Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đa hình đột biến gen cyp2c9, cyp2c19, cyp3a5 và cyp2d6 cytochrome p450 ở người kinh việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hải Hà GS TS Nông Văn Hải Hà Nội – Năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng với hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hải Hà GS.TS Nông Văn Hải Những kết thu luận án mới, trung thực chưa công bố cơng trình khác Các kết cơng bố chung cán hướng dẫn đồng tác giả cho phép sử dụng Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Vũ Phương Nhung ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Nông Văn Hải-nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Chủ tịch hội đồng Khoa học Viện Nghiên cứu hệ gen TS Nguyễn Hải Hà-Phó trưởng phịng Phân tích hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong suốt trình học tập nghiên cứu, tinh thần say mê nghiêm khắc khoa học với hướng dẫn tận tình khích lệ thầy động lực lớn lao giúp không ngừng cố gắng phấn đấu, vượt qua nhiều khó khăn để hồn thành Luận án Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Đăng Tơn-Trưởng phịng Phân tích hệ gen đồng nghiệp cơng tác phịng Phân tích hệ gen ln tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành giúp đỡ suốt trình học tập làm việc chun mơn Phịng Bằng tình cảm chân thành nhất, tơi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu Trong q trình nghiên cứu học tập, tơi nhận ý kiến đóng góp quý báu nhà khoa học, cán nghiên cứu Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Những nhận xét góp ý chuyên môn sâu sắc buổi báo cáo, hội thảo giúp tơi hồn thiện tốt Luận án Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể cán Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè tin tưởng nguồn động viên tinh thần lớn lao suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Vũ Phương Nhung iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CYP450 chuyển hóa thuốc gan 1.2 Đa dạng di truyền gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc 1.2.1 Gen CYP2C9 1.2.2 Gen CYP2C19 11 1.2.3 Gen CYP2D6 14 1.2.4 Gen CYP3A5 17 1.3 Ảnh hưởng đa dạng di truyền gen dược học ADR khác biệt đáp ứng thuốc 20 1.3.1 Khái quát ADR 20 1.3.2 Một số trường hợp đa dạng di truyền gen dược học gây nên khác biệt đáp ứng thuốc 22 1.4 Ứng dụng triển vọng di truyền dược học lâm sàng 29 1.5 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền gen CYP450 32 1.5.1 Các phương pháp nghiên cứu SNP indel 32 1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu CNV 34 1.6 Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền số gen CYP450 người Việt Nam phạm vi nghiên cứu luận án 37 1.6.1 Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền gen CYP450 Việt Nam giới 37 iv 1.6.2 Phạm vi nghiên cứu luận án 39 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 41 2.3.2 Xác định nồng độ DNA tổng số 42 2.3.3 Phương pháp PCR Khuếch đại đặc hiệu gen 43 2.3.3.1 Thiết kế mồi 43 2.3.3.2 PCR đặc hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 45 2.3.4 Giải trình tự Sanger 46 2.3.4.1 PCR giải trình tự 46 2.3.4.2 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự 47 2.3.4.3 Biến tính sản phẩm PCR điện di mao quản máy giải trình tự 47 2.3.5 Phương pháp MLPA 47 2.3.5.1 Thực phản ứng MLPA 48 2.3.5.2 Điện di mao quản phân tách đoạn 49 2.3.5.3 Phân tích kết phần mềm Coffalyzer 49 2.3.6 Long range (LR) PCR 50 2.3.7 Real-time PCR 51 2.3.8 Phân tích số liệu nghiên cứu 52 2.3.8.1 Phân tích kết giải trình tự Sanger đánh giá trạng thái cân di truyền Hardy-Weinberg quần thể 52 2.3.8.2 Phân tích thống kê 52 2.3.9 Dự đoán chức in silico biến thể 53 2.3.9.1 Dự đoán chức biến thể vùng mã hóa 