Bài dịch môn Kỹ thuật các quá trình sinh học Các bộ giảng dạy PGS TS NGUYỄN CÔNG HÀ Học viên trình bày VIÊN PHÚC ĐẠT, M2221002, Cao học Công nghệ Thực phẩm khóa 28, Khoa Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ Đ.
Bài dịch mơn: Kỹ thuật q trình sinh học Các giảng dạy: PGS.TS NGUYỄN CÔNG HÀ Học viên trình bày: VIÊN PHÚC ĐẠT, M2221002, Cao học Cơng nghệ Thực phẩm khóa 28, Khoa Nơng Nghiệp, Đại học Cần Thơ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA PLASMID VÀ SỰ ĐỘNG HỌC Ở SẢN XUẤT LIÊN TỤC CỦA GLUCOAMYLASE ĐƯỢC HÌNH THÀNH TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE TÁI TỔ HỢP TRONG NỒI PHẢN ỨNG SINH HỌC AIRLIFT Peter M Kilonzo * Argyrios Margaritis * Maurice A Bergougnou Tóm tắt Sản xuất glucoamylase Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp C468 / pGAC9 (ATCC 20690) bể phản ứng sinh học khuấy liên tục nghiên cứu tỷ lệ pha loãng khác Sự ổn định plasmid phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng (tỷ lệ pha lỗng); tăng lên theo tỷ lệ pha lỗng Năng suất lị phản ứng sinh học suất cụ thể tăng theo tỷ lệ pha lỗng Một phương trình động học sử dụng để mơ hình hóa động học ổn định plasmid Tỷ lệ tốc độ tăng trưởng tế bào mang plasmid tế bào khơng có plasmid giảm từ 1,397 xuống 1,215, ổn định phân ly xác suất plasmid từ lần phân bào giảm từ 0,059 xuống 0,020 tốc độ pha loãng tăng từ 0,10 đến 0,37 / h Tốc độ tăng trưởng cụ thể tăng theo tốc độ pha loãng, khác biệt tốc độ tăng trưởng quần thể tế bào mang plasmid không mang plasmid không đáng kể Điều cho số lượng thấp plasmid lai pGAC9 Do đó, tốc độ tăng trưởng khơng có ảnh hưởng đáng kể đến tính khơng ổn định plasmid Động học đề xuất phù hợp với kết thực nghiệm mơ hình mơ tốt liệu thực nghiệm Từ khóa: Saccharomyces cerevisiae * Glucoamylase * Động học * Tỷ lệ pha loãng * Tính ổn định plasmid Danh sách ký hiệu D Tốc độ pha loãng (1 / h) F+ Phần tế bào mang plasmid (%) F +0 Giá trị ban đầu F + thời điểm t = (%) GA Glucoamylase (U / l) M N - đến N + M0 Giá trị ban đầu M thời điểm t = N Mật độ tế bào tổng số tế bào (g / l) N+ Mật độ tế bào tế bào mang plasmid (g / l) N- Mật độ tế bào tế bào không chứa plasmid (g / l) P Năng suất (g / l / h) R Tốc độ plasmid cụ thể: R = µ + Φ (1 / h) (1 / gen) t thời gian (h) Biểu tượng Hy Lạp β Xác suất plasmid lần phân bào; β = R / µ + τ0 Tỷ lệ tốc độ tăng trưởng; τ = µ - / µ + µ+ Tốc độ tăng trưởng cụ thể tế bào mang plasmid (1 / h) µ + max Tốc độ tăng trưởng cụ thể tối đa tế bào mang plasmid (1 / h) µ- Tốc độ phát triển cụ thể tế bào không chứa plasmid (1 / h) µ - max đa Tốc độ tăng trưởng riêng tối đa tế bào không chứa plasmid (1 / h) µapp Tốc độ phát triển rõ ràng tế bào huyền phù (1 / h) γ tốc độ hình thành glucoamylase cụ thể (U / g tế bào / h) б2 Phương sai Giới thiệu Nấm men Saccharomyces cerevisiae phát triển nhanh chóng mật độ tương đối đơn giản từ trung bình đến cao với mức độ tiết sản phẩm cao Nó chứng tỏ tổ chức tế bào sinh vật nhân chuẩn có khả thực số thay đổi sau chuyển dịch, cần thiết cho toàn vẹn hầu hết protein Hơn nữa, nấm men không tạo lượng hợp lý protein tái tổ hợp, mà cịn tiết protein bên ngồi vỏ tế bào, giúp