Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch mangiferin từ lá xoài và đề xuất ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm dành cho người tiểu đường

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG D cD ho NGHI N C U THU NH N TINH SẠCH MANGIFERIN T Á OÀI VÀ ĐỀ UẤT NG DỤNG VÀO SẢN PHẨM THỰC PHẨM DÀNH CHO NGƢỜI TIỂU ĐƢỜNG Mã số: B2018-ĐN02-45 aN g an Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN THỊ TRÚC OAN Đà Nẵng 07/2021 i g an aN cD ho D ii NHỮNG THÀNH VI N THAM GIA NGHI N C U ĐỀ TÀI STT Họ tên TS Nguyễn Thị Trúc Loan ThS Bùi Viết Cường ThS Đặng Thanh Long ThS Trần Thị Ánh Tuyết Khoa Hóa, Trường ĐH Bách khoa, ĐH Đà Nẵng Khoa Hóa, Trường ĐH Bách khoa, ĐH Đà Nẵng Viện sinh học, Đại học Huế ho D Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên môn g an aN cD Khoa Hóa, Trường ĐH Bách khoa, ĐH Đà Nẵng Nội dung nghiên cứu cụ thể đƣợc giao Chủ nhiệm đề tài Toàn nội dung liên quan đến đề tài Định lượng định tính dịch chiết mangiferin HPLC Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng tiểu đường Nghiên cứu sản phẩm ứng dụng iii Mục lục g an aN cD ho D THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHI N C U INFORMATION ON RESEARCH RESULTS MỞ ĐẦU MỤC TI U ĐỐI TƢỢNG PHẠM VI CÁCH TIẾP C N PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U CHƢƠNG TỔNG QUAN Ý THUYẾT 1.1 Tổng quan phân loại thực vật học vùng trồng thành phần hóa học dƣợc lý xồi 1.2 Tổng quan mangiferin 1.3 Tồng quan trình chiết tinh hợp chất thiên nhiên nói chung dịch chiết mangiferin từ xồi nói riêng 1.4 Tình hình nghiên cứu mangiferin giới Việt Nam CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U 2.1 Đối tƣợng địa điểm nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp định tính định lượng mangiferin dịch chiết cao chiết xoài, cao phân doạn mangiferin tinh 2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu xoài 2.2.3 Khảo sát so sánh số điều kiện chiết xồi dung mơi nước ethanol nhiều phương pháp chiết 2.2.4 Tối ưu hóa q trình chiết mangiferin phương pháp đáp ứng bề mặt đáp ứng (RSM) theo mơ hình Box-behnken 2.2.5 Khảo sát điều kiện tinh dịch chiết mangiferin 2.2.6 Phương pháp tính hiệu xuất thu nhận độ tinh khiết mangiferin 2.2.7 Phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa thuốc thử DPPH 2.2.8 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khoanh giấy khuếch tán mơi trường thạch 2.2.9 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 2.2.10 Phương pháp đánh giá khả kháng tiểu đường 2.2.11 Phương pháp nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm có bổ sung mangiferin từ xoài 2.2.12 Các phương pháp phân tích số tiêu hóa lý vi sinh khác 2.2.13 Phương pháp xử lý số liệu iv g an aN cD ho D CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO U N 3.1 Kết khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại mangiferin chuẩn dịch chiết mangiferin từ xồi dung mơi nƣớc ethanol 3.1.1 Bước sóng hấp thu cực đại dung dịch mangiferin chuẩn dịch chiết mangiferin dung môi nước 3.1.2 Bước sóng hấp thu cực đại dung dịch mangiferin chuẩn dịch chiết mangiferin dung môi ethanol kết xây dựng đường chuẩn 3.2 Kết khảo sát lựa chọn dung môi chiết nguyên