Nghiên cứu tách và tạo hệ nano chứa saponin từ rau má và định hướng ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc cá nhân

I.Nghiên cứu quá trình chiết xuất và tinh chế hoạt chất saponin từ Centella asỉatica, huớng tới tạo hệ nano định huớng ứng dụng cho các sản phẩm chăm sóc da. Với nội dungChuẩn bị nguyên liệu, xây dụng quy trình chiết saponin từ rau má Centella asỉatỉcaTăng độ tinh khiết của chiết xuất (loại bỏ tạp chất)Tạo hệ phân tán và khảo sát đặc điểmứng dụng hệ nano C.asiatica vào sản phẩm chăm sóc daĐánh giá các sản phẩm chăm sóc da

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ TẠO HỆ NANO

CHỨA SAPONIN TỪ RAU MÁ VÀ ĐỊNH HƯỚNG

ỨNG DỤNG TRONG SẢN PHẨM CHĂM SÓC CÁ NHÂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2019

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học :

TS Phan Nguyễn Quỳnh Anh PGS TS Lê Thị Hồng Nhan Cán bộ chấm nhận xét 1:

PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong Cán bộ chấm nhận xét 2:

PGS.TS Bạch Long Giang

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 11 tháng 1 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

2 PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN NGỌC THANH MSHV: 1770144

Ngày, tháng, năm sinh: 11/06/1994 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã số : 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tách và tạo hệ nano chứa saponin từ rau má và định huớng ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc cá nhân Tên tiếng Anh : Preparation of nano saponin systems from Centella asiatica and application in personal care products II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nghiên cứu quá trình chiết xuất và tinh chế hoạt chất saponin từ Centella asỉatica, huớng tới tạo hệ nano định huớng ứng dụng cho các sản phẩm chăm sóc da Với nội dung - Chuẩn bị nguyên liệu, xây dụng quy trình chiết saponin từ rau má Centella asỉatỉca - Tăng độ tinh khiết của chiết xuất (loại bỏ tạp chất) - Tạo hệ phân tán và khảo sát đặc điểm - ứng dụng hệ nano C.asiatica vào sản phẩm chăm sóc da - Đánh giá các sản phẩm chăm sóc da III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 13/08/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 2/12/2018

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):

TS Phan Nguyễn Quỳnh Anh

PGS TS Lê Thị Hồng Nhan

Tp HCM, ngày .2 tháng 1 năm 2019.

TRƯỞNG KHOA.

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Trước hết con không biết nói gì ngoài lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba, mẹ, anh và chị Mọisuy nghĩ bây giờ đều khó có thể diễn tả bằng lời Cảm ơn gia đình đã hỗ trợ con về mặt tinh thầnlẫn vật chất, để con có điều kiện học tập và sinh hoạt dưới ngôi trường Đại học Bách Khoa Thànhphố Hồ Chí Minh

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Bách Khoa Thànhphố Hồ Chí Minh cùng toàn thể các thầy cô giáo khoa Kỹ Thuật Hóa Học đã giảng dạy, truyền đạtkiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tàinày

Đặc biệt, xin gởi lời biết ơn vô cùng đến cô Lê Thị Hồng Nhan, cố vấn học tập đồng thời

là hướng dẫn chuyên môn, cùng những lời nhận xét của cô đã giúp em mở rộng hiểu biết, tiếp cận,nhận ra nhiều vấn đề quan họng trong quá trình thực hiện Cùng với chị Phan Nguyễn Quỳnh Anh

đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn về kiến thức, những điểm cần hướng đến trong đề tài và tạo điềukiện thuận lợi về phương tiện cũng như tài chính trong suốt thời gian em làm luận văn vừa qua

Cảm ơn bạn Nguyễn Minh Đức trong phòng thí nghiệm Bộ môn hóa hữu cơ đã giúp đỡ, hỗtrợ dụng cụ, chia sẻ những khó khăn cùng em trong lúc thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn lớp HC14HC, đặc biệt bạn Gia Huy, bạn KimNgân, bạn Ngọc Ánh, bạn Ngọc Hân, bạn Gia Bảo đã hỗ trợ, chia sẻ và đồng hành qua những khókhăn cùng những niềm vui trong suốt thời gian vừa qua

Cuối cùng, em xin kính chúc quý thầy, cô, gia đình, anh, chị và các bạn dồi dào sức khỏe

và thành công cùng những điều tốt đẹp trong cuộc sống

Xin hết lòng cảm ơn và tri ân!

TPHCM, ngày 2 tháng 1 năm 2019Học viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Thanh

TÓM TẮT

Dịch chiết cồn từ rau má Centella asỉatỉca (thu hái tại một số vùng ở miền nam Việt Nam),

có thành phần saponin tổng khoảng 24.71% (xác định bằng phuơng pháp phổ hấp thu UV/Vis) Cụthể có thành phần asiaticoside và madecassoside tuơng ứng là 7.29% và 8.63% (phuơng phápHPLC) Khi sử dụng nhụa macro HPD300 làm vật liệu hấp phụ, tạp màu đã đuợc loại bỏ một cáchhiệu quả khỏi chế phẩm, đồng thời hàm luợng asiaticoside và madecassoside cũng tăng lên rấtđáng kể lần luợt đạt 35.33% và 34.47% Hệ nano phân tán trong nuớc từ chế phẩm sau xử lý với

sụ hỗ họ của TWEEN80 và thiết bị đồng hóa bằng siêu âm có kích thuớc 1.298 pm (kích thuớcmedian) và 1.540 pm (kích thuớc mean) phân tích bởi thiết bị LDS và trong khoảng 50 - 350 nmthể hiện qua hình SEM Sau đó cả hai cao chiết và chế phẩm đuợc bổ sung vào nền sản phẩmserum cơ bản Với serum có chế phẩm thể hiện độ bền cao hơn serum có cao chiết Nhìn chung,nhũng chiết xuất từ nghiên cứu này cho thấy chúng là một phụ gia tiềm năng và hiệu quả để ứngdụng trong sản phẩm chăm sóc cá nhân, cũng nhu duợc phẩm

The ethanolic extract was prepared from Centella asiatica (harvested from Southern of

