Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm xây dưng cơ sở dữ liêu về đa hinh/đột biến của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam. Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biến thể mới. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghê ̣ sinh ho ̣c Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nơ ̣i - Năm 2020 Luận án hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Hải Hà Người hướng dẫn khoa học 2: GS TS Nông Văn Hải Phản biện 1: ……………………… Phản biện 2: ……………………… Phản biện 3: ……………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …’, ngày … tháng … năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Sự khác đáp ứng thuốc cá nhân điều khó tránh khỏi điều trị, có phản ứng có hại thuốc (Adverse drugs reaction-ADR) Các ADR nguyên nhân trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, số dẫn tới tử vong Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium-CPIC) cung cấp thông tin việc xét nghiệm di truyền sử dụng tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc Đối với vài loại cặp gen-thuốc, CPIC đưa dẫn liều dùng cụ thể Các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 số gen CYP có tính đa hình cao mà dạng đa hình chúng khiến cho bệnh nhân có khả chuyển hóa loại thuốc cụ thể khác nhau, từ mạnh tới yếu Cho tới nay, hiểu biết đa dạng di truyền nhóm gen CYP tham gia chuyển hóa thuốc người Việt Nam hạn chế Ngày nay, với vai trò dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc tương tác thuốc lâm sàng mang tính cấp bách cần đầu tư nghiên cứu Nghiên cứu tập trung vào việc phát allele biết xác định allele người Việt Nam Số liệu thu từ nghiên cứu cung cấp thông tin khoa học đa dạng di truyền gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Việt Nam Đây tiền đề có ý nghĩa đóng góp phần cho phát triển lĩnh vực di truyền dược học y học cá thể tương lai Mục tiêu nghiên cứu luận án - Xây dựng sở dữ liê ̣u về đa hiǹ h/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam - Xác định kiểu gen tần số allele 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Kinh Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự đoán chức của các biế n thể mới Các nội dung nghiên cứu luận án - Thu thập tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu 136 người Kinh Việt Nam khỏe ma ̣nh, không có quan ̣ huyế t thố ng - Xác định tất biến thể nằm vùng promoter với exon vùng biên 03 gen CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 phương pháp giải trình tự Đối với gen CYP3A5, giải triǹ h tự các vùng gen chứa các biế n thể đã đươ ̣c công bố là *3, *6, *8 *9 - Xác định biến thể số (copy number variant-CNV) gen phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA) - Xác định thành phần kiểu gen tần số allele gen CYP450 người Việt Nam - So sánh tần số mức độ phân bố allele gen CYP450 quần thể người Việt Nam so với quần thể khác - Dự đoán chức in silico đa hình/đột biến phát CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CYP450 chuyển hóa thuốc gan Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I protein biểu chủ yếu mạng lưới nội chất trơn ti thể tế bào gan biểu mô ruột non (ngồi cịn số quan khác) Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm