1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Phạm Thị Mai Hương NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HAI LOÀI SÊN[.]
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Thị Mai Hương NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HAI LOÀI SÊN BIỂN Aplysia dactylomela VÀ Dendrodoris fumata Ở VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phạm Thị Mai Hương NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HAI LOÀI SÊN BIỂN Aplysia dactylomela VÀ Dendrodoris fumata Ở VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.42.01.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Thanh PGS.TS Đỗ Thị Thảo Hà Nội – 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Nguyễn Văn Thanh PGS TS Đỗ Thị Thảo Các số liệu, kết luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Phạm Thị Mai Hương ii LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam với hỗ trợ kinh phí thực đề tài VAST.TĐ.DLB.06/16-18 Trong trình thực luận án, tác giả nhận nhiều giúp đỡ vô quý báu từ thầy cô, nhà khoa học, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Thanh PGS TS Đỗ Thị Thảo người thầy hết lòng tận tâm hướng dẫn dạy suốt thời gian thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo cán đồng nghiệp phịng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển, đặc biệt GS VS Châu Văn Minh bảo, góp ý tạo điều kiện tốt q trình thực hiện, hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, Viện Hóa sinh biển Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Tơi xin trân trọng cảm ơn Phịng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa Sinh biển, Phịng Thử nghiệm hoạt tính sinh học – Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu thử hoạt tính hợp chất Tơi xin gửi lời biết ơn chân thành tới toàn thể gia đình, bạn bè người thân ln quan tâm, động viên khích lệ suốt q trình thực Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Phạm Thị Mai Hương iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ……………………………………………………….…… i LỜI CẢM ƠN………………………………………………………….……… ii MỤC LỤC ……………………………………………………………….……… iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ……………………………….…… vii DANH MỤC BẢNG………………………………………………………….…… ix DANH MỤC HÌNH ……………………………………………………… …… xi MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….…… CHƯƠNG TỔNG QUAN …………………………………………… ……… 1.1 Ung thư mối liên quan tế bào ung thư với trình apoptosis 1.1.1 Khái niệm chung ung thư………………………………………….… 1.1.2 Apoptosis tầm quan trọng apoptosis………………………….… 1.1.3 Mối liên quan tế bào ung thư trình apoptosis………… …… 1.2 Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ……….….… 1.2.1 Thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào kỹ thuật MTT 1.2.2 Thử nghiệm xác định khả gây apoptosis thông qua sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33342……………………………………………….…… 1.2.3 Thử nghiệm xác định khả cảm ứng enzyme caspase-3………… … 1.2.4 Thử nghiệm đánh giá mức độ apoptosis tế bào kỹ thuật phân tích dịng chảy tế bào (flow cytometry)……………………….…… 10 1.3 Giới thiệu chung sên biển……………………………… ………… 11 1.3.1 Đặc điểm sinh học sên biển…………………………………….…… 11 1.3.2 Một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh phân lập từ sên biển………………………………………………………………… 13 1.3.3 Tổng quan chi sên biển Aplysia…………………………………… … 16 1.3.4 Tổng quan chi sên biển Dendrodoris…………………………… …… 34 1.3.5 Tình hình nghiên cứu sên biển Việt Nam………………………… … 37 iv CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… … 39 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu.…………………………………… 39 2.1.1 Mẫu sên biển A.dactylomela…………………………………….… 39 2.1.2 Mẫu sên biển D fumata …………………………………… 40 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………….… 41 2.2 Phương pháp nghiên cứu… …………………………………… … … 41 2.2.1 Xử lý, tạo dịch chiết methanol mẫu sên biển nghiên cứu…….…… 41 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất …………………………….…… 42 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất………….……… 51 2.3.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonace spectrometry - NMR)………………………………………………….… 51 2.3.2 Phương pháp phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)…………….