Vietnam) and had total saponin content of 24.71% (by UV/Vis spectra method) It also hadasiaticoside and madecassoside content (by HPLC method) of 7.29% and 8.63%, respectively Byusing macroresin HPD300 as an adsorbent, color impurity was removed effectively and theasiaticoside and madecassoside was remarkably raised to 35.33% and 34.47% The nanodispersion in water was formed from the treated product with supporting of TWEEN80 andultrasonic homogenizer and size of 1.298 pm (median size), 1.540 pm (mean size) by LDS and 50

- 350 nm by SEM After that, both ethanolic extract and treated product were added to serum assimulated cosmetic products By mixing the treated product, the serums had higher stability Theextracts from this study show as useful and potential additive for personal care as well aspharmaceutical products

Ill

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn làtrung thực và chưa từng có ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

TP Hồ Chí Minh, ngày 2 tháng 1 năm 2019

Nguyễn Ngọc Thanh

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT II

ABSTRACT Ill

LỜI CAM ĐOAN IV

MỤC LỤC V

DANH MỤC BẢNG VIII

DANH MỤC HÌNH ẢNH IX

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT XI

DANH MỤC PHỤ LỤC XII

MỞ ĐẦU XIII

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về cây rau má 1

1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái 1

1.1.2 Thành phần hoạt chất 2

1.1.3 ứng dụng truyền thống 3

1.2 Tổng quan về hợp chất saponin 3

1.2.1 Cấu trúc của saponin steroid 5

1.2.2 Cấu trúc của saponin triterpene 6

1.2.3 Cấu tạo của các hợp chat triterpene có trong rau má 8

1.2.4 Tính chất hóa lý của các hợp chat saponin 9

1.3 Các công trình nghiên cứu liên quan 10

1.3.1 Quy trình chiết hoạt chất trong Centella asiatica 11

1.3.2 Tạo hệ nano asiaticoside sợi bằng quá trình phosphoryl hóa hỗn hợp polymer gelatin và chitosan 11

1.3.3 Quy hình tổng hợp nano Centella asiatica bọc maltodcxtrin và gum arabic 11

1.4 ứng dụng hợp chat saponin hong thuơng mại 12

1.4.1 Lĩ nh vục thục phẩm 12

1.4.2 Lĩnh vực mỹ phẩm 13

1.4.3 Lĩnh vực dược phẩm 16

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 17

2.1 Mục tiêu đề tài 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Nguyên vật liệu và thiết bị 17

2.3.1 Centella asỉatỉca 17

2.3.2 Hóa chất 18

2.3.3 Thiết bị thục hiện 18

2.4 Phuơng pháp thục hiện 19

2.4.1 Xác định độ ẩm của mẫu 19

2.4.2 Sắc ký bản mỏng - TLC 19

2.4.3 Xác định hàm luợng saponin toàn phần trong dịch chiết 20

2.4.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC 21

2.4.5 Tạo hệ phân tán từ chiết xuất saponin triterpenoid 22

2.4.6 Phân tích kích thuớc hạt của hệ phân tán bằng thiết bị LDS 23

2.4.7 Kính hiển vi điện tử quét - SEM 24

2.4.8 Khảo sát tính chất của sản phẩm chăm sóc da 25

2.5 Nội dung thục hiện 27

2.5.1 Quy trình chiết Centella asiatica 27

2.5.2 Phuơng pháp chiết tách saponin triterpene từ rau má 28

2.5.3 Nâng cao hoạt chất trong dịch chiết 28

2.5.4 Tạo hệ phân tán từ chiết xuất Centella asỉatỉca 30

2.5.5 Phát triển công thức mỹ phẩm cơ bản chứa hoạt chất 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Nguyên vật liệu 33

3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu 33

3.1.2 Dịch chiết 34

3.1.3 Cao chiết 37

3.2 Nâng cao chất lượng cao chiết 40

3.2.1 Than hoạt tính 40

3.2.2 Nhựa HPD300 41

3.2.3 Chất lượng các chế phẩm 45

3.3 Khả năng phân tán của chế phẩm 52

3.3.1 Anh hưởng của HĐBM lên khả năng phân tán 53

3.3.2 Phân bố kích thước hạt của hệ phân tán 55

3.3.3 Kính hiển vi điện tử quét SEM 57

3.4 Định hướng ứng dụng sản phẩm chăm sóc cá nhân 58

3.4.1 Nền sản phẩm chăm sóc da cơ bản 58

3.4.2 Sản phẩm có phối hợp cao chiết 59

3.4.3 Sản phẩm có phối hợp chế phẩm 66

3.4.4 So sánh sản phẩm 72

KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

PHỤ LỤC 80

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 : Phân loại cây Centella asỉatỉca [1] 1

Bảng 1 2: Bảng các thành phần trong cây Centella asiatỉca 2

Bảng 1, 3: Hợp chat saponin chứa trong một sổ loại thực vật [7] 4

Bảng 1, 4: Công thức cầu tạo của các hợp chat saponin triterpene trong rau má 8

Bảng 1 5: Một sổ sản phẩm thương mại đi từ chiết xuất rau má [9] 14

Bảng 1 6: Các sản phẩm thương mại sử dụng chiết xuất Centella asiatica 15

Bảng 2 1: Hóa chẩt sử dụng và xuất xứ 18

Bảng 2 2: Dụng cụ và thiết bị sử dụng 18

Bảng 2 3 : Đặc tính vật lý của nhựa macroporous HPD300 30

Bảng 2 4: Câng thức nền sản phẩm serum cơ bản 32

Bảng 3 1 : Tỉnh chất của bột Centella asiatỉca khô 33

Bảng 3 2ỉ Thông tin nguyên liệu thu hái ở các địa điểm 34

Bảng 3 3 : So sánh dung môi chiết 36

Bảng 3 4 : Đặc điểm cao chiết với các dung môi 38

Bảng 3 5: Hiệu suất thu hồi saponin từ cao chiết 44

Bảng 3 6: Giá trị Rf của các saponin triterpene 46

Bảng 3 7: So sánh đặc điểm các mẫu 50

Bảng 3 8 : So sánh các sản phẩm trên thị trường 51

Bảng 3 9 : Kích thước hệ phân tán chế phẩm saponin 55

Bảng 3.10: Đặc điểm của mẫu nền serum cơ bản 58

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của cao chiết lên nền serum cơ bản 59

Bảng 3.12: Cảm quan của người dùng serum có cao chiết 60

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ chểphẩm trên nền serum cơ bản 66