gen giả, đặt tên CYP1A1 kết thúc CYP51P3 Các protein mã hóa CYP450 phân loại dựa độ tương đồng trình tự amino acid thành cấp độ từ họ (ví dụ: CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: CYP1A, CYP2B…) enzyme riêng lẻ (ví dụ: CYP1A1, CYP2D6…) Trong số CYP450 biểu gan CYP3A4 có mức độ biểu mạnh (chiếm 22,1%), enzyme CYP2E1 (15,3%) CYP2C9 (14,6%) tính tổng số protein gan Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vịng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất khơng vịng, khử (tách) nhóm Nalkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy) 1.2 Đa dạng di truyền gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc Các kiểu đa hình di truyền khác gen CYP450 định mặt chức kiểu hình chuyển hóa thuốc: chuyển hóa thuốc bình thường (Extensive metabolizer-EM), chuyển hóa thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc yếu (Poor MetabolizerPM) chuyển hóa cực nhanh (Ultra rapid Metabolizer-UM) Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A4/5 Năm gen CYP450 nói mã hóa cho enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% loại thuốc thường kê đơn Trong số protein thuộc 18 họ CYP450, protein có tính đa hình cao CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 CYP2C19 Bên cạnh có số protein CYP450 thuộc phân họ khác có tính đa hình thấp CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1 Về chức chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc thị trường nhất, enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 CYP2E 1.3 Ảnh hưởng đa dạng di truyền gen dược học ADR khác biệt đáp ứng thuốc ADR đáp ứng với thuốc dạng ngộ độc ý muốn dùng thuốc liều thơng thường phục vụ cho mục đích dự phịng, điều trị hay chẩn đốn điều chỉnh chức sinh lý (Theo Tổ chức Y tế giới) Đã có nhiều báo cáo ảnh hưởng biến thể thuộc gen CYP450 mã hóa cho enzyme chuyển hóa thuốc pha I đến khác biệt đáp ứng thuốc cá nhân Một số chứng cho thấy kiểu gen CYP2B6 gây kiểu hình PM (đồng hợp tử dị hợp tử kép allele *6 và/hoặc *8) có liên quan đến giảm lượng thuốc efavirenz chuyển hóa, đồng thời tăng nguy ngộ độc thuốc Đối với phenytoin, CYP2C9 đóng vai trị chuyển hóa 90% loại thuốc này, allele CYP2C9*2 *3 làm giảm hoạt tính enzyme phản ứng chuyển hóa phenytoin Bên cạnh đó, allele *4 *6 báo cáo xuất bệnh nhân có phản ứng phụ điều trị với phenytoin Các trường hợp đa hình CYP2D6 có ảnh hưởng đến chuyển hóa thuốc sử dụng điều trị ung thư, rối loạn tim mạch, rối loạn tâm thần giảm đau Ngoài enzyme chuyển hóa thuốc pha I pha II, đa hình gen mã hóa cho kênh vận chuyển thuốc góp phần tạo nên ADR 1.4 Ứng dụng triển vọng di truyền dược học lâm sàng Trong tương lai, nghiên cứu xa di truyền dược học cần phải tăng cường hợp tác nhóm nghiên cứu tồn cầu Nghiên cứu di truyền dược học cần thực thu thập mẫu phân tích tạo nên sở liệu nhằm phục vụ cho trình phát triển thuốc Trong giai đoạn thử nghiệm thuốc lâm sàng, số liệu thu di truyền dược học áp dụng nhằm dự đoán đáp ứng thuốc cá nhân cấp độ như: đáp ứng thuốc tốt, nguy ADR, không đạt hiệu điều trị Một thử thách mà lĩnh vực hệ gen dược học đối mặt cần phải phát triển phương pháp thơng lượng cao, qua phân tích chức số lượng lớn biến thể chưa rõ chức tìm sử