Khả sinh kháng sinh kháng khuẩn chủng P 106 chrysogenum biểu mức gen laeA Hình 3.33 Sơ đồ tạo vector xóa gen laeA nấm sợi P digitatum 107 Hình 3.34 Sơ đồ tạo vector phục hồi gen laeA nấm sợi P digitatum 108 Hình 3.35 Xác nhận xóa phục hồi gen laeA P digitatum 110 Hình 3.36 Xác nhận biểu mức gen laeA P digitatum 111 Hình 3.37 Sự sinh trƣởng chủng P digitatum nguồn cacbon 112 Hình 3.38 Sự hình thành bào tử chủng P digitatum dƣới tác động 113 D-sorbitol Hình 3.39 pH dịch ni cấy chủng nấm P digitatum 114 Hình 3.40 Khả gây hỏng cam chủng nấm P digitatum 115 Hình 3.41 Khả gây hỏng cam chủng biểu mức gen laeA 116 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm sợi loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho ngƣời nhƣ enzym, protein, chất có hoạt tính sinh học, nhƣng chúng gây thiệt hại khôn lƣờng nhƣ tàn phá trồng, gây hỏng thực phẩm, sinh độc tố, gây bệnh cho ngƣời động vật Các nghiên cứu giới nấm sợi bƣớc qua nhiều giai đoạn khác từ điều tra sử dụng phƣơng pháp truyền thống nghiên cứu đại mức độ gen protein Nhiều loài nấm có lợi đƣợc xếp vào diện an tồn đƣợc giải trình tự hệ gen hồn tồn nhƣ Aspergillus niger Penicillium chrysogenum Bên cạnh đó, hệ gen nấm bệnh thực vật Penicillium digitatum đƣợc giải trình phân tích Dữ liệu chi tiết hệ gen nấm giúp có nhìn tổng quát gen chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp chất, nhƣ gen giữ vai trị quan trọng q trình lây nhiễm nấm bệnh thực vật A niger lồi phổ biến quan trọng mặt cơng nghiệp thuộc chi Aspergillus Loài nấm đƣợc sử dụng rộng rãi sản xuất nhiều loại enzym axit hữu Gần 99% lƣợng axit citric đƣợc sản xuất giới nhờ A niger Trong số lồi nấm đƣợc ứng dụng nhiều sản xuất cơng nghiệp, P chrysogenum tiếng với khả sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh thuộc họ β-lactam đƣợc phát Alexander Fleming Nhiều chủng P chrysogenum tự nhiên đƣợc gây đột biến thành công để tạo chủng cơng nghiệp có hiệu suất sinh tổng hợp penicillin cao Tuy nhiên, lực sinh tổng hợp chất có lợi chủng phân lập từ tự nhiên thƣờng tƣơng đối thấp Để nâng cấp lực cho chủng tự nhiên, kỹ thuật cải biến chỉnh sửa hệ gen thƣờng đƣợc áp dụng Bên cạnh loài nấm mang lại nhiều lợi ích thiết thực, có nhiều lồi gây hại đặc biệt nghiêm trọng sản xuất nông nghiệp Nấm P digitatum tác nhân gây hỏng nhiều loại có múi giai đoạn sau thu hoạch Loài nấm tồn phổ biến nƣớc nhiệt đới, có Việt Nam Bên cạnh việc công làm hỏng quả, gây tổn thất kinh tế, sản phẩm trao đổi chất bậc hai nấm sinh gây nên ảnh hƣởng tiêu cực sức khỏe ngƣời tiêu dùng Nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò gen liên quan đến gây bệnh vi nấm góp phần tạo dựng tảng phục vụ phát triển giải pháp hiệu nhằm kiểm soát vi nấm gây hại Để cải biến di truyền vi nấm, nhiều phƣơng pháp chuyển gen đƣợc phát triển nhƣ chuyển gen qua tế bào trần, chuyển gen xung điện chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần chuyển gen xung điện có nhiều hạn chế nhƣ kỹ thuật thực phức tạp, chi phí cao khơng ổn định Trong đó, phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens đƣợc chứng minh hiệu có tính ổn định cao Nghiên cứu phát triển đƣợc hệ thống chuyển gen với hiệu cao, chi phí thấp sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi cần thiết Hệ thống chuyển gen kết hợp phƣơng pháp chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn A tumefaciens vector nhị thể đƣợc thiết lập hỗ trợ tích cực cho nghiên cứu cải biến di truyền điều tra vai trò gen quan trọng vi nấm Từ lý trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: “Nghiên cứu phát triển vector nhị thể ứng dụng cải biến di truyền số loài nấm sợi” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Tạo đƣợc vector nhị thể thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum Penicillium digitatum - Điều tra đƣợc vai trị gen laeA ba lồi nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu thiết lập NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tạo vector nhị thể mang