… 51 2.3.3 Một số phương pháp khác……………………………………………… 51 2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chế gây độc tế bào ung thư… 52 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư……………………………….…… 52 2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Phương pháp MTT)……………………………………………………………… …… 52 2.4.3 Phương pháp đánh giá tác động cảm ứng apoptosis………………… … 53 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………… … 56 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi A dactylomela thu vùng biển Lăng Cơ tỉnh Thừa Thiên Huế 56 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi A dactylomela thu vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa………… … 66 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi D fumata thu vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa……………… … 69 3.4 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ mẫu sên biển………………………………………………… 72 3.4.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài A dactylomela thu tỉnh Thừa Thiên Huế….… 72 3.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A dactylomela thu tỉnh Thanh Hóa….… 74 v 3.4.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ mẫu sên biển D fumata………………………… … 75 3.4.4 Đánh giá thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis tế bào ung thư hợp chất AD02 hợp chất DN01 ……………………………… 75 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………….… 84 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A dactylomela thu vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế 84 4.1.1 Hợp chất ASP01…………………………………………………… 84 4.1.2 Hợp chất ASP02…………………………………………………… 86 4.1.3 Hợp chất ASP03…………………………………………………… 86 4.1.4 Hợp chất ASP05…………………………………………………… 87 4.1.5 Hợp chất ASP06…………………………………………………… 87 4.1.6 Hợp chất ASP08…………………………………………………… 88 4.1.7 Hợp chất ASP09…………………………………………………… 88 4.1.8 Hợp chất ASP12…………………………………………………… 89 4.1.9 Hợp chất ASP14…………………………………………………… 91 4.1.10 Hợp chất ASP15…………………………………………………… 91 4.1.11 Xác định cấu trúc hợp chất lại……………………… …… 92 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A dactylomela thu vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa…… 93 4.2.1 Hợp chất AD01……………………………………………… …… 93 4.2.2 Hợp chất AD02………………………………………………… … 94 4.2.3 Hợp chất AD03………………………………………………… … 96 4.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ mẫu sên biển D fumata…………… ……………………………………… 98 4.3.1 Hợp chất DN11………………………………………………… … 98 4.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất lại………………………………… 100 4.4 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ sên biển A dactylomela D fumata… 101 vi 4.4.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài sên biển A dactylomela thu biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế .…… ……………………………………… 101 4.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài sên biển A dactylomela thu biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hố 104 4.4.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài sên biển D fumata thu biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa 107 4.4.4 Đánh giá thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis tế bào ung thư hợp chất AD02 DN01…………… 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… …… 114 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 116 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ………………………… … 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………… …… 118 PHỤ LỤC……………………………………………… -PL1- vii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt H-NMR Tiếng Anh Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1 H- H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance Spectroscopy 5-EPA 5-Episinuleptolide acetate 6-OHDA 6-Hydroxydopamine AD Aplysia dactylomela was collected in Hon Me island, Thanh Hoa province ASP Aplysia dactylomela was collected in Lang Co, Thua Thien Hue province ATCC American Type Culture Collection CC Chromatography column CD Circular dichroism Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DISC Death-inducing signaling complex DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DN