Bảng 3.14: Cảm quan của người dùng serum có chểphẩm 67

Bảng 3.15: So sánh các sản phẩm serum dưỡng da có hoạt chẩt 73

48

DANH MỤC HÌNH ẢNH

•

Hình 1 1: Hình thái cây rau mả Centella asỉatỉca 1

Hình 1 2: Khung aglycone: Spỉrostan (diosgenin),Furostan (prodiosgenin) 5

Hình 1, 3: cẩu trúc khung olean 6

Hình 1, 4: cẩu trúc khung ursane 7

Hình 1, 5: cẩu trúc khung lupan (trái), hopan (phải) 7

Hình 1 6: Quy trình tạo hệ nano asỉatỉcosỉde và gĩngeroỉ bằng maltodextrin và gum Arabic [26] 12

Hình 2 1: Máy đo độ ẩm SATORIUS MA3 5 19

Hình 2 2: Máy siêu âm thanh điều khiển tự động QSonỉca LLC, model Q700 23

Hình 2 3: Thiết bị HORIBA LA 950-V2phân tích kích thước hạt 24

Hình 2 4: Thiết bị FE-SEMS4800 HITACHI 24

Hình 2 5: Không gian màu CIE LCh 25

Hình 2, 6: Sơ đồ quy trình tách chiết và tạo hê phân tán saponin từ rau má 27

Hình 3 1: Rau má tươi 33

Hình 3, 2: Dịch chiết qua ba lần, cồn 98% (a) và cồn 50% (b) 35

Hình 3 3: Biểu đồ hàm lượng saponin sau ba lần chiết cồn 98%, cồn 50% 35

Hình 3 4: Phổ hẩp thu UV-Vis của dịch chiết cồn 36

Hình 3 5: Màu sắc dịch chiết cồn 98% (trái) và cồn 50% (phải) xử lỷ bằng than hoạt tính 40

Hình 3 6: Ảnh hưởng của lượng than hoạt tỉnh đến tỉ lệ saponin tổng còn lại trong dịch chiết 41

Hình 3 7: Dịch rửa giải qua cột nhựa HPD300 42

Hình 3, 8: Khả năng rửa giải qua cột trao đổi của các nồng độ cồn 42

Hình 3 9: Lượng saponin thu nhận trong quá trình hẩp phụ - rửa giải 43

Hình 3 10: Phổ hấp thu UV-Vis của mẫu than hoạt tỉnh, cột nhựa HPD300 và TECA 45

Hình 3, 11: sắc kí bản mỏng phân tách các hợp chất trong các mẫu dịch chiết, dịch chiết, than hoạt tỉnh, chế phẩm và TECA 46

Hình 3, 12: Phổ HPLC của chất chuẩn asỉatỉcosỉde, TECA và dịch chiết (chương trình 1)

Hình 3 13: Phổ HPLC của chat chuẩn asiaticoside, madecassoside, dịch chiết và chể phẩm 49

Hình 3 14: Hệ phân tán trong nước: TECA, chểphẩm và cao chiết ban đầu (a) và sau 1 tuần (b) 52

Hình 3 15: Hệ phân tán với TWEEN20 ban đầu (a) và sau 1 tuần (b) 53

Hình 3 16: Hệ phân tản với PEG40-HCO ban đầu (a) và sau 1 tuần (b) 54

Hình 3 17: Hệ phân tán với TWEEN80 ban đầu (a) và sau 2 tuần (b) 54

Hình 3 18: Phân bổ kích thước hạt trong hệ phân tán chểphẩm saponin sử dụng TWEEN80 và TWEEN20 56

Hình 3 19: Ảnh SEM của hệ nano saponin thước đo 400 nm (a) và 500 nm (b) 57

Hình 3 20: Nền sản phẩm serum cơ bản 58

Hình 3, 21; Mức độ hài lòng của người sử dụng serum có cao chiết 61

Hình 3 22: Ảnh hưởng cơ học lên độ bền serum có cao chiết 61

Hình 3, 23: Giá trị sai biệt gốc màu delta H và sai biệt tổng màu delta E 62

Hình 3 24: Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đển giá trị sai biệt góc màu delta h 63

Hình 3 25: Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đển giá trị sai biết tổng màu delta E 63

Hình 3 26: Ảnh hưởng bởi ánh sáng đến giá trị sai biệt góc màu delta h 64

Hình 3 27: Ảnh hưởng bởi ánh sáng đến giá trị sai biệt tổng màu delta E 64

Hình 3 28: Mức độ hài lòng của người sử dụng serum có chế phẩm 68

Hình 3 29: Ảnh hưởng cơ học lên độ bền serum chứa chế phẩm 69

Hình 3 30: Giá trị sai biệt góc màu delta h và delta E trong điều kiện sốc nhiệt 69

Hình 3 31: Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đến giá trị sai biệt góc màu delta h 70

Hình 3, 32: Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đến giá trị sai biệt màu tổng delta E 70

Hình 3 33: Ảnh hưởng bởi ánh sáng đến giá trị sai biệt góc màu delta h 71

Hình 3 34: Ảnh hưởng bởi ánh sáng đến giá trị sai biệt màu tổng delta E 71

Hình 3 35: Ảnh hưởng bởi điều kiện sốc nhiệt đến hàm lượng saponin toàn phần trong các mẫu 74 Hình 3 36: Ảnh hưởng bới ánh sáng đển hàm lượng saponin toàn phần trong các mẫu 75

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Hàm lượng hoạt chẩt trong dịch chiết với cồn 98% và cồn 50% trong 3 lần 80 Phụ lục

2: Khảo sát nồng độ dung dich ethanol rửa giải 80

Phụ lục 3: Khả năng rửa giải của cột hẩp phụ trao đổi 81

Phụ lục 4: Hàm lượng saponin trong mẫu bột rửa giải 81

Phụ lục 5: Ảnh hưởng của ánh sáng lên độ ẩn bền serum có cao chiết (Sáng) 82

Phụ lục 6: Ảnh hưởng của ánh sáng lên độ ổn bền serum có cao chiết (Tối) 83

Phụ lục 7: Ảnh hưởng của nhiệt lên độ bền serum có cao chiết (Ấm) 84

Phụ lục 8: Ảnh hưởng của nhiệt lên độ bền serum có cao chiết (Lạnh) 85

Phụ lục 9: Ảnh hưởng bởi điều kiện sốc nhiệt lên độ bền serum có cao chiết 86

Phụ lục 10: Ảnh hưởng của ánh sáng lên độ ổn bền serum có chế phẩm (Sáng) 87

Phụ lục 11: Ảnh hưởng của ánh sáng lên độ ổn bền serum có chểphẩm (Tối) 88

Phụ lục 12: Ảnh hưởng của nhiệt lên độ bền serum có chểphẩm (Ấm) 89

Phụ lục 13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của serum có chểphẩm (Lạnh) 90