liệu xoài 3.3 Kết khảo sát số điều kiện chiết mangiferin từ xoài dung môi nƣớc ethanol 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết mangiferin từ xồi dung môi nước 3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết mangiferin từ xồi dung mơi ethanol 3.3.3 So sánh hàm lượng mangiferin đánh giá khả kháng oxy hóa dịch chiết xồi ba phương pháp dung môi nước ethanol 3.4 Tối ƣu hóa quy trình chiết mangiferin từ xồi dung môi ethanol phƣơng pháp chiết siêu âm 3.5 Kết định tính chất mangiferin cao thô phản ứng màu đặc trƣng định lƣợng mangiferin phƣơng pháp HPLC 3.5.1 Kết định tính chất mangiferin cao thơ phản ứng màu đặc trưng 3.5.2 Kết định lượng mangiferin cao thô phương pháp HPLC 3.6 Kết nghiên cứu làm dịch chiết mangiferin từ xoài 3.6.1 Kết định lượng hàm lượng mangiferin cao phân đoạn chiết lỏng – lỏng với ethylacetate HPLC 3.6.2 Kết trình tinh mangiferin sắc ký cột silica gel pha thường rửa kết tinh dung môi khác 3.6.3 Kết tính tốn hiệu xuất thu cao thơ mangiferin tinh 3.6.4 Đề xuất quy trình chiết xuất tinh mangiferin từ xồi quy mơ phịng thí nghiệm v g an aN cD ho D 3.7 Kết đánh giá khả kháng oxy hóa kháng khuẩn cao thô cao phân đoạn mangiferin chuẩn mangiferin tinh 3.7.1 Hoạt tính kháng oxy hóa cao thô, cao lớp ethyl acetate, cao lớp ethyl acetate, mangiferin chuẩn, mangiferin 3.7.2 Kết đánh giá khả kháng khuẩn cao thô, cao ethyl acetate, mangiferin chuẩn mangiferin tinh 3.8 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ 3.9 Kết đánh giá khả kháng tiểu đƣờng mangiferin tinh 3.10 Kết đánh giá tính an tồn thực phẩm mangiferin tinh 3.11 Kết nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất số sản phẩm thực phẩm chức từ xoài dành cho ngƣời tiểu đƣờng 3.11.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bánh yến mạch bổ sung mangiferin 3.11.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sữa yến mạch bổ sung mangiferin 3.11.3 Xây dựng bảng công bố sản phẩm thực phẩm chức KẾT U N VÀ KIẾN NGHỊ vi g an aN cD ho D THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHI N C U Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu thu nhận, tinh mangiferin từ xoài đề xuất ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm dành cho người tiểu đường - Mã số: B2018-ĐN02-45 - Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Trúc Loan - Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng - Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ tháng 08 năm 2018 đến tháng 07 năm 2020) Mục tiêu: Mục tiêu 1: Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu, dung môi chiết số điều kiện chiết xồi dung mơi hữu nhiều phương pháp chiết Định lượng định tính dịch chiết xồi HPLC Tối ưu hóa đề xuất quy trình chiết làm dịch chiết Mục tiêu 2: Xác định hoạt tính sinh học: tính kháng oxy hóa, tính kháng khuẩn, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng tiểu đường khẳng định tính an tồn thực phẩm dịch chiết xoài chọn Mục tiêu 3: Sản xuất số thực phẩm chức từ mangiferin từ xoài dành cho người tiểu đường Tính sáng tạo: Sử dụng nguồn xoài già thuộc giống xoài keo trồng Đà Nẵng để trích ly mangiferin mang lại hiệu kinh tế cao so với việc sử dụng xoài non nguồn nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền sử dụng để trích ly quy mơ lớn Trong nghiên cứu so sánh đầy đủ ảnh hưởng phương pháp chiết truyền thống (chiết Shoxlet) chiết đại (chiết hỗ trợ siêu âm vi sóng) đến hiệu xuất chiết khả kháng oxy hóa dịch chiết từ xồi Nghiên cứu so sánh đầy đủ khả tinh dịch chiết thơ từ xồi phương pháp sử dụng dung mơi có độ phân cực khác nhau, phương pháp sắc kí hấp phụ hạt nhựa phương pháp sắc ký cột – phương pháp tinh xếp vào nhóm phương pháp xanh thân thiện với môi trường Đồng thời công bố đầy đủ hoạt tính kháng oxy hóa kháng khuẩn dịch chiết thô, dịch chiết phân đoạn dịch chiết sau tinh Nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm có bổ sung mangiferin với mục đích hướng đến sức khỏe người bị bệnh tiểu đường, nâng cao giá trị trị khoa học, giá trị sử dụng, giá trị kinh tế xoài khu vực miền Trung – Tây Nguyên nói riêng vii g an aN cD ho D Kết nghiên cứu: - Đã đề xuất xoài già thuộc giống xoài keo trồng Đà Nẵng làm nguyên liệu cho trình chiết mangiferin - Dung môi ethanol cho hiệu chiết cao dịch chiết ethanol cho khả kháng oxy hóa cao so với chiết dung mơi nước Ngồi hàm lượng mangiferin chiết phương pháp có hỗ trợ siêu âm cao phương pháp chiết Soxhlet phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng Đồng thời khả kháng oxi hóa dịch chiết từ phương pháp có hỗ trợ siêu âm cao so với hai phương pháp lại - Kết tối ưu hóa q trình chiết mangiferin từ xồi dung mơi ethanol phương pháp siêu âm đưa thông số chiết tối ưu sau: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) 1/10, nồng độ ethanol 58,99°, nhiệt độ siêu âm 59,29°C thời gian siêu âm 4,15 phút với hàm lượng mangiferin 0,14 µg/ml - Mangiferin tinh phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng sắc ký cột hở với pha tĩnh nhồi silicagel 60 có độ tinh khiết 94,2 %, cao so với kết nghiên cứu tinh mangiferin nhựa macroporous D101 (độ tinh khiết 68 %) nghiên cứu tinh mangiferin dung mơi có độ phân cực khác (độ tinh khiết 72 %), hiệu xuất điều chế mangiferin tinh đạt 0,82% tính theo nguyên liệu bột xoài Mangiferin tinh nồng độ 0,994mg/ml ức chế 47,1% hoạt tính enzyme α-amylase thô chiết từ hạt đại mạch thể tính an tồn thực phẩm tiêu kim loại nặng vi sinh vật - Đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cao thơ, cao phân đoạn, mangiferin chuẩn mangiferin tinh Kết cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa mangiferin tinh thu tốt với IC50 = 15,548 μg/mL, cao cao thô 1,77 lần (IC50 = 27,522 μg/mL), cao mangiferin chuẩn 1,05 lần (IC50 = 16,383 μg/mL) thấp so với vitamin C 6,09 lần (IC50 = 2,5508 μg/mL) - Đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao thô, cao phân đoạn, mangiferin chuẩn mangiferin tinh phương pháp khoanh giấy khuếch tán môi trường thạch vi khuẩn E coli, Salmonella nấm mốc Aspergillus flavus Kết cho thấy cao thơ có khả kháng tốt vi khuẩn E coli cịn cao ethylacetate có khả kháng tốt vi khuẩn E coli Salmonella Tuy nhiên, mangiferin chuẩn mangiferin tinh chưa xuất vòng kháng chủng vi sinh vật Kết cho thấy cao ethylacetate có khả kháng oxy hóa kháng khuẩn tốt, nguồn tiềm chất chống oxy hóa tự nhiên viii g an aN cD ho D tác nhân kháng khuẩn cho ngành công nghiệp