Dendrodoris fumata was collected in Hon Me island, Thanh Hoa province DNA Deoxyribo Nucleic Acid FBS Fetal Bovine Serum H2SO4 Sulfuric acid HepG2 Human hepatocellular carcinoma cell HL-60 Human promyelocytic leukemia cell HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HPLC High Performance Liquid Chromatography HR-ESI-MS High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry Tiếng Việt Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ tương tác proton-proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 đồng vị 5-Episinuleptolide acetate 6-Hydroxydopamine Aplysia dactylomela thu vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa Aplysia dactylomela thu vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế Ngân hàng chủng chuẩn Mỹ Sắc kí cột Phổ lưỡng sắc trịn Phổ DEPT Phức hợp tín hiệu gây chết Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethyl sulfoxide Dendrodoris fumata thu vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa Axit Deoxyribo Nucleic Huyết bào thai bị Axit Sunfuric Tế bào ung thư biểu mô gan người dòng HepG2 Ung thư bạch cầu cấp người dòng HL-60 Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Sắc ký hiệu cao Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện viii HSQC LU-1 Heteronuclear Single Quantum Coherence Inhibitory concentration 50% Human epidemoid carcinoma cell Infrared Spectroscopy Lymph Node Carcinoma of the Prostate Liquid chromatography-mass Spectroscopy Human lung carcinoma Cell MCF-7 Human breast carcinoma cell MDA-MB231 MIC Human breast cancer cell IC50 KB IR LNCaP LC-MS MS MTT NOESY PI3K/Akt PS SK-Mel-2 TNF TRAIL TLC Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Nồng độ ức chế 50% Tế bào ung thư biểu mô người Phổ hồng ngoại Ung thư tiền liệt người Sắc kí lỏng – phổ khối Tế bào ung thư phổi người dòng LU-1 Tế bào ung thư vú người dòng MCF-7 Tế bào ung thư vú người dòng MDA-MB-231 Nồng độ ức chế tối thiểu Minimum inhibitory concentration Mass Spectroscopy Khối phổ 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenylterazolium bromide 2,5-diphenylterazolium bromide Nuclear Overhauser Phổ NOESY Enhancement Spectroscopy An intracellular signaling Một đường tín hiệu nội bào pathway important in quan regulating the cell cycle trọng việc điều hòa chu kỳ tế bào Phosphatidylserine Phosphatidylserine Human Melanoma cell Tế bào ung thư da người dòng SK-Mel-2 Tumor Necrosis Factors Yếu tố hoại tử khối u Tumor necrosis factor-related Phối tử kích hoạt apoptosis liên apoptosis-inducing ligand quan đến nhân tố hoạt tử khối u Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất phân lập nghiên cứu hoạt tính sinh học từ chi Sên biển Aplysia………………………………………………… 18 Bảng 1.2 Các hợp chất phân lập từ chi sên biển Dendrodoris 36 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP01……………………………… 57 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP02……………………………… 58 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP03……………………………… 59 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP05……………………………… 60 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP06……………………………… 61 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP08……………………………… 62 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP09……………………………… 63 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP12……………………………… 64 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP14……………………………… 65 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ NMR hợp chất ASP15……………………………… 66 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR hợp chất AD01……………….……………… 67 Bảng 3.12 Dữ liệu phổ NMR hợp chất AD02………………….…………… 68 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR hợp chất AD03…………………….………… 69 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR hợp chất DN01……………… ……………… 71 Bảng 3.15 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào hợp chất ASP……………………………………………… …………… 73 Bảng 3.16 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào hợp chất AD……………………………………………………………… 74 Bảng 3.17 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào hợp chất DN……………………………………………………….