Phụ lục 14: Ảnh hưởng bởi điều kiện sốc nhiệt lên độ bền serum có chểphẩm 91

Phụ lục 15: Nồng độ saponin toàn phần trong 30 ngày khảo sát ở điều kiện sốc nhiệt 92 Phụ lục 16: Nồng độ saponin toàn phần trong 30 ngày khảo sát ở điều kiện ánh sáng 92

MỞ ĐẦU

Rau má thuộc họ hoa tán (Apiaceae), có tên khoa học là Centella asỉatỉca Rau má chứa

khá nhiều chất có hoạt tính sinh học nhu saponin (asiaticoside, asiatic acid, madicassoside,madecassic acid), các phytosterol, tinh dầu, các khoáng chất (Ca, Fe, Mg, p, Zn ), vitamin (Bl,B2, B3, c và K), amino acid (glutamic, serin, threonin, alanin, lysin, histidin), tanin và alkaloid

Rau má từ lâu đã đuợc nguời Trung Quốc cổ xua coi là một thảo duợc diệu kỳ Ở các nuớcĐông Nam Á rau má đuợc sử dụng nhu là một phuơng thuốc cải thiện hệ hao đổi chất, chữa cácbệnh về đuờng hô hấp nhu, hen, suyễn, lao phổi; đuờng tiết niệu, làm lành vết thuơng, vết bỏngnhanh chóng, bệnh nhiễm khuẩn vết thuơng, Các hợp chat tri terpene hong rau má đuợc quantâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng trong các lĩnh vục duợc, thục phẩm, mỹ phẩm

Nano là một cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật luôn đuợc quan tâm, nghiên cứu và pháttriển mạnh Kích thuớc hạt nano làm tăng diện tích bề mặt hạt vật liệu một cách đáng kể dẫn đentăng khả năng hoạt động và tính chất hoá lý, biến đổi kích thuớc tác động mạnh mẽ đến hoạt tínhcủa nguyên liệu với những mục tiêu ứng dụng rộng rãi Xuất phát từ mối quan tâm này em lụachọn đề tài: “Nghiên cứu tách và tạo hệ nano chứa saponin từ rau má và định hướng ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc cá nhân” để thục hiện

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây rau má

1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái

Bảng 1 1: Phân loại cây Centella asỉatỉca [1]

Hệ thống phân loại (Taxonomy)

Umbelliferae Centella

Centellaasiatica

Cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban) là một loại cây thân thảo nhỏ (họ Apiaceae), có

khoảng 30 loài trong họ, với hình dáng mảnh mai, hoa màu hắng, sống ở những vùng ẩm uớt, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [1] Rau má phân bố ở nhiều nơi ở Châu Á như: Ấn Độ, Đức, Sri Lanka, Nam Phi, úc, Indonesia, Malaysia và Việt Nam [2-4]

Hình 1.1: Hình thải cây rau mả Centella asiatica

1.1.2 Thành phần hoạt chất

Centella asiatica chứa nhiều hoạt chất chuyển hóa thứ cấp, đặc biệt là asiaticoside,

madecassoside, asiatic acid và madecassic acid thuộc nhóm saponin triterpenoid [2, 5, 6].Asiaticoside đuợc tìm thấy nhiều nhất trong tất cả các thành phần của cây, ngoài ra còn có một lượng

nhỏ tinh dầu Một số thành phần khác được công bố chứa trong c asiatica gồm flavonoid như

quercetin, kaempferol và một số phytosterol như campesterol, sitosterol và stigmasterol [7]

Các chất chuyển hóa thứ cấp là những sản phẩm thiên nhiên thường tạo từ điều kiện sinh thái

do tương tác giữa thực vật và môi trường phát hiển của chúng Có thể thu được những sản phẩm này

do điều kiện canh tác, nuôi hồng vá cải tiến các phương pháp để cây sản sinh ra những chất mongmuốn, tiếp cận các công nghệ sinh học để tăng nồng độ của các chất cần khảo sát Tầm quan họngcủa các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật trong y học, nông nghiệp và công nghiệp đã thúc đẩynhiều nghiên cứu về tổng hợp, khảo sát hoạt tính sinh học của các chất này [2, 3] Vậy tùy theo điều

kiện môi trường mà hình dạng, hình dáng hay hoạt động trao đổi chất của cây c asiatica sẽ khác

Kaepferol, glycoside, astragalin

Sesquiterpenes

CaryophylleneElemene và bicycloelemeneTrans - famesene

Ermacrene D

Betulinic acid (thankunic acid, Isothakunic acid)

Ester của acid triterpenenic và

đường

Asiaticoside AAsiaticoside B Brahmoside Thankuniside Isothankuniside

1.1.3 ứng dụng truyền thống

Từ rất lâu trước đây y học dân gian đã sử dụng rau má để điều trị các bệnh như bệnh ngoài

da, bệnh tâm thần, tăng cường trí nhớ và bệnh phong [10] Ngày nay, rau má được xem cây dược liệuquan họng, chứa các hoạt chất ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm (kem chốnglão hóa và kháng oxy hóa, kháng viêm) [11],

1.2 Tồng quan về họ’p chất saponin

Saponin là nhóm glycoside lớn những sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy đa dạngtrong các loại thực vật Sự hiện diện của các saponin được công bố có trong hơn 100 họ thực vật,đóng vai trò thiết yếu trong chế độ ăn hằng ngày Nguồn saponin chính trong các cây họ đậu như: đậunành, đậu xanh, đậu phông, , chúng còn hiện diện trong yến mạch, các họ tỏi, măng tây, trà, raubina, củ cải đường, khoai lang Saponin không chỉ phần bố ở thực vật, mà còn trong các loại nấm, vàmột số ít trong các sinh vật biển, rong biển, sao biển, [12],