dụng phương pháp giải trình tự hệ lượng lớn đối tượng bệnh nhân Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu tương quan toàn hệ gen đáp ứng thuốc tiến hành 1.5 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền gen CYP450 Các phương pháp sinh học phân tử áp dụng rộng rãi nghiên cứu đa dạng di truyền gen CYP450 như: giải trình tự Sanger, khuếch đại đặc hiệu cắt enzyme giới hạn (PCR-RFLP), SNP array nhằm phát đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) indel Các phương pháp sử dụng phổ biến để nghiên cứu CNV gen CYP450 bao gồm: real-time PCR, phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA), phương pháp lai so sánh toàn hệ gen (Comparative Genomic Hybridization-CGH), PCR kĩ thuật số 1.6 Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền số gen CYP450 người Việt Nam phạm vi nghiên cứu luận án Đối với nhóm gen CYP450 mã hóa cho enzyme tham gia chuyển hóa thuốc người, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Y Hà Nội Bệnh viện K Trung ương tập trung vào đa hình phổ biến CYP2D6 CYP2D6*10 Năm 2018, nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Y dược-Đại học quốc gia Hà Nội bước đầu nghiên cứu mối liên quan đa hình CYP2C19 tới tượng kết tập tiểu cầu bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp tính Việt Nam Cho đến có 06 cơng bố quốc tế tần số allele biết gây kiểu hình PM, IM UM gen CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 CYP3A5 người Việt Nam Như vậy, chưa có thơng tin toàn biến thể gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Việt Nam Luận án tập trung nghiên cứu phân bố toàn allele thuộc CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 allele với chức biết CYP3A5 (*3, *5, *6 *8) người Kinh Việt Nam sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp Ngồi ra, luận án tiến hành phân tích CNV gen nghiên cứu đối tượng người Kinh CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Một trăm ba mươi sáu người Kinh khỏe mạnh khơng có quan hệ huyết thống tuổi từ 18-35 tình nguyện tham gia vào nghiên cứu (55 nam, 81 nữ 2.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu Các máy móc, thiết bị dụng cụ thí nghiệm phục vụ cho nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số Mẫu máu ngoại vi (2ml cá thể) thu vào ống chứa máu EDTA K2 lưu giữ -200C sử dụng DNA tổng số tách chiết ExgeneTM Blood SV mini Kit (GeneAll, Hàn Quốc), sau kiểm tra điện di agrose 0,8% đo nồng độ DNA 2.3.2 Xác định nồng độ DNA tổng số 2.3.3 Khuếch đại đặc hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 dùng nghiên cứu thiết kế phần mềm Primer (v.0.4.0) dựa trình tự gen tham chiếu gen nói sở liệu NCBI Sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế, vùng promoter với tất exon vùng biên gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 đoạn gen CYP3A5 mang biến thể *3, *6, *8 *9 khuếch đại theo quy trình chuẩn Tất sản phẩm sau PCR tinh Multiscreen PCR 96 Filter Plate theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.4 Giải trình tự Sanger Khn dùng cho phản ứng PCR sản phẩm PCR đặc hiệu tinh nêu Sau tinh sản phẩm PCR giải trình tự, đoạn DNA điện di mao quản máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer Tín hiệu ghi tự động, lưu