53 v 2.3.9.2 Dự đốn chức biến thể vùng không mã hóa 53 2.3.9.3 Dự đốn chức biến thể vùng promoter 54 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Tách chiết DNA tổng số 55 3.2 Khuếch đại đặc hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 giải trình tự 55 3.3 Phân tích đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam 59 3.3.1 Đa hình/đột biến gen CYP2C9 59 3.3.2 Đa hình/đột biến gen CYP2C19 65 3.3.3 Đa hình/đột biến gen CYP2D6 70 3.3.4 Đa hình/đột biến gen CYP3A5 83 3.4 Phân tích liên kết biến thể CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 85 3.5 Dự đoán chức in silico biến thể tìm thấy CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 87 3.6 So sánh tần số allele gen nghiên cứu quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 90 3.6.1 So sánh tần số allele gen CYP2C9 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 90 3.6.2 So sánh tần số allele gen CYP2C19 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 92 3.6.3 So sánh tần số allele gen CYP2D6 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 93 3.6.4 So sánh tần số allele gen CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 96 3.7 Thảo luận 98 3.7.1 Sự phân bố SNP gây ảnh hưởng chức protein CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người giới 98 vi 3.7.2 Phân tích liên kế t giữa các biế n thể và ý nghiã nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n các gen CYP450 102 3.7.3 Vai trò CNV SV gen nghiên cứu đa dạng đáp ứng thuốc cá nhân 103 3.7.4 Vai trò biến thể CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 chức protein tương ứng 105 3.7.5 Ý nghĩa việc sử dụng thông tin di truyền gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc tối ưu hiệu dùng thuốc người Kinh Việt Nam 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN Tên viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt dùng luận án ADR Adverse drug reaction Phản ứng có hại thuốc CNV Copy number variant Biến thể số CPIC Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng CYP2C19 Cytochrome P450 2C19 CYP2C9 Cytochrome P450 2C9 CYP2D6 Cytochrome P450 2D6 CYP3A5 Cytochrome P450 3A5 CYP450 Cytochrome P450 DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EM Extensive metabolizer Chuyển hóa thuốc bình thường FDA U.S Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ FPR False positive rate Tỉ lệ dương tính giả GWAS Genome-wide association study Nghiên cứu tương quan toàn hệ gen HSF Human Splicing Finder viii IM Intermediate metabolizer Chuyển hóa thuốc trung bình Indel Insertion/deletion Biến thể thêm/mất nucleotide INR International normalized ratio Chỉ số phản ánh thời gian hình thành cục máu đơng LD Linkage disequilibrium Độ liên kết biến thể LR-PCR Long range PCR MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification PCR Polymerase chain reaction PGRN Pharmacogenomics Research Netwwork Mạng lưới nghiên cứu hệ gen dược học PharmVar Pharmacogene Variation Đa dạng di truyền gen dược học PM Poor metabolizer Chuyển hóa thuốc yếu SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide SRS Substrate recognition site Vị trí nhận biết chất SSRI Selective serotonin reuptake inhibitor Ức chế tái hấp thu serotonine SV Structural variant Biến thể cấu trúc TPMT Thiopurine S-methyltransferase enzyme chuyển hóa thuốc thiopurine UM Ultra rapid metabolizer Chuyển hóa thuốc cực nhanh Khuếch đại đa đầu dị phụ thuộc phản ứng ghép nối ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C9 43 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C19 44 Bảng 2.3 Trình tự mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2D6 44 Bảng 2.4 Trình tự cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP3A5 45 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR giải trình tự 46 Bảng 2.6 Thông số điện di mao quản máy 3500 49 Bảng 2.7 Mối liên hệ giá trị DQ số mẫu nghiên cứu 50 Bảng 2.8 Trình tự cặp mồi sử dụng cho real-time PCR 52 Bảng 3.1 Các biến thể CYP2C9 quần thể người Kinh Việt Nam 60 Bảng 3.2 Dữ liệu MLPA CNV gen CYP2C9 số mẫu nghiên cứu 62 Bảng 3.3 Tần số kiểu gen CYP2C9 quần thể người Kinh Việt Nam 65 Bảng 3.4 Tần số allele CYP2C9 quần thể người Kinh Việt Nam 65 Bảng 3.5 Các biến thể CYP2C19 quần thể người Kinh Việt Nam 66 Bảng 3.6 Dữ liệu MLPA CNV gen CYP2C19 số mẫu nghiên cứu 68 Bảng 3.7 Tần số kiểu gen CYP2C19 quần thể người Kinh Việt Nam 69 Bảng 3.8 Tần số allele CYP2C19 quần thể người Kinh Việt Nam 69 Bảng 3.9 Biến thể CYP2D6 quần thể người Kinh Việt Nam xác định phương pháp giải trình tự 70 Bảng 3.10 Xác định kiểu gen CYP2D6 người Kinh Việt Nam thông qua kết hợp liệu giải trình tự MLPA 78 Bảng 3.11 Tần số allele CYP2D6 quần thể người Kinh Việt Nam 80 Bảng 3.12 Tần số kiểu gen tần số allele CYP3A5 người Kinh Việt Nam 84 Bảng 3.13 Dữ liệu MLPA CNV gen CYP3A5 số mẫu nghiên cứu 84 Bảng 3.14 So sánh tần số biến thể CYP2C9 nghiên cứu với quần thể khác giới 91 Bảng 3.15 So sánh tần số biến thể CYP2C19 nghiên cứu với quần thể khác giới 92 Bảng 3.16 So sánh tần số allele CYP2D6 có ảnh hưởng đến chức protein quần thể người Kinh Việt Nam quần thể khác giới 94 Bảng 3.17 So sánh tần số allele CYP3A5*3 nghiên cứu với quần thể khác giới 96 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc CYP450 vị trí nhận biết chất (SRS) Hình 1.2 Đa dạng di truyền gen CYP450 vai trị chuyển hóa thuốc Hình 1.3 Các biến thể sai nghĩa dịch khung CYP2C9 10 Hình 1.4 Phân bố số biến thể gen CYP2C19 12 Hình 1.5 Cấu trúc gen CYP2D6 phân bố số biến thể 16 Hình 1.6 Phân bố biến thể gen CYP3A5 18 Hình 1.7 Ảnh hưởng ADR tới quan thể 21 Hình 1.8 Ứng dụng di truyền dược học xây dựng chiến lược sử dụng thuốc phù hợp 29 Hình 2.1 Sơ đồ chi tiết thực nghiên cứu 41 Hình 3.1 Điện di đồ mẫu DNA tổng số 55 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C9 mẫu nghiên cứu 56 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C19 mẫu nghiên cứu 57 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 mẫu nghiên cứu 58 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP3A5 mẫu nghiên cứu 58 Hình 3.6 Các biến thể vùng intron exon CYP2C9 61 Hình 3.7 Kết MLPA xác định tồn 01 gen CYP2C9 63 Hình 3.8 Kết Real-time PCR kiểm tra số CYP2C9 64 Hình 3.9 Các biến thể vùng intron CYP2C19 67 Hình 3.10 Các biến thể vùng promoter CYP2D6 72 Hình 3.11 Các biến thể intron exon CYP2D6 73 Hình 3.12 Kết MLPA xác định số bình thường gen CYP2D6 74 Hình 3.13 Kết MLPA xác định bất thường số (các exon 1,5,6) gen CYP2D6 75 Hình 3.14 Kết MLPA xác định toàn 01 gen CYP2D6 75 Hình 3.15 LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5 76 Hình 3.16 Các SV CYP2D6 xác định mẫu người Kinh 82 Hình 3.17 Kết giải trình tự CYP3A5*3 83 Hình 3.18 Phân tích liên kết biến thể gen CYP2C9 86 Hình 3.19 Phân tích liên kết biến thể gen CYP2C19 86 Hình 3.20 Phân tích liên kết biến thể gen CYP2D6 87 xi Hình 3.21 Dự đốn chức biến thể CYP2C9 42627C>A Polyphen (a) PROVEAN (b) 88 Hình 3.22 Tính bảo thủ vị trí amino acid Proline 363 protein CYP2C9 88 Hình 3.23 Dự đốn chức biến thể 3157G>T 2988G>A thuộc CYP2D6 90 Hình 3.24 Tính bảo thủ vị trí amino acid Argine 329 protein CYP2D6 90 MỞ ĐẦU Các enzyme cytochrome P450 (CYP450) thuộc họ protein-heme lớn, enzyme có vai trị thiết yếu q trình chuyển hóa hợp chất nội sinh ngoại sinh Ở người, có 57 gen chức 58 gen giả báo cáo, CYP450 phân loại thành 18 họ 44 phân họ Hầu hết gen nhóm