Nghiên cứu khoa học công nghệ BIỂU HIỆN GEN fliC CẢI BIẾN CỦA Salmonella Dublin VÀ TINH SẠCH FLAGELLIN TÁI TỔ HỢP VÕ VIẾT CƯỜNG (1), TRỊNH VĂN TOÀN (1), LÊ THỊ LAN ANH (1), ĐẶNG THỊ VIỆT HƯƠNG (1), HỒ THỊ HỒNG NHUNG (3), NGUYỄN THỊ NHUNG (2), ĐỖ THỊ HUYỀN (4), TRỊNH KHẮC SÁU (1) ĐẶT VẤN ĐỀ Flagellin protein cấu tạo nên sợi roi tế bào vi khuẩn gram âm, tham gia vào trình vận động, bám dính xâm nhiễm vào tế bào đích Flagellin vi khuẩn Salmonella có kích thước khoảng 50 kDa cấu tạo gồm vùng D0, D1, D2 D3 Vùng D0 D1 có trình tự bảo thủ thay đổi lồi, vùng D2 D3 có trình tự axit amin thay đổi [1, 2] Flagellin có khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian tế bào thơng qua khả hoạt hố miễn dịch bẩm sinh, bám vào thụ thể TLR-5 có mặt tế bào miễn dịch, tế bào biểu mô đường hô hấp phổi [3, 4] Thông qua TLR-5, flagellin cảm ứng yếu tố bảo vệ tế bào ức chế trình chết theo chương trình; thúc đẩy tái tạo mô [5] Flagellin tăng cường biểu gen hệ thống miễn dịch bẩm sinh tế bào biểu mơ người; hoạt hố tế bào mono sản xuất cytokin tiền viêm gây đáp ứng miễn dịch thích ứng [6] Flagellin có tiềm sử dụng làm tá chất để phát triển vắc xin có khả kích sinh đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào [4, 7] Đã có cơng bố khả hỗ trợ miễn dịch, bảo vệ phóng xạ flagellin Flagellin ức chế tạo thành khối u qua giúp tế bào đề kháng với nhiễm phóng xạ Nghiên cứu Vijay-Kumar cộng cho thấy chuột tiêm với μg flagellin trước chiếu toàn thân tia γ, với tổng liều Gy có khả sống sót 75%, sau 40 ngày chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu tổn thương tế bào biểu mô ruột [8] Nghiên cứu khả bảo vệ phóng xạ chế phẩm Entolimod/CBLB502 thành phần flagellin Salmonella khỉ, với liều chiếu toàn thân 6,50 - 6,75 Gy cho thấy Entolimod giảm nguy tử vong 23 lần, khả sống sót cải thiện đáng kể nhóm sử dụng chế phẩm Entolimod [9] Các nghiên cứu biểu flagellin tái tổ hợp tạo vắc xin phòng Salmonella cho gia cầm phục vụ phát triển vắc xin tái tổ hợp nước số tác giả công bố [10, 11] Tuy nhiên, đến chưa có nghiên cứu ứng dụng flagellin tái tổ hợp hỗ trợ điều trị nhiễm xạ cấp Để tạo chế phẩm hỗ trợ điều trị nhiễm xạ cấp, tiến hành tạo dịng, biểu đoạn gen fliC cải biến mã hóa protein flagellin vi khuẩn Salmonella enterica subsp enterica Serovar Dublin Escherichia coli dạng dung hợp với protein SUMO VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Gen fliC cải biến tổng hợp hãng Gene Script (Mỹ) tách dòng vector pUC57 Plasmid pSUMO3 (LifeSensors) có kích thước 5743 bp dùng làm vector biểu Chủng Escherichia coli DH5 sử dụng để nhân dòng Chủng E coli Rosetta (Novagen) dùng làm chủng biểu 54 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ - Enzyme hạn chế BsaI, SalI, T4 DNA ligase; PCR master mix 2x (Invitrogen) - Cặp mồi nhân gen fliC: F_Flic/BsaI: 5’TATATGGTCTCTAGGTATGGC ACAAGTCATTAAT 3’ R_Flic/SalI: 5’CCGGCGCGGTCGACTTAACGCAGT