trữ phân tích máy tính 2.3.5 Phương pháp MLPA Các CNV gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 phân tích phương pháp MLPA sử dụng kit thương mại SALSA MLPA P128-C1 Cytochrome P450 Probemix Các đầu dò kit thiết kế đặc hiệu cho việc lai khuếch đại số exon 04 gen nói DNA biến tính 98oC lai với đầu dò 60oC 16h Phản ứng ghép nối tiến hành 54oC sau đoạn đầu dò ghép nối tiếp tục khuếch đại Cuối cùng, sản phẩm khuếch đại điện di mao quản nhằm phân tách đoạn theo kích thước máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer 2.3.6 Long range (LR) PCR Để xác định biến thể CYP2D6*5, phản ứng LR-PCR thực với tổng thể tích 25μl sử dụng cặp mồi tham khảo từ nghiên cứu trước Tất sản phẩm LR-PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% 2.3.7 Real-time PCR Số CYP2C9 mẫu kiểm chứng lại phương pháp real-time PCR Phản ứng real-time PCR thực sử dụng hóa chất Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) Các cặp mồi thiết kế nhằm định lượng số CYP2C9 vị trí exon Mẫu đối chứng mẫu mà trước xác định có số bình thường (2 CYP2C9) từ liệu MLPA 2.3.8 Phân tích số liệu nghiên cứu Phần mềm Bioedit sử dụng để phân tích kết giải trình tự từ máy giải trình tự tự động Trạng thái cân quần thể Hardy-Weinberg biến thể tiến hành thông qua phần mềm HAPLOVIEW Kiểm định bình phương (χ2) Fisher exact Microsoft Excel 2010 áp dụng để so sánh tần số allele gen nghiên cứu với quần thể khác giới 2.3.9 Dự đoán chức in silico biến thể Chức biến thể dự đoán sử dụng công cụ Polyphen-2, PROVEAN (cho biến thể làm thay đổi amino acid), Human Splicing Finder (cho biến thể vùng intron) MATCH (cho biến thể vùng promoter) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết từ máu ngoại vi kiểm tra điện di gel agarose 0,8% DNA tổng số thu không bị đứt gẫy có độ tinh khiết cao, với nồng độ nằm khoảng từ 19,4 đến 139,6 ng/µl 3.2 Khuếch đại đặc hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 giải trình tự Nghiên cứu tiến hành khuếch đại đặc hiệu thành cơng vùng promoter, tồn exon vùng biên gen CYP2C9, CYP2C19 đoạn gen CYP3A5 mang biến thể *3, *6, *8 *9 tổng số 100 mẫu nghiên cứu (40 nam, 60 nữ) Đối với gen CYP2D6, khuếch đại đặc hiệu thành cơng vùng promoter, tồn exon vùng biên của136 mẫu nghiên cứu (55 nam, 81 nữ) Các băng điện di có kích thước phù hợp với tính tốn lý thuyết tất sản phẩm PCR sau tinh để sử dụng cho phản ứng giải trình tự 3.3 Phân tích đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam 3.3.1 Đa hình/đột biến gen CYP2C9 Đối với CYP2C9, nghiên cứu xác định tổng số 14 biến thể Đáng ý, có biến thể CYP2C9 chưa công bố sở liệu đa hình di truyền dược học, NCBI dbSNP 1000 Genomes Những biến thể bao gồm thay đổi đơn nucleotide intron (3415C>T), (33622t>C, 38658A>G) (42801A>G), 01 biến thể xóa nucleotide intron (47543delT) biến thể thay đơn nucleotide exon (42627C>A) (Hình 3.6) Khi tiến hành xác định CNV CYP2C9 phương pháp MLPA, có 3/100 mẫu nghiên cứu xác định gen Kết MLPA kiểm tra lại real-time PCR cho thấy tương đồng 100% phương pháp Hiện tượng tăng số CYP2C9 không xác định tất 100 mẫu nghiên cứu Hình 3.6 Các biến thể vùng intron exon CYP2C9 Các biến thể xác định vùng từ intron đến intron CYP2C9, bao gồm biến thể intron biến thể