Các đặc tính của saponin thể hiện qua cấu trúc chứa các aglycon và một hay nhiều gốcđường, các carbonhydrate như đường C5, C6 hay acid uronic [13] Dựa trên cấu trúc hóa học khácnhau của các khung carbon, aglycon có thể phân thành triterpenoid và steroid, khác nhau bởi nhũng

Bảng 1 3: Hợp chat saponin chứa trong một sổ loại thực vật [7]

1.2.1 Cấu trúc của saponin steroid

Saponin dạng steroid có aglycone là nhóm steroid, steroid aglycones có khung với 27 nguyên

tử carbon chia thành hai nhóm nhỏ: C-27 spirostane (nhóm lớn nhất, cấu trúc sáu vòng) và C-26furostane (cấu trúc năm vòng) [14, 15]

Nhóm spỉrostan: Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan

họng để bán tổng hợp các thuốc steroid Hai sapogenin quan họng nhất là diosgenin (có chủ yếutrong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave)

Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị

biến đổi Vòng F có thể mở, nếu xảy ra sự đóng vòng F thì chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan.Hoặc vòng F là vòng 5 Ngoài ra còn có các nhóm khác:

Nhóm aminofurostarr Ở đây vòng F mở ở vị trí C-3 đính nhóm NH2 Ví dụ jurubin, là

saponin có trong Solanum paniculatum

Nhóm spỉrosolan' Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay

bằng NH

Nhóm solanidarr Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này Ở đây 2 vòng E và F

cùng chung 1C và IN Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa

N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất glycoalcaloid

Hình 1 2: Khung aglycone: Spirostan (diosgenin) - trái, Furostan (prodiosgenin) -phải

1.2.2 Cấu trúc của saponin trỉterpene

Saponin triterpene có chứa triterpene aglycone (sapogenin) và một hoặc nhiều gốc đường liênkết với nhau thông qua các liên kết glycosidic acetal hoặc este tại một hoặc nhiều vị trí [12, 15].Triterpene aglycone khác nhau về cấu trúc hóa học và được chia thành hai loại dựa vào số lượngvòng hydrocacbon, gồm các triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

Triterpenes của C.asiatica chủ yếu là tritcrpcnc pentacyclic, thuộc loại ursane hoặc oleanane

gồm asiaticoside, madecassoside, acid asiatic, và acid madecassic [9] Thay thế methyl tren C19 vàC20 thành các phân nhóm oleanane và ursane [16], ngoài ra còn mốt số nhóm như lupan, hopan,

Nhóm olearr Phần lớn các saponin tri terpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này Phần

aglycon thường có 5 vòng Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đườngnối vào C-28 theo dây nối ester Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn vịđường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường

Nhóm ursarr cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm

methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19 Những saponin của nhóm này ítgặp hơn nhóm olean Cinchona glycosid A, cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na,asiaticoside, madecassoside có trong rau má là những saponin của nhóm

Hình 1 4: cẩu trúc khung ursane

Hình 1 5: cẩu trúc khung lupan (trái), hopan (phải)

1.2.3 Cấu tạo của các họp chất trỉterpene có trong rau má

Bảng 1 4: Cồng thức cầu tạo của các hợp chat saponin triterpene trong rau má

Danh pháp: Urs-12-en-28-oic acid, 2,3,23-trihydroxy-, 0-6- deoxy- alpha -L-mannopyranosyl -(1 fwdarw.4)-0-.beta.-D- glucopy ranosyl-(l fwdarw.6)- •beta.-D- glucopyranosyl ester,

(2.alpha., 3.beta.,4.alpha.)Công thức: C48ĨỈ78O19Asiaticoside

1.2.4 Tính chất hóa lý của các hợp chất saponin

Ban đầu các nghiên cứu thuờng sử dụng dịch chiết thô từ các cây có saponin để đánh giáhoạt tính sinh học Sự phát triển của công nghệ tách chiết, tinh chế giúp phát hiện chính xác hoạttính sinh học của nhũng cấu trúc saponin cụ thể Trong tụ nhiên saponin từ các nguồn thực vậtkhác nhau, có sự đa dạng về tính chất lý học, hóa học và đặc điểm sinh học, nhưng đa số chúng đều

có những đặc điểm cơ bản sau:

Saponin là chất hoạt động bề mặt không ion, đặc trưng bởi tính chất tạo bọt và khả năngnhũ hóa [5,17], tan trong nước làm giảm sức căng bề mặt Đa số các hoạt chất saponin có vị đắng,

dễ gây kích ứng niêm mạc Saponin là chất hoạt quang, điểm nóng chảy thường rất cao (khoảng

200 °C), tan trong nước, trong ethanol, methanol, rất ít tan trong acetone, hexane Ngoài ra còn một

số tính chất dược lý, diệt côn trùng, ký sinh trùng, động vật thân mềm, kháng khuẩn, do đósaponin được ứng dụng rộng rãi trong các loại thuốc, chất tẩy rửa, dầu gội, kem đánh răng, bánhkẹo và mỹ phẩm, [12, 13].

Hoạt tính ly giải hồng cầu: Saponin có khả năng làm căng trương, vỡ hồng cầu, tiêu huyết,

dẫn đến tăng các xét nghiệm để phát hiện sự hiện diện của saponin trong thuốc hoặc chất chiết xuất

từ thực vật, do đó saponin có độc tính cao khi tiêm vào mạch máu Nghiên cứu của Baumannet al.(2000) đã công bố do sự tương tác giữa saponin và các sterol của màng lipid kép của hồng cầu làmtăng tính thấm và màng bị vỡ [18, 19]

Hoạt tính kháng viêm: Một so saponin phân lập từ nguồn thực vật thể hiện tính kháng

viêm Frutice saponin B là một saponin bidesmosidic có nhóm saccharide không phân nhánh phân

lập từ cây Bupleurum fruticescens L (họ Apiaceae) được chứng minh là có hoạt tính kháng viêm

cao trong các xét nghiệm trên chuột [20]

Hoạt tỉnh dược: Asiaticoside và madecassoside thể hiện hoạt tính chữa lành vết thương

bằng cách tăng sự cư trú, bám dính của tế bào da, gia tăng số lượng các nguyên bào sợi, ngoài racòn có tính chống bức xạ cao, kháng oxy hóa và bảo vệ thần kinh Asiatic acid và madecassic acidđược nhận thấy có hiệu quả trong việc ngăn chặn sự phân chia của tế bào ung thư gan người, ung

thư đại tràng, ung thư vú và khối u ác tính [4, 21], Asiaticoside phân lập từ Centella asỉatỉca, cho

thấy thúc đầy đáng kể sự tổng hợp collagen loại I từ tế bào nguyên bào sợi da người, tác độngmạnh mẽ lên việc duy trì làn da khỏe mạnh và ngăn chặn có hiệu quả hiện tượng lão hóa [21-23]