AAAGAGAG 3’ (Trình tự gạch chân vị trí nhận biết enzym hạn chế tương ứng); mồi T7 promotor: 5' TAATACGACTCACTATAGGG Môi trường nuôi cấy LB: pepton 15 g/L, cao nấm men 5g/L, NaCl 0,5%, pH7, kháng sinh ampicilin 100 µg/mL (Invitrogen) - Marker DNA, marker protein (Invitrogen), cột sắc ký lực Hitrap HP chelating mL (GE Healthcare) Phương pháp nghiên cứu 2.1 Thiết kế plasmid mang gen mã hóa flagellin Đoạn gen fliC mã hóa flagellin S Dublin khai thác từ GenBank có mã số AAA27081 Trình tự mã hóa 176 axit amin đầu trình tự mã hóa axit amin 402 đến 505 giữ nguyên, đoạn gen fliC thiết kế khơng chứa trình tự mã hóa vùng D2 D3 từ vị trí axit amin 177 đến 401 mà thay đoạn trình tự 48 bp mã hóa 16 axit amin (linker domain) Đoạn gen fliC cải biến có kích thước 891 bp, mã hóa 296 axit amin tổng hợp hãng Gene Script gắn vào tách dòng pUC57 tạo thành vector pUC57-fliC Gen fliC cải biến khuếch đại từ plasmid pUC57-fliC cặp mồi đặc hiệu F_Flic/BsaI R_Flic/SalI Sản phẩm PCR tinh xử lý enzym hạn chế BsaI SalI Đồng thời, vector pSUMO3 xử lý hai enzym Đoạn gen fliC vector pSUMO3 nối với T4 ligase để tạo thành plasmid tái tổ hợp pSUMO_fliC Sản phẩm ghép nối biến nạp nhân dòng tế bào E coli DH5α Tinh plasmid tái tổ hợp kiểm tra có mặt gen fliC PCR giải trình tự gen sử dụng cặp mồi T7 promoter T7 terminator Plasmid tái tổ hợp pSUMO_fliC tiếp tục biến nạp vào chủng biểu E coli Rosetta 2.2 Biểu gen fliC cải biến Lấy khuẩn lạc E coli Rosetta mang plasmid pSUMO_fliC nuôi cấy 10 mL môi trường LB chứa ampicillin 100 µg/mL (mơi trường LBAmp) nhiệt độ 37°C, 250 vòng/phút 16 Dịch tế bào chuyển sang 10 mL môi trường LBAmp với mật độ tế bào ban đầu OD600 = 0,1 Tiếp tục nuôi cấy mật độ tế bào đạt giá trị OD600 = 0,4 - 0,6 tiến hành cảm ứng với IPTG tới nồng độ cuối 0,5 mM Sau nuôi cấy, tế bào thu lại ly tâm 5000 vịng/phút phút Tế bào hồ lại đệm 10 mM PBS, pH = 7,4 để đạt OD600 = 10 Protein tổng số điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6% Mẫu tế bào bảo quản -80oC 2.3 Thu nhận tinh flagellin tái tổ hợp Tế bào chủng E coli Rosetta mang plasmid tái tổ hợp pSUMO_fliC sau nuôi cấy cảm ứng thu nhận ly tâm 8000 vịng/phút phút, sau tế bào hoà lại đệm 10 mM PBS, pH = 7,4 để đạt OD600 = 10 Tiến hành siêu âm phá tế bào vi khuẩn 30 phút điều kiện lạnh Ly tâm 8000 vịng/phút Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 55 Nghiên cứu khoa học công nghệ 10 phút, thu lấy dịch - pha tan S1 phần tủa - pha không tan P1 Điện di kiểm tra protein gel polyacrylamide 12,6% Phần tủa hòa tan đệm A (10 mM PBS, pH 7,4; 0,5 mM EDTA; 1% Triton X-100; M ure) Ly tâm 8000 vòng/phút 10 phút thu lấy dịch Protein pha tan không tan kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% Protein tái tổ hợp tinh cột sắc ký lực Ni2+ Hitrap HP chelating mL (GE) Quy trình tinh thực theo bước sau: (1) Rửa cột 25 mL nước cất lần; (2) Rửa cột 25 mL dung dịch đệm B (10 mM PBS, pH 8,0; 