exon a) 3415C>T (intron 2), b) 33622T>C (intron 6), c) 38658A>G (intron 6), e) 42801A>G (intron 7), f) 47543delT (intron 8), d) 42627C>A (exon 7) Vị trí nucleotide bị thay đổi đánh dấu mũi tên Từ số liệu thu được, nghiên cứu xác định kiểu gen CYP2C9 100 mẫu nghiên cứu (Bảng 3.3) Trong đó, kiểu gen chiếm tần số lớn đồng hợp tử kiểu dại CYP2C9*1/*1 (90%) có hoạt tính enzyme bình thường Hai kiểu gen phổ biến dị hợp tử CYP2C9*1/*3 (7%) có hoạt tính enzyme giảm (chuyển hóa thuốc trung bình) CYP2C9*1/Del (mất allele) với hoạt tính enzyme chưa rõ Từ đó, tổng số có allele CYP2C9 xác định nghiên cứu Bảng 3.8 Tần số allele CYP2C19 quần thể người Kinh Việt Nam Allele *1 *2 *3 *17 Tổng số 154 41 Tần số % (n=200) 76 20,5 2,5 n: tổng số allele quần thể 3.3.3 Đa hình/đột biến gen CYP2D6 Phương pháp giải trình tự xác định tổng số 30 biến thể 136 mẫu nghiên cứu, có biến thể Các biến thể bao gồm biến thể vùng promoter (-498C>A, -184A>T, -175A>T) (Hình 3.10), biến thể intron (2137G>C, 2988G>A) biến thể exon exon (3157G>T, 3851G>A) (Hình 3.11) Hình 3.10 Các biến thể vùng promoter CYP2D6 Nghiên cứu xác định 03 biến thể vùng promoter (sử dụng mồi ngược cho giải trìn tự): a) biến thể -175A>T, b) biến thể -184A>T, c) biến thể 498C>A Các vị trí nucleotide bị biến đổi đánh dấu mũi tên Các biến thể 11 xác định trạng thái dị hợp tử, riêng biến thể -498C>A xác định trạng thái dị hợp tử đồng hợp tử Hình 3.11 Các biến thể vùng intron exon CYP2D6 Nghiên cứu xác định biến thể intron biến thể exon CYP2D6: a) biến thể 2137G>C (intron 4), b) biến thể 2988G>A (intron 6), c) biến thể 3157G>T (exon 7), d) biến thể 3851G>A (exon 8- sử dụng mồi ngược cho giải trình tự) Các vị trí nucleotide bị biến đổi đánh dấu mũi tên Các biến thể xác định trạng thái dị hợp tử Kết phân tích số MLPA cho thấy có 12 kiểu tập hợp số CYP2D6 Một số mẫu cho thấy bị CYP2D6 kiểm tra lại ngẫu nhiên LR-PCR kết phù hợp 100% với liệu thu từ MLPA (Hình 3.15) Ngồi ra, khơng có mẫu số 136 mẫu nghiên cứu xuất biến thể tăng số CYP2D6 12 a) b) Hình.3.15 LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5 a) Sơ đồ vị trí cặp mồi sử dụng cho LR-PCR tương ứng với allele CYP2D6*1 CYP2D6*5 Đột biến allele CYP2D6 tạo sản phẩm đoạn có kích thước 3,2kb-allele *5 (cặp mồi Dup Dlow) 5,1kb-allele kiểu dại *1(cặp mồi DPKup DPKlow) Các mẫu đồng hợp tử kiểu dại xuất sản phẩm có kích thước 5,1kb b) Giếng 1: Thang DNA chuẩn, giếng 2-3: mẫu đồng hợp tử kiểu dại CYP2D6*1/*1, giếng 4-5: mẫu CYP2D6 có kiểu gen dị hợp tử CYP2D6*1/*5 Các liệu thu từ giải trình tự phân tích số MLPA kết hợp để đưa kiểu gen cuối mẫu nghiên cứu Trong số 136 mẫu nghiên cứu, có 29 kiểu gen khác xác định với tần số dao động từ 0,7% đến 22,8% Trong số đó, kiểu gen chiếm tỉ lệ nhiều CYP2D6*10/*10 (22,8%), dị hợp tử CYP2D6*1/*10 (15,4%) CYP2D6*10/*36-*10 (11%) Từ số liệu kiểu gen của136 mẫu Kinh, nghiên cứu xác định kiểu allele CYP2D6 báo cáo sở liệu PharmVar (75,37%), biến thể cấu trúc (Structual vriant-SV) (3 biến thể dạng hybrid, biến thể dạng tandem arrangements) locus CYP2D6 (16,54%) 01 CNV (mất allele) gen (8,09%) (Bảng 3.11) Trong số kiểu allele CYP2D6, allele CYP2D6*10 (gây giảm chức enzyme) chiếm tỉ lệ cao 43,75%, allele 13 CYP2D6*1 *2 (kiểu