1.3 Các công trình nghiên cứu liên quan

Thành phần triterpenoid chính trong chiết xuất của rau má là asiaticoside, madecassoside,asiatic acid và madecassic acid Quá trình tinh chế và phân tách để thu được riêng biệt những thànhphần riêng trcn từ cây rau má đòi hỏi phải kết hựp thực hiện nhiều bước Tuy nhiên, khi tiến hànhtinh chế với hiệu suất cao thường đem lại sản phẩm có tính kinh tế thấp vì tốn nhiều chi phí Vì thếnhiều nghiên cứu tập trung khảo sát tiềm năng của một nhóm thành phần với việc sử dụng nhữngdung môi thích hợp để ứng dụng vào mỹ phẩm và dược phẩm hơn là tinh chế tạo thành phần tinhkhiết

1.3.1 Quy trình chiết hoạt chất trong Centella asiatica

Lá (nguyên liệu tuơi) được cân, cắt và được chiết với cồn tuyệt đối (1:12, w/v) để tách cácchất chuyển hóa thứ cấp Hỗn hợp được khuấy từ trong 24 giờ sau đó ly tâm Mau được đem lọc và

cô quay chân không ở 45 °C thu được cao triterpene saponin [5]

Nguyên liệu khô (Centella asiatica) cũng được chiết xuất bằng cách ngấm kiệt với dung

dịch propylene glycol 80% Bột khô còn được chiết với 50 ml (tỉ lệ 1:10) methanol 80%, dịch chiếtđược lọc và dịch lọc được làm bay hơi bằng thiết bị cô quay chân không Theo một phương pháp

khác, lá tươi của cây Centella asỉatỉca được sấy khô ở 40 °C và nghiền thành bột, sau đó được

chiết bằng ethanol hong thiết bị Soxhlet Chiết xuất chất lỏng màu xanh đem cô quay, cao chiết thuđược được đông khô và bảo quản ở 4 °C [24]

gelatin và chitosan

Theo Sudrajat và các cộng sự: Chitosan (mức độ acetyl hóa 75-85%, MW 50,000) vàgelatin (từ da bò), sodium tripolyphosphate (TPP) và dung dịch đệm phosphate (PBS pH 7.4),asiaticoside và acid acetic Hòa tan 22 g gelatin, 50 mg chitosan và ethylene glycol trong acidacetic 70% khuấy đều và hòa tan hoàn toàn hong 24 giờ Sau đó thêm TPP vào hệ gelatin-chitosan

để phosphoryl hóa Xác định độ dẫn và pH dung dịch Dung dịch được chuẩn bị trong một ốngtiêm có đường kính 0.8 mm Tốc độ dòng chảy của dung dịch (0.3 ml/h) được kiểm soát bằng bơmtiêm, đồng thời áp một điện áp 7.5 kv Một tấm nhôm nằm cách đầu ống kim tiêm 10 cm để thuthập sợi nano [25]

1.3.3 Quy trình tổng hợp nano Centella asiatica bọc maltodextrin và gum arabỉc

Theo nghiên cứu của Meliana và các cộng sự: Maltodextrin và gum arabic được nghiền sơ

bộ bằng máy nghiền bi trong 4 giờ Dung dịch chất mang chứa hai polymer trên sau đó được hòa

tan trong nước, dịch chiết Centella asiatica (2.5%) và chiết xuất Zingiber officinale (1%) hòa tan

trong ethanol trước rồi thêm thật chậm vào hệ polymer đã chuẩn bị trước với tỉ lệ polymer và hoạtchất là 4:1 Sử dụng máy đồng hóa với tốc độ cao để tạo hỗn hợp đồng nhất Sau cùng hỗn họpđược sấy phun để thu được bột nano [26]

Hình 1 6: Quy trình tạo hệ nano asỉaticosỉde và gingerol bằng maltodextrỉn và gum Arabic [26]

1.4 ứng dụng họp chất saponin trong thương mại

Các tính chất hóa lý và sinh học đa dạng của saponin đã được khai thác thành công trongmột số ứng dụng thương mại trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

1.4.1 Lĩnh vực thực phẩm

Chiết xuất saponin từ cây Yucca và Quillaja được EU phân loại là chất tạo bọt để sử dụngtrong các đồ uống không cồn, có gas và không có gas (200 mg/lít) (Public for Publications ofEuropean Communities, 1996) Saponin còn được sử dụng hong thực phẩm như tác nhân khángkhuẩn, kháng nấm men Chiết xuất nhân sâm Hàn Quốc được gọi là saponia ứng dụng trong thựcphẩm chức năng Sự kết họp giữa saponin với cholesterol dùng để loại bỏ cholesterol từ các sảnphẩm sữa, dầu, bơ hay kết tủa có chọn lọc chất béo từ phô mai [12]

1.4.2 Lĩnh vực mỹ phẩm

Do các đặc tính hoạt động bề mặt, các chất saponin được sử dụng như chất hoạt động bềmặt tự nhiên trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân như gel tắm, dầu gội, dầu xả, sữa tắm, súcmiệng và kem đánh răng, sản phẩm chăm sóc trẻ em [12], Saponin và sapogenin cũng được bántrên thị trường như là thành phần hoạt tính sinh học trong công thức mỹ phẩm ngăn ngừa mụn vàquá trình lão hóa của da

Trong công nghiệp mỹ phẩm, nền tảng được thiết kế phổ biến nhất bao gồm micelles,micelles polyme, dendrimer, liposomes niosomes, ethosomes, hạt nano glycosome và nanocapsule.Các hạt nhỏ hơn có thể được hấp thụ dễ dàng hơn vào da để tối ưu hóa việc phân phối các thànhphần chức năng vào da và cho phép các nguyên liệu này tiếp cận vùng hành động nhanh hơn Côngnghệ nano từ chiết xuất thảo dược trong các sản phẩm chống lão hóa Asiaticoside chiết xuất từ