1% Triton X-100; M urea, 10 mM imidazole); (3): bơm 20 mL dung dịch protein tái tổ hợp đệm B lên cột, protein tái tổ hợp có gắn histidine có lực mạnh với niken giữ lại cột, lặp lại bước để loại bỏ protein bám không đặc hiệu cột; (4): Protein tái tổ hợp đẩy khỏi cột 10 mL dung dịch đệm C (10 mM PBS, pH 8,0; 1% Triton X-100; M ure, 100 mM imidazole) Các phân đoạn protein kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% Phương pháp đọc trình tự axit amin LC/MS Phương pháp đọc trình tự protein thực theo mô tả Hãng Proteomics International Các mẫu protein tinh phân mảnh sử dụng trypsin tạo thành đoạn peptit đạt tiêu chuẩn phân tích (thường 20 axit amin) Sau đó, đoạn peptide phân tích phân tích LC-MS, sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1260 Infinity HPLC, acid amin phân tách Các peptit có kích thước vào thiết bị phun Agilent 1260 Chipcube Nanospray máy quang phổ khối Agilent 6540 Các peptid phun tơi thành giọt nhỏ đa điện tích khỏi đầu kim phun tích điện bay vào phận phân tích khối máy khối phổ MS Các peptide tải lên cột ProtID-Chip-150 C18 sử dụng pha động gradien gồm nước/ acetonitrile/axit formic 0,1% (v/v) đóng vai trị phân tách peptit tối ưu cường độ tín hiệu Các tín hiệu quang phổ phân tích để xác định protein quan tâm phần mềm Mascot sequence matching với sở liệu MSPnr100database KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thiết kế vector biểu gen fliC Đoạn gen fliC khuếch đại phản ứng PCR từ khuôn plasmid pUC_fliC cặp mồi F_Flic/BsaI R_Flic/SalI Sản phẩm PCR tinh kit GenJet PCR kiểm tra kích thước điện di gel agarose 1% Kết phân tích điện di gel agarose 1% cho thấy đường chạy xuất băng DNA có kích thước xấp xỉ 900 bp tương ứng với kích thước gen fliC (hình 1) Gen fliC sau ghép nối vào vector biểu pSUMO3 Sản phẩm ghép nối biến nạp nhân dòng tế bào E coli DH5α Plasmid tái tổ hợp tách chiết từ dòng biến nạp kiểm tra kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi T7 promoter R_FliC/SalI Theo lý thuyết từ vị trí T7 promotor đến vị trí đa điểm tách dịng vector pSUMO3 khoảng 400 bp, sau gen fliC ghép nối vào vector pSUMO3, sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi T7 promoter R_FliC/SalI với khn 56 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ plasmid pSUMO_fliC tái tổ hợp có kích thước khoảng 1300 bp Kết phân tích điện di gel agarose 1% cho thấy đường chạy 4, (hình 1) xuất băng DNA có kích thước khoảng 1300 bp tương ứng với kích thước gen SUMO-fliC bp M bp 100000 10000 6000 6000 4000 4000 3000 2000 1500 1000 700 500 300 M 3000 2000 1500 fliC SUMO-fliC 1000 700 500 300 Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen fliC gel agarose 1% M: marker 1kb; đường chạy 1, 3: đối chứng âm; đường chạy 2: sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi F_Flic/BsaI R_Flic/SalI; đường chạy 4,5: sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi T7 promoter