dược phẩm đặc biệt thực phẩm - Đã nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm chức dành cho người tiểu đường từ yến mạch có bổ sung mangiferin bánh quy yến mạch sữa yến mạch Hai sản phẩm đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng người tiêu dùng đánh giá yêu thích mức Sản phẩm: 5.1 Sản phẩm báo Nguyen Thi Truc Loan, Dang Thanh Long, Pham Nguyen Dong Yen, Truong Thi Minh Hanh, Tri Nhut Pham, Dung Thuy Nguyen Pham, Purification Process Of Mangiferin From Mangifera Indica L Leaves And Evaluation Of Its Bioactivities, Processes 2021, 9, 852 Https://Doi.Org/10.3390/Pr9050852 Nguyen Thi Truc Loan, Исследование И Разработка Печенья Из Яхты С Прибавлениеm Мангифери- На Для Диабетиков, Сборник Научных Статей И Докладов VI Международной НаучноПрактической Конференции Продовольственная Безопасность: Научное, Кадровое И Информационное Обеспечение, ФГБОУ ВО «ВГУИТ»: ООО «РИТМ», 2019, Tr.410-420 Nguyễn Thị Trúc Loan, So Sánh Q Trình Chiết Mangiferin Từ Lá Xồi Keo Trong Dung Môi Ethanol Bằng Phương Pháp Chiết Truyền Thống Và Chiết Có Hỗ Trợ Siêu Âm, Tạp Chí Khoa Học Và Công Nghệ Đại Học Đà Nẵng, 9(130).2018, Tr 78-82 5.2 Sản phẩm sinh viên nghiên cứu khoa học Trần Thị Duyên, lớp 14H2B, Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin từ dịch chiết xồi Nguyễn Thị Mỹ Phương, lớp 14H2B, Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ bột xoài phương pháp truyền thống đại Hồ Thị Cỏ May, lớp 15H2B, Tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh Nguyễn Thị Hồng Vân, lớp 15H2B, Nghiên cứu phát triển sản phẩm sữa yến mạch bổ sung mangiferin từ xoài dành cho người bệnh đái thảo đường 5.3 Sản phẩm quy trình chiết mangiferin quy mơ phịng thí nghiệm Quy trình chiết mangiferin dung mơi ethanol phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm ix g an aN cD ho D Quy trình tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn lỏng-lỏng kết hợp sắc ký cột hở với silicagel 5.4 Sản phẩm thực phẩm chức Sản phẩm bánh quy yến mạch bổ sung mangiferin dành cho người tiểu đường Sản phẩm trà sữa yến mạch bổ sung mangiferin dành cho người tiểu đường Phƣơng thức chuyển giao địa ứng dụng tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu: Kết nghiên cứu đề tài chuyển giao công nghệ chiết xuất tinh mangiferin từ xoài sản xuất sản phẩm thực phẩm chức bánh quy yến mạch sữa yến mạch bổ sung mangiferin dành cho người tiểu đường cho công ty nhà sản xuất lĩnh vực dược phẩm thực phẩm Đề tài sử dung làm tư liệu hữu ích cho sinh viên, nhà nghiên cứu lãnh vực công nghệ thực phẩm x CHƢƠNG TỔNG QUAN Ý THUYẾT g an aN cD ho D 1.1 Tổng quan phân loại thực vật học vùng trồng thành phần hóa học dƣợc lý xồi Xồi có tên hoa học Mangifera Indica L., thuộc họ Đào lộn hột Anacardiaceae, có nguồn gốc từ n Độ đến Miến Điện trồng 4000 năm mệnh danh “The King of Asiatic Fruits” Các phận xoài, bao gồm lá, vỏ cây, hạt nguồn phong phú hợp chất có hoạt tính sinh học protein, vitamin A, vitamin C, carotenoids, hợp chất phenolic (mangiferin, catechin, quercetin, gallotannin, iriflophenones), axit gallic, axit benzoic, chất xơ, carbohydrate khoáng chất sử dụng thuốc truyền thống nhiều kỷ 1.2 Tổng quan mangiferin Mangiferin