Centella asiatica giúp tăng tổng hợp collagen và do đó hiệu quả chống nếp nhăn Nguyên nhân chủ

yếu gây lão hóa da liên quan đến sự giảm mức độ collagen loại I, thành phần chính của lớp hạ bì

da Chất chiết xuất từ nhà máy đã được xây dựng thành nhiều sản phẩm thương mại bao gồmCollaven™, Emdecassol™, Madecassol™, Centelase™, Marticassol™, Blastoestimulina™ vàTrofolastin™ [27]

Bảng 1 5: Một sổ sản phẩm thương mại đi từ chiết xuất rau má [9]

Chống lão hóa, dùng sau liệu pháp laser, duợc mỹ phẩm

Titrated Extract of

Centella Asỉatỉca (TECA)

55-66% Genin34-44% Asiaticoside

Chống lão hóa, nếp nhăn, rạn nứt,

mờ sẹo

Kháng viêm, chống dị ứng, kích ứng

Genin

> 25% Asiatic acid

> 60% Madecassic acid Kháng khuẩn, trị mụn trứng cá.

Bảng 1 6: Các sản phẩm thương mại sử dụng chiết xuẩt Centella asỉatỉca

Asiaticoside, asiatic acid,madecassoside , madecassic acid, glycerin, torreya nucifera seed oil , camellia

sinensis leaf extract, opuntiacoccinellifera fruit extract, citrus unshiupeel extract, hydrogenated lecithin,palmitic acid, cetearyl glucoside,panthenol, water,

Asiaticoside, asiatic acid, madecassicacid, madecassoside, butyrospermumparkii butter, citrus grandis peel oil,lavandula angustifolia oil, rosmarinusofficinalis leaf oil, arnica montanaflower extract, beeswax, sodiumascorbyl phosphate, dextrin, glycerylstearate, panthenol, water,

1.4.3 Lĩnh vực dược phẩm.

Saponin được sử dụng trong y học cổ truyền và y học thay thế do các tính chấtdược lý của nó Ngoài việc chữa lành vết thương, saponin còn thử nghiệm đề điều trị bệnhphong, giãn tĩnh mạch, eczema, bệnh vảy nến, tiêu chảy, sốt, giảm lo âu và cải thiện trí nhớ[12],

Nhiều nghiên cứu việc phát triển saponin như là chất bổ sung trong vaccine chongười trong thập kỷ qua, dẫn đến sự phát hiển của một thế hệ vaccine mới chống lại bệnhung thư và các bệnh truyền nhiễm ở các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng trcn động vật [28].Innisffee Bija Cica Balm

Dr Jart Cicapair Cream

CHƯƠNG II: THựC NGHIỆM 2.1 Mục tiều đề tài

Nghiên cứu này nhằm khảo sát quá trình chiết xuất và tinh chế sơ bộ hoạt chất saponin từ

Centella asiatica, hướng tới tạo hệ nano để khai thác tốt các đặc tính và định hướng ứng dụng cho

sản phẩm chăm sóc cá nhân

2.2 Nội dung nghiền cứu

ứng với mục tiêu đã đề ra, nội dung nghiên cứu được thực hiện như sau:

1 Chuẩn bị và đánh giá vật liệu c asỉatỉca (sử dụng lá và thân c asiaticà)

2 Xây dựng quy trình chiết saponin từ c asỉatỉca (dung môi, nhiệt độ, thời gian, )

3 Tăng độ tinh khiết của chiết xuất (loại bỏ chất diệp lục, tạp chất, )

4 Khảo sát đặc điểm và tính chất của chiết xuất từ c asỉatỉca

5 Tạo hệ phân tán và khảo sát đặc điểm từ chiết xuất c asỉatỉca

6 ứng dụng hệ nano C.asỉatỉca vào sản phẩm chăm sóc da

7 Đánh giá các sản phẩm chăm sóc da (cảm giác, ngoại quan, tính chất vật lý, )

2.3 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.3.1 Centella asiatica

Được thu gom ở Long An, Đồng Nai và chợ tại TP.HCM sử dụng toàn bộ các bộ phận củacây trừ phần rễ

2.3.2 Hóa chất

Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng và xuất xứ

2.4 Phuong pháp thực hiện

2.4.1 Xác định độ ẩm của mẫu

Hình 2.1: Máy đo độ ẩm SATORIUSMA35

Máy phân tích độ ẩm SATORIUS MA35 được sử dụng để đo hàm lượng nước chứa trongmẫu sấy Sử dụng phương pháp nhiệt họng lượng là nhiệt được sử dụng để loại bỏ độ ẩm từ mẫu chođen khi đạt được khối lượng không đổi Sự chênh lệch khối lượng giữa mẫu ban đầu và mẫu cuốicùng được tính toán để thu được hàm lượng nước trong mẫu Mẩu được nghiền nhỏ và sau đó đưavào một đĩa nhôm và được đặt vào buồng mẫu tiến hành đo

Hàm lượng nước chứa trong mẫu được tính theo công thức:

w =

—— -n

W : hàm lượng nước chứa trong mẫu (%)

Wj : hàm lượng nước trong mỗi lần đo (%)

n : số lần đo

2.4.2 Sắc ký bản mỏng - TLC

Sắc kí giấy - TLC được sử dụng phổ biến để phân tích các saponin tiện lợi, dễ thực hiệncũng như đánh giá và so sánh sơ bộ các thành phần trong hỗn hợp phức tạp với hệ dung môi đa dạng[5, 29-32], 3pL mẫu chuẩn và các mẫu phân tích được thực hiện riêng biệt trên một tấm silica gel.Theo Zainol và cộng sự hệ thống dung môi được sử dụng kết hợp gồm etyl acetate: methanol: nướctheo tỉ lệ 8: 2: 1 Tấm silica được đặt vào buồng chạy sắc ký có chứa sẵn dung môi khai hiển Chờcho dung môi chạy đến vạch định sẵn để tách các thành phần Các vết khác nhau được phát hiệnbằng thuốc thử là hỗn hợp V ml dung dịch vanillin 0.1% và V ml sulfuric acid 10% So sánh màusắc, hình dạng vết, khoảng cách của mẫu thử với mẫu chuẩn và tính thông số Rf [10]