R_FliC/SalI Để kết luận chắn gen fliC ghép nối vào vector pSUMO3, tiến hành giải trình tự gen plasmid pSUMO_fliC với cặp mồi T7 promoter T7 terminator (hình 2) Kết xác định so sánh trình tự nucleotide cho thấy trình tự gen fliC vector biểu tương đồng gen thiết kế 100% Như gen fliC cải biến ghép nối thành công vào vector biểu pSUMO3 ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAG CAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCCAATGGCACAAGTCAT TAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCTCAGTCCTC ACTGAGTTCCGCTATTGAGCGTCTGTCCTCTGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGA CGATGCGGCAGGCCAGGCGATTGCTAACCGCTTCACTTCTAATATCAAAGGTCTGAC TCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGCATTTCTATTGCGCAGACCACTGAAGGTGC GCTGAATGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAGTTGTCTGTTCAGGCCA CTAACGGGACTAACTCTGATTCCGATCTGAAATCTATCCAGGATGAAATTCAGCAAC GTCTGGAAGAAATCGATCGCGTTTCTAATCAGACTCAATTTAACGGTGTTAAAGTCC TGTCTCAGGACAACCAGATGAAAATCCAGGTTGGTGCTAACGATGGTGAAACCATT ACCATCGATCTGCAAAAAATTGATGTGAAAAGCCTTGGCCTTGATGGGTTCAATGTT AATTCCCCGGGAATTTCCGGTGGTGGTGGTGGAATTCTAGACTCCATGGGTACATTA ATCAATGAAGACGCTGCCGCAGCCAAGAAAAGTACCGCTAACCCACTGGCTTCAAT TGATTCTGCATTGTCAAAAGTGGACGCAGTTCGTTCTTCTCTGGGGGCAATTCAAAA CCGTTTTGATTCAGCCATTACCAACCTTGGCAATACGGTAACCAATCTGAACTCCGC GCGTAGCCGTATCGAAGATGCTGACTATGCAACGGAAGTTTCTAATATGTCTAAAG CGCAGATTCTGCAGCAGGCTGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTTCCGC AAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA Hình Trình tự nucleotide gen fliC sau cải biến Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 57 Nghiên cứu khoa học công nghệ 3.2 Biểu gen fliC E coli Plasmid pSUMO_fliC biến nạp vào tế bào E coli Rosetta phương pháp sốc nhiệt Chủng E coli Rosetta mang plasmid tái tổ hợp pSUMO_fliC ni cấy mơi trường LB có bổ sung ampicillin đến giá trị OD khoảng 0,4 - 0,6 tiến hành cảm ứng biểu với 0,5 mM IPTG Protein tái tổ hợp sau cảm ứng kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% Trong trình thiết kế vector biểu pSUMO_fliC, gen fliC (hình 3) biểu dạng dung hợp với đoạn protein SUMO nhằm tăng hiệu suất biểu tính tan protein tái tổ hợp kDa M 70 50 40 Flagellin-SUMO 35 30 20 SUMO 15 10 Hình Biểu gen fliC dung hợp với SUMO E coli Rosetta M: marker; đường chạy 1: protein tổng số chủng E coli Rosetta mang plasmid pSUMOpro3 (đối chứng âm); đường chạy 2: protein tổng số chủng E coli Rosetta mang plasmid tái tổ hợp pSUMO_fliC Theo tính tốn lý thuyết, flagellin tái tổ hợp có trọng lượng khoảng 31 kDa, SUMO có trọng lượng khoảng 17 kDa Khi biểu dạng dung hợp SUMOfalgellin có trọng lượng 48 kDa (hình 3) Kết điện di protein tổng số chủng E coli Rosetta mang plasmid tái tổ hợp pSUMO_fliC xuất băng protein đậm kích thước khoảng 48 kDa Mẫu protein tổng số chủng E coli Rosetta mang plasmid pSUMO3 xuất băng protein khoảng 17 kDa, tương ứng với trọng lượng protein