xồi polyphenol với nhiều hoạt tính dược lý quan trọng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch đặc biệt điều trị đái tháo đường loại Vì mangiferin trở thành tâm điểm nhiều nhà nghiên cứu tác dụng dược lý tìm cách để thu mangiferin tinh khiết với hiệu xuất cao để ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm, dược phẩm 1.3 Tồng quan trình chiết tinh hợp chất thiên nhiên nói chung dịch chiết mangiferin từ xồi nói riêng Hiệu suất chiết mangiferin phụ thuộc vào phương pháp chiết Các phương pháp chiết truyền thống cần thời gian chiết lâu để thu hiệu xuất chiết tốt, phương pháp đại thời gian chiết nhanh mà hiệu chiết tốt Do mục đích nghiên cứu so sánh phương pháp chiết ngâm kiệt, chiết Shoxlet, chiết hỗ trợ siêu âm vi sóng nhằm tìm phương pháp chiết mangiferin từ xoài tối ưu dựa hàm lượng mangiferin thu khả kháng oxy hóa dịch chiết Hiệu suất chiết mangiferin phụ thuộc vào dung môi chiết, theo nghiên cứu, mangiferin tan nhiều dung môi phân cực methanol, ethanol nước methanol dung môi độc hại cho người mơi trường nên nghiên cứu dùng dung mơi methanol để khảo sát q trình chiết mangiferin Dung môi nước dung môi rẻ tiền, dễ kiếm không độc hại dung mơi có nhiệt độ sơi cao (100°C), áp xuất lại nhỏ nên sau chiết khó đuổi nước khỏi dung dịch chiết Trong đó, dung mơi ethanol dung mơi rẻ tiền, dễ kiếm, chiết hợp chất có độ phân cực mạnh, yếu khác g an aN cD ho D mà không gây độc hại cho người môi trường, lại dễ loại bỏ nhiệt độ sơi ethanol thấp (78°C) Vì vậy, dung môi nước ethanol lựa chọn tối ưu cho việc trích ly mangiferin từ xồi Dịch chiết từ xồi ngồi mangiferin cịn có nhiều tạp chất khác, cần tiến hành làm mangiferin để ứng dụng vào sản phẩn hỗ trợ cho người bị bệnh tiểu đường Ở Việt Nam phổ biến sử dụng phương pháp truyền thống để tinh dịch chiết từ thực vật cách sử dụng dung mơi có độ phân cực khác để tách mangiferin từ dịch xoài dựa tính phân cực mangiferin khơng có nghiên cứu tinh mangiferin phương pháp sắc kí hấp phụ hạt nhựa phương pháp sắc ký cột – phương pháp tinh xếp vào nhóm phương pháp xanh thân thiện với mơi trường 1.4 Tình hình nghiên cứu mangiferin giới Việt Nam Hiện giới, công nghệ chiết tách ứng dụng chiết xuất từ xoài sử dụng rộng rãi dược phẩm Riêng Việt Nam, xoài sử dụng thuốc cổ truyền, chưa có nhiều cơng trình khoa học cơng bố thành phần hóa học, hoạt tính sinh học đánh giá so sánh hiệu phương pháp chiết đại, nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ xoài để sản xuất sản phẩm thực phẩm chức hồn tồn chưa đề cập đến CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U g an aN cD ho D 2.1 Đối tƣợng địa điểm nghiên cứu Lá xoài: sau hái rửa sạch, để nước, sấy khô nhiệt độ 45 – 50ºC 24 Sau nghiền mịn thành bột, kích thước 1- mm, độ ẩm < 12 % bao gói túi zip để tránh hút ẩm bảo quản nhiệt độ phòng Địa điểm nghiên cứu: - Các phịng thí nghiệm thuộc Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng - Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế - Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ môi trường, Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng - Trung tâm Quatest 2, Đà Nẵng 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp định tính định lƣợng mangiferin dịch chiết cao chiết xoài cao phân doạn mangiferin tinh Định tính mangiferin phản ứng màu đặc trưng phương pháp SKLM Định lượng mangiferin phương pháp đo quang để định lượng nhanh cách tương đối hàm lượng mangiferin dịch chiết giai đoạn nghiên cứu trình chiết mangiferin từ xồi nhanh, đơn giản tiết kiệm chi phí Định lượng hàm lượng mangiferin máy HPLC (Agilent 1260 infinity II): Điều kiện sắc ký: cột C18 (50 ì 4,6 mm, àm); pha ng l acetonitrile : axit acetic 0,5% (1 : 1, v/v), thể tích tiêm mẫu µL; tốc độ dịng 0,6 mL/phút, nhiệt độ cột 250C; bước sóng kích thích 258 nm; bước sóng phát 318 nm; đầu dị FLD (G7121A) Serial No : DEAE 302413 Trước phân tích HPLC, mẫu lọc màng lọc membrane nylon 0,22 µm 2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu xoài Tiến hành chiết mangiferin từ xoài vùng Đồng Tháp, Bình Định, Đà Nẵng loại xoài giai đoạn sinh trưởng khác (lá non, bánh tẻ, già) phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm sử dụng dung môi nước điều kiện chiết là: tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (v/w) 10/1, nồng độ ethanol 60°, thời gian siêu âm 60°C thời gian siêu âm phút Dịch chiết đem pha loãng đo độ hấp thụ quang bước sóng 318 nm 2.2.3 Khảo sát so sánh số điều kiện chiết xoài dung môi nƣớc ethanol nhiều phƣơng pháp chiết g an aN cD ho D Dựa tài liệu tham khảo kết khảo sát sơ chúng tơi bố trí thí nghiệm với việc cố định tỷ lệ nl/dm (w/v) 1/10 sau: a Trong dung môi nước + Phương pháp Soxhlet với yếu tố cần khảo sát: Thời gian (giờ): 2, 4, 6, 8, 10 + Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm với yếu tố cần khảo sát: Nhiệt độ nước: 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C; thời gian siêu âm (phút): 1, 2, 3, 4, 5, + Phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng với yếu tố cần khảo sát: Năng lượng vi sóng: 400W, 800W, 1600W; thời gian chiết (phút): 1, 3, 5, 7, b Trong dung môi ethanol + Phương pháp Soxhlet với yếu tố cần khảo sát: Nồng độ dung môi 50°, 60°, 70°, 80°; thời gian (giờ): 2, 4, + Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm với yếu tố cần khảo sát: Nồng độ dung môi 20°, 40°, 60°, 80°; nhiệt độ siêu âm: 15°C, 30°C, 45°C, 60°C, 75°C; thời gian siêu âm (phút): 1, 2, 3, 4, + Phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng với yếu tố cần khảo sát: Nồng độ dung môi 20°, 40°, 60°, 80°; lượng vi sóng: 400W, 800W, 1600W; thời gian chiết (phút): 1, 2, 3, Hàm mục tiêu hàm lượng mangiferin (đánh giá thông qua giá trị OD phương pháp đo quang đường chuẩn) hoạt tính kháng oxy hóa dịch chiết (Phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa thuốc thử DPPH) 2.2.4 Tối ƣu hóa trình chiết mangiferin phƣơng pháp đáp ứng bề mặt đáp ứng (RSM) theo mơ hình Box-behnken Tiến hành cố định yếu tố: tỉ lệ nguyên liệu / dung môi 1/10, yếu tố cần tối ưu là: nồng độ dung môi (X1), nhiệt độ siêu âm (X2), thời gian siêu âm (X3) Hàm mục tiêu Y hàm lượng mangiferin (đánh giá thông qua giá trị OD) 2.2.5 Khảo sát điều kiện tinh dịch chiết mangiferin Dựa vào kết nghiên cứu Aranya Jutiviboonsuk cộng (2010) chọn thứ tự chiết diclometan sau chiết với ethylacetate tiến hành chạy sắc ký cột với silicagel