giảm chi phí xử lý hạ nguồn Hơn nữa, lượng sản phẩm phụ tiết protease thấp điều kiện không chọn lọc S cerevisiae sử dụng rộng rãi để sản xuất thương mại etanol đồ uống có cồn từ ngun liệu thơ chứa tinh bột [17] Tuy nhiên, nấm men thiếu hoạt tính amylolytic cần thiết để sử dụng tinh bột Để mở rộng phạm vi sử dụng chất nó, gen mã hóa glucoamylase (GA) nhân vào sinh vật [1, 6, 11, 28], bao gồm Aspergillus awamori glucoamylase [1,4; 1,6-aD-glucan glucohydrolase, EC 3.2 1.3] [17, 29] Do đó, S cerevisiae sử dụng sinh vật chủ để sản xuất số protein tái tổ hợp [1, 10–12, 15, 26, 27] Gần đây, Kilonzo et al [17] sử dụng chủng S cerevisiae tái tổ hợp C468 / pGAC9 (ATCC 20690) có chứa gen A awamori glucoamylase Tuy nhiên, thông tin liên quan đến việc sản xuất protein tái tổ hợp chủng nấm men tài liệu [29, 30] Trong công nghiệp sản xuất protein tái tổ hợp, mối quan tâm tính không ổn định plasmid tế bào tái tổ hợp Các tái tổ hợp có xu hướng đặc tính di truyền chúng thay đổi plasmid Đây trở ngại việc mở rộng quy mơ chủng nấm men tái tổ hợp Điều S cerevisiae nhân lên cách nảy chồi không đồng đều, dẫn đến phân chia plasmid từ tế bào mẹ sang tế bào khơng đồng Sự hình thành nhiều chồi gây vấn đề này, dẫn đến mức độ bất ổn định phân ly cao [13] Do đó, vấn đề xác suất cấp cứu tế bào khơng có plasmid S cerevisiae cao nhiều so với vi khuẩn E coli nơi mà phân hạch nhị phân đảm bảo phân phối plasmid từ tế bào mẹ sang tế bào tốt Có ba loại bất ổn plasmid: (1) Tính khơng ổn định phân chia phát sinh từ hệ thống khiếm khuyết để phân chia DNA plasmid tế bào trình phân chia tế bào; (2) tính khơng ổn định cấu trúc đề cập đến thay đổi cấu trúc DNA plasmid, chẳng hạn đoạn, chèn xếp lại, (3) tính khơng ổn định cạnh tranh cho lợi tăng trưởng tế bào plasmid so với tế bào mang plasmid, thường dẫn đến phát triển tế bào tạo plasmid tế bào không chứa plasmid điều kiện không chọn lọc [17, 22, 28] Sự không ổn định gen kết hợp với tác động yếu tố môi trường làm cho tế bào tái tổ hợp bị plasmid q trình ni cấy hàng loạt liên tục lặp lặp lại Việc plasmid tốc độ phát triển thấp tế bào tái tổ hợp trình sản xuất làm giảm đáng kể mức sản xuất sản phẩm protein mong muốn Cả yếu tố di truyền (cấu tạo plasmid, số lượng sao, mức độ biểu hiện, dấu hiệu chọn lọc, đặc tính di truyền vật chủ) yếu tố môi trường (thành phần mơi trường, sức căng oxy hịa tan, nhiệt độ, pH, tỷ lệ pha loãng, chế độ hoạt động lò phản ứng sinh học) ảnh hưởng đến ổn định plasmid nấm men tái tổ hợp Với hiểu biết ngày cao yếu tố này, tăng cường ổn định plasmid cách điều khiển thành phần cấu trúc plasmid [23], thay đổi đặc tính di truyền sinh lý tế bào chủ [2], điều khiển điều kiện mơi trường [17, 24, 25], tỷ lệ pha lỗng [13, 17, 29] chế độ hoạt động lò phản ứng sinh học [13, 15] Người ta quan sát thấy ổn định plasmid bị ảnh hưởng đáng kể tốc độ pha loãng mẫu cấy liên tục Sử dụng môi trường chọn lọc, [7] cho thấy cấu trúc plasmid vật chủ chúng ổn định tốc độ pha loãng cao Tương tự, tính ổn định plasmid pJDB248 S cerevisiae môi trường chọn lọc nhận thấy tăng lên với tốc độ pha lỗng, tính ổn định plasmid thể đột biến phụ dưỡng S cerevisiae có