hình bình thường) chiếm tỉ lệ 18,75% 7,35% Ngoài ra, nghiên cứu xác định allele không chức CYP2D6 chiếm tỉ lệ từ 0,37% đến 8,09% (*4, *5, *14, *15 *36) Bên cạnh đó, có allele với chức chưa rõ xác định *60 (0,74%), *65 (2,94%) *86 (0,37%) Trong số biến thể dạng tandem rearrangements, CYP2D6*36-*10 biến thể chiếm tỉ lệ lớn (12,13%) Bảng 3.11 Tần số allele CYP2D6 quần thể người Kinh Việt Nam Loại biến thể/Allele SNP/indel CNV Hybrid Cấu trúc (SV) Tandem arrangements Tần số (%) Biến *1thể/Allele 18,75 Chức (Theo CPIC) Bình thường *2 7,35 Bình thường *4 0,74 Không *10 43,75 Giảm *14 0,37 Không *15 0,37 Không *60 0,74 Chưa biết *65 2,94 Chưa biết *86 0,37 Chưa biết *5 8,09 Không *13 1,547 Không *36 0,37 Không *67 0,37 Chưa biết *13-*1 0,74 Bình thường *13-*2 0,74 Bình thường *36-*36-*10 0,37 Giảm *36-*10 12,13 Giảm *68-*4 0,37 Không STT 14 Chi tiết biến thể SV CYP2D6 nghiên cứu thể Hình 3.16 Hình 3.16 Các SV CYP2D6 xác định mẫu người Kinh a) Locus gen tham chiếu CYP2D6 (màu đỏ) gen giả CYP2D7 (màu xanh) CYP2D8 (màu ghi) REP6 (màu tím) REP7 (màu đen) trình tự lặp lại nằm xi chiều CYP2D6 CYP2D7 b) Đột biến toàn CYP2D6 c) Các cấu trúc lai CYP2D6 bao gồm dạng lai CYP2D6-2D7 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D6 vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D7) CYP2D7-2D6 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D7 vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D6) d) Biến thể xếp CYP2D6, biến thể dạng bao gồm nhiều CYP2D6 nằm cạnh allele không giống Biến thể dạng phân biệt với loại biến thể tăng số lượng CYP2D6 duplication multiplication #Thông tin chi tiết SV CYP2D6 báo cáo sở liệu PharmVar (https://www.pharmvar.org/gene/CYP2D6) ∆Chi tiết SV báo cáo nghiên cứu Gaedik cộng 15 3.3.4 Đa hình/đột biến gen CYP3A5 Kết nghiên cứu không xác định tồn CYP3A5*6, *8 *9 mẫu nghiên cứu Đối với biến thể CYP3A5*3, kết giải trình tự 100 mẫu nghiên cứu xác định tồn allele trạng thái dị hợp tử *1/*3 đồng hợp tử *3/*3 (Hình 3.17) Cụ thể, có 90% số người nghiên cứu mang allele CYP3A5*3 (*1/*3 *3/*3, N=90) 10% số người mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CYP3A5*1/*1 Hình 3.17 Kết giải trình tự CYP3A5*3 a) Đồng hợp tử kiểu dại CYP3A5 *1/*1 (AA), b) Dị hợp tử CYP3A5 *1/*3 (AG), c) Đồng hợp tử đột biến CYP3A5 *3/*3 (GG) Vị trí nucleotide bị biến đổi đánh dấu mũi tên Tần số allele kiểu dại CYP3A5*1 xác định 32,5% tần số allele CYP3A5*3 (6986A>G) 67,5% (Bảng 3.12) Với tần số kiểu gen allele vậy, quần thể nghiên cứu xấp xỉ đạt trạng thái cân HardyWeinberg (p=0,9677) Bảng 3.12 Tần số kiểu gen tần số allele CYP3A5 người Kinh Việt Nam Tần số Nghiên cứu Hardy-Weinberg Kiểu gen (N=100) *1/*1 *1/*3 *3/*3 10 45 45 10,56% 43,88% 45,56% (10%) (45%) (45%) p= 0,9677 Allele (n=200) *1 *3 65 135 (32,5%) (67,5%) N: Tổng số mẫu nghiên cứu, n: Tổng số allele quần thể nghiên cứu 16 Phân tích MLPA cho thấy khơng có biến thể số CYP3A5 xác định 100 mẫu nghiên cứu Tất mẫu nghiên cứu cho tỉ lệ đầu dò sau chuẩn hóa nằm khoảng 0,8-1,2 3.4 Phân tích liên kết biến thể CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 Phân tích liên kết biến thể (Linkage disequilibrium-LD) tiến hành nhằm xác định mối liên hệ SNP sử dụng phần