đồng thời khảo sát dung mơi làm Q trình nghiên cứu tinh kết hợp chạy HPLC SKLM 2.2.6 Phƣơng pháp tính hiệu suất thu nhận độ tinh khiết mangiferin 2.2.7 Phƣơng pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa thuốc thử DPPH g an aN cD ho D Mẫu (cao thô, cao phân đoạn lớp acetate, lớp ethyl acetate, mangiferin chuẩn, mangiferin tinh sạch) đo hoạt tính kháng oxy hóa theo quy trình Alam cs 2.2.8 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phƣơng pháp khoanh giấy khuếch tán môi trƣờng thạch Chủng vi khuẩn nấm mốc sử dụng gồm: hai chủng vi khuẩn sử dụng thử nghiệm bao gồm Escherichia coli (E coli), Salmonella nấm mốc Aspergillus flavus Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế cung cấp 2.2.9 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư mẫu mangiferin dòng tế bào: L – 60: Ung thư bạch cầu cấp người MKN7: Ung thư dày người 2.2.10 Phƣơng pháp đánh giá khả kháng tiểu đƣờng Theo nghiên cứu Aunyachulee Ganogpichayagrai cs hoạt tính kháng tiểu đường mangiferin đánh giá phương pháp ức chế hoạt tính enzyme α- amylase Phản ứng ức chế thủy phân enzyme α-amylase thực theo phương pháp đo cường độ màu phản ứng thủy phân tinh bột phương pháp thử nội KT2.K2.TN25/TP cách sử dụng enzyme α-amylase thô chiết xuất từ hạt malt (đại mạch) Thí nghiệm thực trung tâm Quatest 2- Đà Nẵng 2.2.11 Phƣơng pháp nghiên cứu phát triển sản phẩm thực phẩm có bổ sung mangiferin từ xoài 2.2.12 Các phƣơng pháp phân tích số tiêu hóa lý vi sinh khác Độ ẩm xác định phương pháp sấy khô nhiệt đọ 105 oC đến khối lương không đổi Hàm lượng carbohydrate xác định phương pháp bectorang Hàm lượng protein xác định phương pháp Kjeldah Hàm lượng lipid xác định phương pháp chiết Soxhlet Hàm lượng tro khơng tan xác định tro hóa mẫu với HCl 10% Hàm lượng kim loại nặng (Pb, Hg, Cd, As) xác định phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Các tiêu vi sinh (tổng số VSV hiếu khị khí bắt buộc, E.coli, coliform) xác định phương pháp đếm khuẩn lạc 2.2.13 Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010 phần mềm thống kê Minitab 16 Kết phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, so sánh khác biệt có ý nghĩa số liệu biểu diễn giá trị trung bình 10 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO U N 3.1 Kết khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại mangiferin chuẩn dịch chiết mangiferin từ xồi dung mơi nƣớc ethanol Kết khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại thiết bị UV-Vis cho thấy mangiferin chuẩn dịch chiết mangiferin nước ethanol có λmax= 318 nm 3.2 Kết khảo sát lựa chọn dung môi chiết nguyên liệu xoài Từ nghiên cứu tổng quan lựa chọn đồng thời dung môi nước ethanol để khảo sát trình chiết Kết thí nghiệm so sánh độ hấp thụ quang dịch chiết xoài thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang dịch chiết xoài, Abs oại oại keo Đà Nẵng Lá già bánh tẻ Lá non Độ hấp thụ quang 0,203b ± 0,001 0,206b ± 0,002 0,227a ± 0,003 ho D Đồng Tháp ( oài keo) Đà Nẵng ( ồi keo) Bình Định ( ồi mùa mƣa) Độ hấp thụ quang 0,144c ± 0,003 0,203a ± 0,001 0,162b ± 0,002 cD Chú thích: Các chữ khác kí hiệu bảng thể khác có nghĩa giá trị trung bình phân tích ANOVA chiều với mức ý nghĩa p