mang chức sinh học chuyển hóa chất nội sinh acid mật, eicosanoid steroid Tuy nhiên, khoảng 12 enzyme CYP450 thuộc phân họ CYP1, CYP2 CYP3 tham gia chuyển hóa thuốc Phần lớn loại thuốc kê đơn lâm sàng chuyển hóa enzyme CYP450, ngồi có nhiều loại thuốc chuyển hóa CYP450 Có thể thấy, yếu tố nội sinh ngoại sinh gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme CYP450 đóng vai trò quan trọng đến dược động học loại thuốc đưa vào thể Đối với số CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6, biến thể di truyền gen mã hóa cho protein có ảnh hưởng nhiều đến khác biệt hoạt tính enzyme, CYP450 khác (CYP1A2, CYP3A4) tỉ lệ khơng đáng kể Các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc có tính đa hình cao Sự đa dạng di truyền thể đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) xuất với tần số (rare) phổ biến (common), ngồi cịn có biến thể số (Copy number variant-CNV) bao gồm mất/lặp đoạn Chức biến thể phân loại từ khơng chức đến tăng cường chức năng, từ mà kiểu hình chuyển hóa chia thành cấp độ: chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-PM), chuyển hóa thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc bình thường (Extensive Metabolizer-EM) chuyển hóa thuốc cực nhanh (Ultrarapid MetaolizerUM) Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A4/5 Năm gen CYP450 nói mã hóa cho enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% loại thuốc thường kê đơn 2 Tính cấp thiết vấn đề nghiên cứu: Sự khác đáp ứng thuốc cá nhân điều khó tránh khỏi điều trị, có phản ứng có hại thuốc (Adverse drugs reaction/ADR) Các ADR nguyên nhân trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, số dẫn tới tử vong Ingelman-Sunberg cộng ước tính ADR làm tiêu tốn khoảng 100 tỉ đô la Mỹ, nguyên nhân dẫn tới 100.000 ca tử vong năm Mỹ Khoảng 7% ca nhập viện Anh Thụy Điển có nguyên nhân từ ADR Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation ConsortiumCPIC) cung cấp thông tin việc xét nghiệm di truyền sử dụng tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc Đối với vài loại cặp gen-thuốc, CPIC đưa dẫn liều dùng cụ thể Như trình bày trên, gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 số gen CYP450 có tính đa hình cao mà dạng đa hình chúng khiến cho bệnh nhân có khả chuyển hóa loại thuốc cụ thể khác nhau, từ mạnh tới yếu Cho tới nay, hiểu biết đa dạng di truyền nhóm gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc người Việt Nam hạn chế Ngày nay, vai trò dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc tương tác thuốc lâm sàng mang tính cấp bách cần đầu tư nghiên cứu Hiểu biết tính đa dạng di truyền gen tham gia chuyển hóa thuốc người Việt Nam coi tiền đề để phát triển lĩnh vực Nghiên cứu tập trung vào việc phát allele biết xác định allele người Việt Nam Do vậy, số liệu thu từ nghiên cứu cung cấp thông tin khoa học đa dạng di truyền gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Việt Nam Đây tiền đề có ý nghĩa đóng góp phần cho phát triển lĩnh vực di truyền dược học y học cá thể Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng sở dữ liê ̣u về đa hình/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam - Xác định kiểu gen tần số allele 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Kinh Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự đoán chức của các biế n thể mới 3 Cách tiếp cận nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu 136 người Kinh khỏe mạnh khơng có quan hệ huyết thống Nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định tất biến thể nằm vùng promoter với tất exon vùng biên 03 gen CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 Đối với gen CYP3A5, phương pháp giải trình tự