……… 75 Bảng 3.18 Tỉ lệ tế bào apoptosis tác động hợp chất AD02 nồng độ khác (AD02 µg/mL, AD02 0.34µg/mL, AD02 0.68µg/mL) dòng tế bào ung thư gan HepG2…….………………………… 78 Bảng 3.19 Tỉ lệ tế bào apoptosis tác động hợp chất DN01 nồng độ khác (DN01 µg/mL, DN01 10 µg/mL, DN01 µg/mL) dịng tế bào ung thư bạch cầu cấp người HL-60… .…………… 84 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phân chia tế bào bình thường tế bào ung thư [8]……….… Hình 1.2 Các đường bên bên apoptosis [14]……… Hình 1.3 Các chế làm giảm trình apoptosis gây ung thư [16] Hình 1.4 Mối quan hệ phát sinh lồi phận phân loại công nhận Nudibranchia sử dụng tổng quan Các nhánh kết thúc siêu họ (được gạch dưới), gốc đại diện cho phân chia phân loại [37]…… 13 Hình 1.5 Hợp chất jorumycin, safracin sên biển Jorunna funebris 15 Hình 1.6 Hợp chất monomethyl auristatin E thuốc Brentuximab vedotin 16 Hình 1.7 Bản đồ phân bố sên biển Aplysia [38]………………………… 17 Hình 1.8 Cấu trúc minh họa số hợp chất acetogenin phân lập từ loài sên biển A dactylomela…………………………… .… 24 Hình 1.9 Cấu trúc minh họa số hợp chất alkaloid phân lập từ loài sên biển A dactylomela…………………………… .… Hình 1.10 Cấu trúc hóa học số hợp chất monoterpene phân lập từ loài sên biển A dactylomela ………………………………… Hình 1.11 24 25 Apoptosis tế bào bệnh bạch cầu người HL 60 (a-c) THP (d-f) nhóm đối chứng (a, d) dactylone nồng độ 4080 µmol/L (b, e) 80 µmol/L (c, f) …………………… … 29 Hình 1.12 Cấu trúc hóa học số hợp chất sesquiterpene phân lập từ loài sên biển A dactyolomela………………………………… Hình 1.13 Cấu trúc hóa học số hợp chất diterpene phân lập từ loài sên biển A dactylomela………………………………… Hình 1.14 32 33 Cấu trúc hóa học số hợp chất triterpenoid phân lập từ sên biển A dactylomela………………………………… 34 Hình 1.15 Cấu trúc hóa học số hợp chất phân lập từ chi Dendrodoris 37 Hình 1.16 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi sên biển Phyllidiella pustulosa thu Việt Nam………………… 38 xi Hình 2.1 Mẫu sên biển A dactylomela thu vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế………………… Hình 2.2 39 Mẫu sên biển A dactylomela thu vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa……………… 40 Hình 2.3 Mẫu sên biển D fumata thu vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa……………… 40 Hình 2.4 Sơ đồ mơ tả trình chiết thu phân đoạn chiết từ sên biển A dactylomela.(ASP) 43 Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài sên biển A dactylomela (ASP) 45 Hình 2.6 Sơ đồ mơ tả q trình chiết thu phân đoạn chiết từ sên biển A dactylomela (AD) 47 Hình 2.7 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài sên biển A dactylomela (AD) 48 Hình 2.8 Sơ đồ mơ tả q trình chiết thu phân đoạn chiết từ sên biển D fumata (DN) …………………………… 48 Hình 2.9 Sơ đồ phân lập chất từ sên biển D fumata (DN) … 50 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài A dactylomela thu Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế…………………………… Hình 3.2 56 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi A dactylomela thu Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa…………………………………… 66 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài D fumata … 70 Hình 3.4 Ảnh hưởng hợp chất AD02 nồng độ khác (A: µg/mL (0 µM); B: 0.685 µg/mL (2.5 µM), C: 1.73 µg/mL (5 µM)) đến thay đổi hình thái tế bào HepG2 sau 48h tác động Kính hiển vi quan sát độ phóng đại 40X Mũi tên tế bào chết apoptosis với điểm đặc trưng thay đổi hình thái tế bào: tế bào cô đặc, nhân phân mảnh … Hình 3.5 Tác động hợp chất AD02 đến trình apoptosis tế bào HepG2 thơng qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen sau 48h điều trị nồng độ khác (AD02 µg/mL, AD02 0.685 µg/mL, AD02 1.73 µg/mL) Trong đó, 76 xii mẫu thử phân tích hệ thống flowcytometry Novocyte (ACE Biosciences Inc.) phần mềm NovoExpress Trục x thể mức độ nhuộm mầu Annexin V, trục y thể mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log Q2-1 hoại tử, Q2-2 apoptosis muộn, Q24 apoptosis sớm, Q2-3 tế bào sống Hình 3.6 77 Tỉ lệ phần trăm quần thể tế bào ung thư gan HepG2 nồng độ điều trị với hợp chất AD02 khác (AD02 µg/mL, AD02 0.685µg/mL, AD02 1.73µg/mL) Các giá trị trình bày dạng trung bình (n = 3) ± SD; * P