chứa plasmid 2-lm tái tổ hợp tăng lên đáng kể với tốc độ tăng trưởng cao trồng môi trường chọn lọc Hơn nữa, nghiên cứu cho thấy độ ổn định plasmid pYT760-ADH1 chứa cDNA độc tố giết người môi trường nuôi cấy chemostat S cerevisiae tăng lên tỷ lệ pha loãng chức đạt 100% tỷ lệ pha loãng lớn giá trị định nuôi cấy môi trường không môi trường chọn lọc Ngược lại, môi trường không chọn lọc, độ ổn định plasmid pLG69Z gốc 2-lm nghiên cứu S cerevisiae YN124 giảm tăng tỷ lệ pha loãng Những quan sát hỗ trợ cơng trình Zhang cộng [29] người nghiên cứu biểu A awamori glucoamylase kiểm soát promoter enolase I nấm men S cervisiae lò phản ứng sinh học nâng khơng khí điều kiện khơng chọn lọc Tuy nhiên, Ibba et al [16], nghiên cứu biểu desulfotohirudin, chất ức chế thrombin, kiểm soát chất xúc tiến cấu tạo glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase, quan sát thấy tỷ lệ thất thoát plasmid thấp tất tốc độ pha lỗng (0,06–0,17 -1 ) mơi trường khơng chọn lọc Họ phát ảnh hưởng tốc độ pha loãng ổn định plasmid không đáng kể protein biểu dung nạp tốt S cerevisiase Gần đây, Gupter Mukhergee [14] nghiên cứu tính ổn định plasmid thoi Yep-51 chứa cDNA b-galactosidase q trình ni cấy liên tục chủng S cerevisiae AH22 / Yep51 phát triển môi trường chọn lọc không chọn lọc nhận thấy độ ổn định plasmid cao thấp tỷ lệ pha loãng khác môi trường chọn lọc không chọn lọc, tương ứng Từ kết trên, rõ ràng ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến độ ổn định plasmid có liên quan đến mơi trường sử dụng Tuy nhiên, ảnh hưởng xác tốc độ pha loãng ổn định plasmid chưa rõ ràng Trong cơng trình này, động học trình sản xuất glucoamylase S cerevisiae C468 / pGAC9 tái tổ hợp lò phản ứng sinh học không vận liên tục nghiên cứu Một mô hình tốn học phát triển sử dụng để đánh giá chất không ổn định plasmid ước tính mát plasmid thông số động học tăng trưởng môi trường nuôi cấy tế bào hỗn hợp liên tục (mang plasmid khơng có plasmid) Ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng đến ổn định plasmid sản xuất glucoamylase nghiên cứu báo cáo Nguyên liệu phương pháp Chủng ký chủ plasmid Chủng S cerevisiae tái tổ hợp C468 / pGAC9, tiết glucoamylase vào môi trường ngoại bào [17, 29, 30], sử dụng nghiên cứu Chủng S cerevisiae C468 / pGAC9 (ATCC 20690) chứa vector plasmid lai pGAC9 Plasmid pGAC9 chứa phần plasmid 2l nấm men (vòng trịn 2l), đoạn DNA mã hóa sản phẩm gen LEU (leucine), phần gen glucoamylase từ A awamori, kiểm soát promoter enolase I nấm men Kẻ hủy diệt Chủng ký chủ S cerevisae C468 (a leu23 leu2–112 his311 his3-15 mal-) (ATCC 62995) đơn bội, với dấu hiệu phụ dưỡng cho leucine histidine, mang đột biến (mal-) ngăn chặn việc sử dụng maltose nguồn cacbon Do đó, tế bào chủ bổ sung cho nguyên sinh leucine cách chèn dấu hiệu chọn (LEU 2) vào plasmid biểu hiện, diện gen glucoamylase plasmid cho phép tế bào chủ phát triển maltose [17] Môi trường tăng trưởng Hai phương tiện khác sử dụng nghiên cứu Môi trường YNBG chọn lọc chứa 6,7 g l-1 sở nitơ nấm men (YNB) khơng có axit amin (Sigma), 0,04 g / l L-histidine (Sigma) 20 g / l D-glucose Nuôi cấy nghiêng cổ phiếu phát triển YNBG trì YNBM có chứa 