marker kháng kháng sinh, marker trợ dƣỡng phục vụ chuyển gen vào ba loài nấm sợi (A niger, P chrysogenum P digitatum) sử dụng vi khuẩn A tumefaciens - Xây dựng hệ thống chuyển gen tối ƣu dựa chế kháng kháng sinh chế trợ dƣỡng - Xóa, phục hồi, biểu mức gen laeA điều tra vai trị gen laeA ba lồi nấm sợi Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đây cơng trình phát triển đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với vector nhị thể để phục vụ cho nghiên cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum Penicillium digitatum Đề tài luận án chứng minh hiệu hệ thống vector nhị thể tạo đƣợc cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu gen, xóa gen ba lồi nấm sợi khác Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thêm liệu vai trò gen laeA điều hịa biệt hóa tế bào trao đổi chất loài nấm sợi nghiên cứu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN * Đã tạo thành công 13 vector nhị thể dùng cho biểu gen, xóa gen bổ trợ gen ba loài nấm sợi gồm A niger, P chrysogenum P digitatum * Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu cao sử dụng vi khuẩn A tumefaciens ba loài nấm sợi nghiên cứu Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn dựa chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập nấm sợi A niger P chrysogenum Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh P chrysogenum P digitatum đƣợc tối ƣu hiệu chuyển gen đạt đƣợc cao từ 10 đến 20 lần so với nghiên cứu trƣớc * Xóa, phục hồi biểu mức thành công gen laeA ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đặc biệt nghiên cứu phát vai trị hồn tồn gen laeA liên quan tới biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi chất kiểm soát khả gây hỏng sau thu hoạch Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum 1.1.1 Sơ lƣợc chi nấm Aspergillus Chi Aspergillus nhóm nấm mốc phổ biến phân bố rộng rãi hành tinh đóng vai trị quan trọng cơng nghiệp Năm 1729, nhà sinh học ngƣời Italia Pier Antonio Micheli quan sát cấu tạo cuống sinh bào tử số loài nấm phát chúng có chung đặc điểm hình thái giống nhƣ “bình nƣớc thánh” Từ đó, ơng đặt tên chi nấm theo từ Latin spargere [20] Hình 1.1 Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus [171] Về mặt hình thái, khuẩn lạc lồi thuộc chi Aspergillus có màu sắc đa dạng, đặc trƣng (Hình 1.1) Hệ sợi nấm có vách ngăn, dài tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển theo chiều dài từ đỉnh sợi phân nhánh liên tiếp tạo hệ sợi (mycelium) khí sinh xù xì nhƣ Trên môi trƣờng đặc số chất tự nhiên, quan sát nấm phát triển thành dạng khuẩn lạc đặc trƣng Khuẩn lạc thƣờng mang màu sắc bào tử Việc tạo màu sắc đặc điểm quan trọng để phân loại nấm mốc, có xuất khuẩn lạc, có hịa tan vào nƣớc khuếch tán môi trƣờng xung quanh [1] Nấm Aspergillus sinh sản chủ yếu phƣơng thức hình thành bào tử vơ tính Trong số 250 lồi thuộc chi Aspergillus, khoảng 64% chƣa phát có giai đoạn sinh sản hữu tính Các lồi đƣợc biết có sinh sản hữu tính gây bệnh cho ngƣời loài đƣợc phát sinh sản nhờ bào tử vơ tính [61] Chi Aspergillus đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghệ sinh học công nghiệp Trong công nghệ sinh học, số loài thuộc chi Aspergillus đƣợc sử dụng: A niger, A oryzae sản xuất thực phẩm enzym Tuy nhiên, bên cạnh đó, loài thuộc chi gây số bệnh định cho vật nuôi động vật hoang dã Khả phát tán bào tử mạnh mẽ vài đại diện khơng khí, nƣớc, hạt sấy khơ nguyên liệu thực vật khiến chúng thƣờng xuyên có hội tiếp xúc với động vật Chúng gây nhiễm trùng nhƣ nhiễm độc Một số độc tố đáng lƣu ý Aspergillus aflatoxin, axit cyclopiazonic, glyotoxin, patulin…[21] Trong chi Aspergillus, A niger loài nấm đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều 1.1.2 Nấm Aspergillus niger 1.1.2.