Sanger áp dụng nhằm xác định biến thể cơng bố có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bao gồm: *3, *6, *8 *9 Các CNV gen nghiên cứu xác định phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA) Những mẫu xác định có bất thường số kiểm tra lại phương pháp Long range PCR real-time PCR Các biến thể sau xác định tiếp tục tổng hợp số liệu để tính tốn tần số allele tần số kiểu gen tổng số mẫu nghiên cứu gen Tiến hành so sánh tần số phân bố allele gen quần thể người Kinh Việt Nam so với quần thể người khác Bên cạnh đó, biến thể tiến hành phân tích in silico nhằm dự đoán ảnh hưởng biến thể đến chức protein tương ứng Những đóng góp luận án: Xác định số biến thể promoter intron gen CYP450, cụ thể: biến thể in tron CYP2C9, biến thể intron CYP2C19, biến thể promoter biến thể intron CYP2D6 biến thể thuộc vùng mã hóa gen CYP2C9 CYP2D6 Đã phân tích in silico cho thấy biến thể gây ảnh hưởng có hại đến chức protein Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 CYP2D6*36-*10 xác định người Kinh Việt Nam biến thể làm giảm hoạt tính enzyme xác định với tỉ lệ là: 8,09%, 43,75%, 1,547% 12,13% 4 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CYP450 chuyển hóa thuốc gan Thuốc chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phịng-chữa bệnh hay điều trị giảm nhẹ Enzyme chuyển hóa thuốc biết đến nhiều enzyme CYP450, enzyme tham gia vào trình oxi hóa khử thủy phân Mục tiêu q trình chuyển hóa thuốc giúp đào thải thuốc khỏi thể Ví dụ tiền chất (khơng có hoạt tính dược lý) sau hấp thụ vào thể chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính Mặt khác đa số loại thuốc sau chuyển hóa chuyển sang trạng thái hoạt động Q trình chuyển hóa thuốc xảy nhiều quan thể gan, thành ruột, phổi, thận huyết tương Trong số đó, gan quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng vai trị vị trí thải độc loại thải chất ngoại lai cách biến đổi hợp chất tan lipid trở nên ưa nước hơn, trình có tham gia enzyme Q trình chuyển hóa thuốc gan trải qua giai đoạn: pha I, pha II pha III Trong pha I có tham gia enzyme CYP450, pha II thực enzyme vận chuyển acid glucuronic UDP (UDP-glucuronosyltransferase) (chuyển hóa 40-70% loại thuốc) pha III enzyme vận chuyển thuốc (drug transporter) giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật Klingenberg lần phát CYP450 vào năm 1954 nghiên cứu chuyển hóa hoocmon steroid, ơng trích xuất loại protein từ tế bào gan [1] Gần thập kỷ sau, chức tầm quan trọng CYP450 xác định Năm 1963, Estabrook cộng mô tả vai trò CYP450 chất xúc tác q trình tổng hợp hormone steroid chuyển hóa thuốc Cooper đồng nghiệp sau xác nhận CYP450 enzyme chủ chốt liên quan đến phản ứng hydroxyl hóa thuốc steroid [2] Nhiều protein CYP450 phát rộng khắp thể, chứng tỏ tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính gây ung thư [3] Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I protein biểu chủ yếu mạng lưới nội chất trơn ti thể tế bào gan biểu mơ ruột non (ngồi cịn số quan khác) Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm gen giả, đặt tên CYP1A1 kết thúc CYP51P3 Các protein mã hóa CYP450 phân loại dựa mức độ tương đồng trình tự amino acid thành cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1, CYP2D6…) Trong số CYP450 biểu gan CYP3A4 có mức độ biểu mạnh (chiếm 22,1%), enzyme CYP2E1 (15,3%) CYP2C9 (14,6%) tính tổng số protein gan Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vịng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất khơng vịng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy) Trong số phản ứng này, phản ứng oxi hóa phản ứng giúp thêm nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, biểu diễn phương trình sau: NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + ROH Về mặt cấu trúc, CYP450 protein có khoảng 400-500 amino acid chứa nhóm heme với nguyên tử Fe trung tâm Tất CYP450 có chung cấu trúc bảo thủ tạo nên bốn vòng xoắn D, L, I E Trong nhóm heme nằm vịng xoắn I L Mặc dù cấu trúc dạng gấp cuộn CYP450 có tính bảo thủ cao, có đa dạng cấu trúc họ CYP450 khác từ cho phép protein kết hợp với chất với kích thước khác mức độ đặc hiệu khác Một số CYP450 có tính đặc hiệu cao q trình oxi hóa chất, CYP3A4 lại tham gia chuyển hóa 50% loại thuốc thị trường Ở mức độ đơn giản mặt cấu hình nhận biết kết hợp với chất có vị trí nhận biết chất (Substrate recognition site-SRS) Các vị trí bao gồm vùng xoắn B' (SRS1), phần chuỗi xoắn F G (SRS2 SRS3), phần chuỗi xoắn I (SRS4), vùng β2 chuỗi xoắn K (SRS6) cấu trúc kẹp tóc β4 (SRS5) trung tâm hoạt động CYP450 (Hình 1.1) Trên thực tế, SRS định trước tính đặc hiệu chất CYP450 đột biến điểm xảy vị trí ảnh hưởng đến độ đặc hiệu chất [4] Các SRS vùng cấu trúc linh hoạt, di chuyển kết hợp với chất có khả cảm ứng phù hợp với chất, từ tạo điều kiện thuận lợi cho mối liên kết enzyme-cơ chất sau phản ứng xúc tác [5] 6 Hình 1.1 Cấu trúc CYP450 vị trí nhận biết chất (SRS) [6] CYP450 có cấu trúc gấp nếp bảo thủ thể vòng xoắn (đánh dấu chữ in hoa) Các SRS tô đậm tối màu 1.2 Đa dạng di truyền gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc Các gen chuyển hóa phần hệ gen dược học Đây gen đóng vai trị quan trọng biến đổi sinh học thuốc, thay đổi di truyền gen góp phần tạo nên khác biệt cá thể đáp ứng thuốc [7] Các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc bao gồm gen mã hóa cho enzyme tham gia chuyển hóa thuốc pha I pha II Các enzyme chuyển hóa thuốc có mức độ đa hình cao biểu hoạt tính chúng Các CYP450 nguồn gốc gây đa dạng dược động học dược lý học thuốc Các protein CYP450 biểu mạnh gan bao gồm CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8, CYP2E1 CYP1A2 Trong protein CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6 CYP3A5 biểu Các CYP450 khác CYP2J2, CYP1A1 CYP1B1 biểu chủ yếu gan Các kiểu đa hình di truyền khác gen CYP450 định mặt chức kiểu hình chuyển hóa thuốc (PM, IM, EM UM) Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A4/5 Năm gen CYP450 nói mã hóa cho enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% loại thuốc thường kê đơn Trong số protein thuộc 18 họ CYP450, protein có tính đa hình cao CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 CYP2C19 Bên cạnh có số protein CYP450 thuộc phân họ khác có tính đa hình thấp CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1 Về chức chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường nhất, enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 CYP2E (Hình 1.2) Phần tổng quan trình bày khái quát đa hình 04 gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I bao gồm: CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 Hình 1.2 Đa dạng di truyền gen CYP450 vai trị chuyển hóa thuốc [8] (a)Số lượng SNP số gen CYP450 (b) Số lượng thuốc chuyển hóa enzyme CYP450 Các số biểu đồ thể số lượng SNP/thuốc chuyển hóa 1.2.1 Gen CYP2C9 Gen CYP2C9 nằm vai dài nhiễm sắc thể số 10, mã hóa cho protein có 490 amino acid có khối lượng phân tử 55,6 kDa Vùng gen chứa CYP2C9 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME. .. hình/ đột biến gen CYP2C9 59 3.3.2 Đa hình/ đột biến gen CYP2C19 65 3.3.3 Đa hình/ đột biến gen CYP2D6 70 3.3.4 Đa hình/ đột biến gen CYP3A5 83 3.4 Phân tích liên kết biến. .. hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 giải trình tự 55 3.3 Phân tích đa hình/ đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam 59 3.3.1 Đa hình/ đột