SUMO 3.2 Tinh protein SUMO-Flagellin Kết khảo sát tính tan đường chạy S1, P1 (hình 4A) cho thấy protein SUMO flagellin tái tổ hợp biểu chủ yếu dạng không tan Protein tái tổ hợp tách khỏi pha tủa cách hòa tan đệm A (10 mM PBS, pH 7,4; 0,5 mM EDTA; 1% Triton X-100, M ure) Trên vector biểu gen dung hợp SUMO-fliC thiết kế trình tự mã hóa cho axit amin histidine đầu 5’ protein tái tổ hợp tinh chế hiệu sắc ký lực cột Ni2+ Protein SUMO-flagellin tái tổ hợp đưa lên cột sắc ký lực Hitrap HP Chelating mL, 58 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ phân đoạn chứa protein sau tinh thu dung dịch đệm C (10 mM PBS, pH 8,0; 1% Triton X-100; M ure, 100 mM imidazole) Tiến hành điện di kiểm tra phân đoạn protein qua cột gel polyacrylamide 12,6% Kết cho thấy, SUMOflagellin tái tổ hợp thu chủ yếu phân đoạn E3 Độ protein tái tổ hợp phân tích phần mềm Image-Lab (Bio-Rad) cho kết 95% Hàm lượng protein sinh tổng hợp đạt 0,6 g/L môi trường kDa M TS S1 P1 S2 P2 kDa TS M S2 F W E1 E2 E3 E4 116,0 70 50 40 66,2 45,0 35,0 30 25,0 20 18,4 14,4 15 10 (A) (B) Hình Thu nhận tinh SUMO - flagellin tái tổ hợp A: Kết kiểm tra tính tan SUMO - flagellin tái tổ hợp; B: kết tinh SUMO - flagellin sắc ký lực TS: protein tổng số; M: marker; S1: protein pha tan sau siêu âm; P1: protein pha tủa sau siêu âm; S2: protein pha tan P1 đệm A bổ sung ure đến nồng độ M; P2: pha tủa P1 đệm A bổ sung ure đến nồng độ M; F: dung dịch qua cột; W: dung dịch rửa cột, E1-E4: phân đoạn protein thu nồng độ 100 mM imidazole Để đảm bảo trình tự axit amin SUMO-flagellin tổng hợp theo khung đọc mở, trình tự đoạn ngắn (10 - 15 axit amin) xác định phương pháp LC/MS, thực theo mô tả Proteomics International Phiên giải kết giải trình tự thu nhận đoạn ngắn 10 - 15 axit amin giống với trình tự axit amin flagellin thiết kế hình Như gen fliC cải biến mã hóa protein flagellin biểu thành công tế bào E coli Rosetta WP_000079822.1 Mass: 50907 Score: 351 Matches: 34(30) Sequences: 7(3) emPAI: 0.46 ref|WP_000079822.1| flagellin n=2 Tax_Id=562 [Escherichia coli] Check to include this hit in error tolerant search or archive report Query 30 42 46 Observed 366.7041 551.2686 382.5606 582.7975 Mr(expt) 731.3937 1100.5226 1144.6600 1163.5804 Mr(calc) 731.3926 1100.5210 1144.6564 1163.5782 Delta Miss Score Expect Rank Peptide K.GLTQASR.N 0.0011 29 3.3 0.0015 59 0.0024 K.DDAAGQAIANR.F R.LSSGLRINSAK.D 0.0036 17 37 K.SQSSLSSAIER.L 0.0022 (50) 0.018 Hình Phiên giải kết giải trình tự axit amin SUMO-flagellin phương pháp LC/MS Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 59 Nghiên cứu khoa học công nghệ Flagellin Salmonella spp xem tá dược tiềm nhờ khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua khả hoạt hoá miễn dịch bẩm sinh, bám vào thụ thể TLR-5 Gần số công bố cho thấy chế phẩm sinh học với thành phần flagellin có khả bảo vệ động vật thí nghiệm chiếu xạ toàn thân [8, 9] Các nghiên cứu