mềm Haploview 4.2 giá trị D’ Đối với biến thể CYP2C9, phân tích Haploview cho thấy có block thể nhóm liên kết Những marker block độ liên kết chặt chẽ với giá trị LODC) đến 87106 intron (marker 87106T>C) Đối với CYP2D6, Nghiên cứu xác định LD block kéo dài từ vị trí 214 intron (marker 214G>C) đến vị trí 245 intron (marker 245G>C) Các marker block có mối liên kết chặt với LOD # D’=1 3.5 Dự đoán chức in silico biến thể tìm thấy CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 *Dự đốn chức biến thể thuộc CYP2C9 Đối với gen CYP2C9, mơ hình HumDiv HumVar Polyphen2 đưa kết dự đoán chức biến thể 42627C>A (p.Pro363His) có khả gây hại đến protein mã hóa với Score = Tương tự, công cụ PROVEAN cho thấy kiện thay proline histidin vị trí 363 chuỗi polypeptide có khả gây hại đến protein với Score = -8.373 (Hình 3.21) Khi tiến hành so sánh trình tự amino acid lồi động vật có xương sống, liệu đưa cho thấy vị trí amino acid 363-Proline CYP2C9 có tính bảo thủ cao lồi (Hình 3.22) Phân tích Human Splicing Finder cho thấy biến thể intron CYP2C9 không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cắt nối tự nhiên mRNA 17 Hình 3.21 Dự đoán chức biến thể CYP2C9 42627C>A Polyphen (a) PROVEAN (b) Hình 3.22 Tính bảo thủ vị trí amino acid Proline 363 protein CYP2C9 Vị trí amino acid Proline 363 CYP2C9 đánh dấu với nét đứt màu đỏ *Dự đoán chức biến thể thuộc CYP2C19 Đối với biến thể CYP2C19, dự đoán Human Splicing Finder cho thấy biến thể intron CYP2C19 khơng làm thay đổi mơ hình cắt nối tự nhiên mRNA gen *Dự đoán chức biến thể thuộc CYP2D6 Để đánh giá ảnh hưởng lên q trình điều hịa phiên mã biến thể này, công cụ MATCH sử dụng để phân tích vùng trình tự mang biến thể -498C>A, -184A>T -175A>T Tuy nhiên, kết phân tích cho thấy biến thể khơng nằm vị trí kết hợp với yếu tố phiên mã promoter CYP2D6 18 Đối với gen CYP2D6, biến thể 3157G>T (exon 7) làm thay amino acid arginin thành leucine vị trí 329 (p.Arg329Leu) Phân tích Polyphen-2 cho kết thay không gây ảnh hưởng đến chức protein mã hóa (Hình 3.23a) Ngược lại, phân tích PROVEAN lại biến thể có gây hại với score = -4.236 (Hình 3.23b) Khi tiến hành kiểm tra tính bảo thủ amino acid Arginine vị trí 329 CYP2D6, liệu cho thấy amino acid có tính bảo thủ cao lồi (Hình 3.24) Đối với biến thể intron, kết phân tích cho thấy biến thể 2988G>A (intron 6) có khả làm thay đổi mơ hình cắt nối tự nhiên mRNA CYP2D6 ảnh hưởng đến trình tự nhánh (branch points) (Hình 3.23c) Trong đó, biến thể 2137G>C (intron 4) dự đốn khơng gây ảnh hưởng đến cắt nối mRNA Hình 3.23 Dự đoán chức biến thể 3157G>T 2988G>A thuộc CYP2D6 a)Dự đoán chức biến thể 3157G>T Polyphen-2, b) Dự đoán chức biến thể 3157G>T PROVEAN, c) Dự đoán ảnh hưởng tới phân cắt mRNA biến thể 2988G>A intron Hình 3.24 Tính bảo thủ vị trí amino acid Arginine 329 protein CYP2D6 Vị trí Arginine 329 CYP2D6 đánh dấu với nét đứt màu đỏ 19 3.6 So sánh tần số allele gen nghiên cứu quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới Đối với gen CYP2C9, tần số CYP2C9*3 quần thể nghiên cứu có tương đồng so sánh với quần thể khu vực châu Á người MĩPhi Tuy nhiên, tần số allele quần thể người Kinh Việt Nam có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với khu vực Nam Á (p