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm A niger Aspergillus niger loài phổ biến khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus A niger đƣợc mô tả vào năm 1867 thảo “physiologie des mucédinées” nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem Ơng phân lập lồi nấm với mục đích nghiên cứu việc sản xuất axit gallic từ q trình lên men nấm Khi đó, ông phân lập đƣợc Penicillium glaucum Aspergillus sp có bào tử tƣơng tự Aspergillus glaucus nhƣng có màu đen môi trƣờng khác nhau, tạo mùi mốc số đặc điểm khác Ông đặt tên A niger [49] A niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm Nigri, cịn gọi phân nhóm Aspergillus đen Trong phân nhóm cịn có 14 lồi khác có bào tử màu đen, dễ nhầm lẫn với A niger [87] Khuẩn lạc nấm A niger có màu trắng vàng, bị che khuất màu đen bào tử sinh sản vơ tính mọc bề mặt Hệ sợi nấm kéo dài, có vách ngăn suốt (Hình 1.2) Bào tử đính thƣờng dài từ 900-1600 µm chứa bọng bào tử dài khoảng 40-60 µm [46] Hình 1.2 Hình ảnh hiển vi A niger [80, 136] A niger có khả sinh trƣởng mạnh mẽ với giới hạn nhiệt rộng từ 6-47°C Khoảng nhiệt độ từ 35 tới 37°C khoảng mà loài nấm phát triển mạnh mẽ Độ ẩm cần thiết cho A niger so với loài khác chi lại cao, đạt 0,88 Khoảng pH cho nấm phát triển rộng, trải dài từ 1,4 tới 9,8 Những đặc điểm giúp cho A niger có khả sinh trƣởng tốt nhiều điều kiện khác nhau, tạo lƣợng lớn bào tử, phát tán dễ dàng khơng khí, có khả lây nhiễm ức chế nhiều loài nấm khác, đặc biệt mơi trƣờng nóng ẩm ƣớt A niger sinh sản chủ yếu bào tử vô tính Chƣa phát thấy giai đoạn hữu tính tồn nấm [148] A niger vi nấm mơ hình quan trọng số lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu trình sinh tổng hợp protein, enzym, chế phân tử chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm Kích thƣớc hệ gen A niger đƣợc ƣớc tính có kích thƣớc khoảng 35,5-38,5 Mb, chia thành nhiễm sắc thể/nhóm liên kết có kích thƣớc khác (từ 3,5-6,6 Mb) Hiện tại, có ba dự án khác độc lập nghiên cứu hệ gen A niger, thể tầm quan trọng vi nấm Lƣợng liệu phong phú từ nhiều trình tự gen A niger đƣợc đƣa vào chƣơng trình nghiên cứu ứng dụng cho phát triển quy trình lên men, hình thái bệnh học [11] Hiện nay, hệ gen ba chủng A niger khác đƣợc giải trình tự NRRL 3, CBS 513.88 ATCC 1015 Hai số chủng đƣợc giải trình tự, NRRL ATCC 1015 chủng hoang dại, chủng CBS 513.88 chủng đột biến để nâng cao khả sản xuất glucoamylase [192, 194] 1.1.2.2 Vai trị nấm A niger A niger đóng vai trị quan trọng phủ nhận công nghiệp Sản phẩm tiêu biểu A niger axit citric đƣợc sử dụng công nghiệp thực phẩm để tạo đồ uống có ga, nƣớc hoa quả, mứt, kẹo rƣợu Axit citric A niger sản xuất có lƣợng lớn nhiều hẳn so với axit hữu khác, ví dụ nhƣ axit gluconic [151] Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) xếp A niger nguồn tạo axit citric tiềm [158] Ngồi ra, A niger có khả sản xuất nhiều loại enzym quan trọng nhƣ pectinase cho sản xuất nƣớc rƣợu để làm giảm độ bột tăng mát, glucose oxidase catalase để phân giải thành phần hƣ hại thực phẩm Một số nghiên cứu gần khẳng định khả phân giải chất mạnh mẽ A niger đƣợc ứng dụng xử lý môi trƣờng, bao gồm việc tẩy khoáng cho nƣớc với khả hấp thu tới 96,61% lƣợng ion thừa nƣớc phân giải phốt-pho đất trồng dạng đá rắn để làm tăng suất trồng [5] Về phƣơng diện nghiên cứu, A niger sinh vật mơ hình có khả ứng dụng hiệu nhƣ hệ thống biểu protein ngoại lai Cải biến di truyền nấm sợi, A nidulans sau A niger đạt nhiều thành tựu, đặc biệt việc biểu phytase công nghiệp [5, 126] 1.1.3 Sơ lƣợc chi nấm Penicillium Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae chi nấm phổ biến, phân bố rộng rãi nhiều môi trƣờng sống khác Trái Đất Tên Penicillium xuất phát từ điểm tƣơng đồng cuống sinh bào tử nấm với ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC... vi nấm Từ lý trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: ? ?Nghiên cứu phát triển vector nhị thể ứng dụng cải biến di truyền số loài nấm sợi? ?? MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Tạo đƣợc vector nhị thể. .. cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum Penicillium digitatum Đề tài luận án chứng minh hiệu hệ thống vector nhị thể tạo đƣợc cách áp dụng trực