việc cắt bỏ vùng biến đổi D2, D3 làm giảm tính kháng nguyên tăng khả bảo vệ phóng xạ của flagellin Trình tự bảo thủ D0, D1 flagellin yếu tố quan trọng gây đáp ứng miễn dịch thông qua TLR5 [1, 12] Gen fliC thiết kế dạng đơn lẻ vector pET-28a dung hợp với thioredoxin vector pET-22b(+) biểu tế bào E coli BL21 [10, 11] Ở quy mơ bình tam giác hiệu suất sinh tổng hợp flagellin đạt 0,6 g/L môi trường, tối ưu điều kiện biểu biểu hệ thống lên men hàm lượng protein tái tổ hợp đạt 1,3 g/L [13] Trong nghiên cứu trình tự gen fliC có nguồn gốc từ vi khuẩn S Dublin cải biến, loại bỏ trình tự mã hóa vùng D2, D3 kích thước 891 bp biểu dạng dung hợp với protein SUMO tế bào E coli Rosetta Protein SUMO biết đến với vai trị điều hịa cấu trúc chức protein đích tế bào Eukaryote; hoạt động giống chaperon ngăn chặn kết tụ protein trung gian, giúp hình thành cấu hình xác, nhờ cải thiện tính tan protein [14] SUMO chứng minh có khả biểu hiệu protein thuộc nhóm khó biểu dạng đơn matrix metalloproteinase 13, protein vỏ VP1 VP3 vi rút gây bệnh chân tay miệng [15, 16] Hàm lượng protein tái tổ hợp thu quy mơ bình tam giác đạt 0,6 g/L Mặc dù phần lớn flagellin biểu pha không tan nhiên việc thiết lập, tối ưu điều kiện biểu giúp tăng hiệu suất sinh tổng hợp cải thiện tính tan protein tái tổ hợp Sau biểu thành công, flagellin cắt khỏi SUMO sử dụng làm dược chất để bào chế chế phẩm hỗ trợ điều trị nhiễm xạ cấp KẾT LUẬN Đã biểu thành công gen fliC cải biến dạng dung hợp với protein SUMO tế bào E coli Rosetta Protein SUMO-flagellin tái tổ hợp có trọng lượng khoảng 48 kDa biểu với hàm lượng 0,6 g/L, chủ yếu dạng thể vùi Protein SUMO-flagellin thu nhận từ pha không tan dung dịch đệm chứa ure M, sau tinh sắc ký lực, độ tinh đạt 95% TÀI LIỆU THAM KHẢO Forstnerič V., Ivičak-Kocjan K., Plaper T., Jerala R., Benčina M., The role of the C-terminal DO domain of flagellin in activation of Toll like receptor 5, PLoS Pathog., 2017, 13(8):e1006574 Song W., Jeon Y., Namgung B et al., A conserved TLR5 binding and activation hot spot on flagellin, Sci Rep., 2017, 7:40878 Simon R., Samuel C E., Activation of NF-B-dependent gene expression by Salmonella flagellins FliC and FljB, Biochem Biophys Res Commun., 2007, 355(1):280-285 60 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 ... Đoạn gen fliC cải biến có kích thước 891 bp, mã hóa 296 axit amin tổng hợp hãng Gene Script gắn vào tách dòng pUC57 tạo thành vector pUC57 -fliC Gen fliC cải biến khuếch đại từ plasmid pUC57 -fliC. .. vector biểu pSUMO _fliC, gen fliC (hình 3) biểu dạng dung hợp với đoạn protein SUMO nhằm tăng hiệu suất biểu tính tan protein tái tổ hợp kDa M 70 50 40 Flagellin- SUMO 35 30 20 SUMO 15 10 Hình Biểu gen. .. pSUMO _fliC Sản phẩm ghép nối biến nạp nhân dòng tế bào E coli DH5α Tinh plasmid tái tổ hợp kiểm tra có mặt gen fliC PCR giải trình tự gen sử dụng cặp mồi T7 promoter T7 terminator Plasmid tái tổ hợp