2,4,3 Xác định hàm lượng saponin toàn phần trong dịch chiết

Hàm lượng tổng saponin của dịch chiết được xác định bằng phương pháp vanillinsulfuricacid [33] Dịch chiết được thực hiện phản ứng với vanillin (8%, w/v) và sulfuric acid (72%, w/v).Hỗn hợp được ủ ở 60 °C trong 10 phút, sau đó làm nguội trong nước đá trong 15 phút, tiếp theo là

đo độ hấp thu ở bước sóng 538 nm [13]

Dung dịch 8% (w/v); 800 mg vanillin được hòa tan trong 10 ml 99.5% (v/v) ethanol Dungdịch acid sulfuric 72% (v/v): 72 mL sulfuric acid (98.0% w/w) được hỗn hòa vào 28 ml nước cất

Lập đường chuẩn: Saponin chuẩn được cân chính xác (100 mg) được hòa tan trong dungdịch ethanol 80% (v/v) trong bình định mức 10ml 0.5 ml dung dịch saponin chuẩn ở các nồng độkhác nhau là 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 và 0.6 mg/ml được chuẩn bị từ dung dịch saponin chuẩn 10mg/ml được cho vào ống nghiệm tương ứng Sau đó thêm lần lượt 0.5 ml dung dịch vanillin và 5 mlsulfuric acid lắc đều và ngâm lạnh Hỗn hợp được làm ấm ở 60 °C trong 10 phút, sau đó làm lạnhtrong nước đá trong 10 phút Độ hấp thu được xác định ở bước sóng 538 nm, đo lặp lại 3 lần và lấygiá trị trung bình cho mỗi nồng độ Các kết quả phân tích thực hiện trên thiết bị đo quang phổ hấpthu UV/Vis HELIOS EPSILON tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ thuật hóa Hữu cơ, khoa Kỹ thuậtHóa học

Tính toán kết quả: Từ độ hấp thu của dung dịch oleanolic acid tại các nồng độ khảo sát,dựng được đồ thị đường chuẩn

Mối quan hệ giữa độ hấp thu và nồng độ của oleanolic acid theo phương trình sau:

A = 1.9015xC + 0.0314, R2 = 0.9953Với A - Độ hấp thu tại bước sóng 538 nm c - Nồng độ của oleanolic acid (mg/ml)

Nồng độ saponin toàn phần trong dịch chiết được tính theo công thức:

m - khối lượng cao (g)

2.4.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hiện nay được sử dụng rất phổ biến do ưuđiểm nhanh, nhạy và chính xác Sử dụng một dung môi thích hợp để tách các saponin tritcrpcnc

trong Centella asiatica đồng thời định tính và định lượng các thành phần trong dịch chiết Thời gian

lưu của các chất sẽ khác nhau tùy thuộc vào sự tương tác của các chất với pha tĩnh và pha động(dung môi) Khi mẫu đi qua cột, nó tương tác giữa hai pha với tốc độ khác nhau, chủ yếu là do sựphân cực khác nhau Các chất tương tác ít với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột nhanh hơn Các khảo sát đượctiến hành với máy HPLC Agilent 1260, tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ Thuật Hữu cơ, khoa KỹThuật Hóa Học Với các thông số: Cột pha đảo C18 (150 X 4.6 mm; 5 mm), tiêm mẫu tự động, đầu

dò DAD

Chương trình 1: Pha động sử dụng hỗn hợp nước: acetonitrile với tỉ lệ 50: 50, điều chỉnh pH củanước khoảng 2.7-2.8 sử dụng orthophosphoric acid Đầu dò phát hiện tín hiệu bước sóng 210nm, thểtích mẫu tiêm là 5 pl, nhiệt độ cột 28 °C, tốc độ dòng 1 ml/phút

Chương trình 2: Pha động sử dụng hỗn hợp nước: acetonitrile với tỉ lệ 70: 30, điều chỉnh pH củanước khoảng 2.7-2.8 sử dụng orthophosphoric acid Đầu dò phát hiện tín hiệu bước sóng 210 nm,thể tích mẫu tiêm là 10 pl, nhiệt độ cột 28 °C, tốc độ dòng 1 ml/phút

Hàm lượng asiaticoside trong mẫu được xác định bằng cách xây dựng đường chuẩn dựa trênphương trình hồi quy theo chương trình 2, trong khoảng nồng độ 10 - 1000 pg/ml tín hiệu phát hiện

là hàm tuyến tính Đường hiệu chuẩn theo phương trình:

y = 1,3769x + 13.656, R2 = 0.9972, y ứng với diện tích các peak (mAU) và X là nồng độ(pg/ml)

Nồng độ asiaticoside trong dịch chiết và trong cao được tính lần lượt theo công thức:

(y-13.656) 1.3769

m X (1 - w) Với: V- thể tích (ml)

w - độ ẩm của cao (%)

m - khối lượng cao (mg)

Tương tự cho chuẩn madecassoside xây dựng theo chương trình 2, trong khoảng nồng độ (10 - 1000pg/ml) Đường hiệu chuẩn của madecassoside theo phương trình:

y = 1,6873x + 154.57, R2 = 0.9991, y ứng với diện tích các peak (mAU) và X là nồng độ(pg/ml)

Nồng độ madecassoside trong dịch chiết được tính theo công thức:

ừ-154.57)

c" (%) = —16873

-m X (1 - w) Với: V- thể tích (ml)

w - độ ẩm của cao (%)

m - khối lượng cao (mg)

2.4.5 Tạo hệ phân tán từ chiết xuất saponin trỉterpenoỉd

Việc áp dụng siêu âm tạo hệ phân tán ngày nay được sử dụng rộng rãi Vật liệu trong môitrường lỏng bị phá vỡ kết cấu, tăng khả năng va chạm tạo các hạt nhỏ hơn Sóng siêu âm còn tácđộng làm đồng hóa kích thước hạt và tăng diện tích bề mặt riêng của hệ Phân tán bằng siêu âm tạo

ra bọt, khi chất lỏng tiếp xúc với siêu âm, sóng âm lan truyền vào chất lỏng theo các chu kỳ áp suấtcao và áp suất thấp xen kẽ Do đó sóng siêu âm là phương pháp hiệu quả tạo hệ phân tán các tiểuphân Hệ phân tán được thực hiện dưới sự hỗ trợ của thiết bị QSonica LLC, Model Q700 tại phòngthí nghiệm bộ môn Kỹ thuật hóa Hữu cơ, khoa Kỹ thuật Hóa học

(y-13.656)1.3769 xFxlO-6