2% (w / v) maltose Môi trường chọn lọc sử dụng để chuẩn bị chất cấy cho đợt nuôi cấy q trình khởi động lị phản ứng sinh học để nuôi cấy liên tục Môi trường YEPG không chọn lọc phức hợp chứa g / l chiết xuất nấm men (Becton Dickinson), 10 g / l peptone (Becton Dickinson) 20 g / l D-glucose Nếu không điều chỉnh, độ pH môi trường 5,0 Đối với đĩa thạch, môi trường chứa 2% (w / v) Fermtech-agar Các thành phần môi trường khác D-glucose maltose YNBG, YEPG YNBM, tương ứng, khử trùng cách lọc (bộ lọc 0,2 lm) D-Glucose maltose khử trùng riêng biệt nồi hấp 40 phút 121C áp suất 20 psi Quy trình chọn lọc [29, 30] áp dụng để giảm thiểu không ổn định cấu trúc cấu trúc plasmid q trình chuẩn bị tiền ni cấy Nghiên cứu lên men Văn hóa hàng loạt Ni cấy lơ thực lị phản ứng sinh học có khuấy tùy chỉnh với thể tích làm việc 1,2 l hoạt động chế độ lơ, 300 vịng / phút 30C Chúng cấy vào mơi trường bình 60 ml nuôi cấy qua đêm môi trường chọn lọc YNB-G PH nuôi cấy theo dõi điện cực pH Ingold kiểm soát mức 5,0 cách thêm axit NaOH 1,0 M axit HCl 1,0 M Kiểm soát bọt đạt nhờ chất chống tạo bọt Silicone [0,3% (w / v)] Tất thí nghiệm tiến hành ba lần Tất hóa chất thuộc loại phân tích lấy từ SigmaAldrich Co Inc (Oakville, ON, Canada) Các mẫu lên men lấy khoảng thời gian đặn để theo dõi tổng nồng độ tế bào, nồng độ glucose, tinh bột, ethanol glucoamylase độ ổn định plasmid Văn hóa liên tục Các thí nghiệm tiến hành lò phản ứng sinh học kiểu giường sợi (I-IL-AL-FBB) khơng vận vịng ngược (annulus sparged) Sơ đồ thiết lập thí nghiệm thể Hình Lò phản ứng sinh học airliftdriven vòng bên chứa vật liệu dạng dạng sợi quấn xoắn ốc có cột hình trụ (ID: 0,106 m) chứa ống hút đồng tâm bên (ống xuống) cao 0,35 m đường kính 0,06 m Lị phản ứng sinh học, với tổng thể tích làm việc l, làm Plexiglas (polymethyl methacrylate) bao bọc lớp áo nước để kiểm soát nhiệt độ Ống dự thảo định vị cột lị phản ứng vách ngăn thép khơng gỉ giữ thẳng đứng từ đầu thép không gỉ Khe hở đáy hb đáy ống dự thảo đế giữ không đổi 0,059 m Lị phản ứng sinh học khơng vận bao gồm bốn phần: tách khí-lỏng mở rộng, ống nâng, ống dẫn xuống phần Bộ tách khí - lỏng (Ds = 0,257 m), ống nâng (hình khuyên) (Dr = Dc - Dd = 0,032 m) ống xuống (ống nháp) (Dd = 0,060 m) có tiết diện hình trịn Sự kết hợp riser-downcomer cho Ar / Ad 1,84 thể tích lị phản ứng sinh học 9,0 x 10 -3 m Tỷ lệ khung hình (Ld / Dc) lò phản ứng sinh học 3,43 Giá trị tỷ lệ dựa chiều cao ống xuống (bỏ qua mực chất lỏng thiết bị phân tách) [19–21] Lò phản ứng sinh học trang bị đầu dò hòa tan (DO) điện cực pH để theo dõi DO pH, sau trì nhiệt độ khơng đổi cách tuần hồn nước nhiệt độ khơng đổi qua áo nước lị phản ứng sinh học Khi khơng khí vơ trùng lọc đưa vào lò phản ứng sinh học thơng qua máy trộn vịng, tuần hồn mơi trường ổn định (chất lỏng) tạo suốt lò phản ứng sinh học chênh lệch mật độ khối ống nâng ống xuống (ống dự thảo), cung cấp trộn lẫn chuyển chất dinh dưỡng đến sinh khối Đối với công ty khởi nghiệp, lò phản ứng sinh học ban đầu cho ăn với mơi trường chọn lọc YNBG Lị phản ứng sinh học cấy với 13,3% mẫu cấy cũ 48 nuôi môi trường chọn lọc Nuôi cấy phép phát triển 20 lò phản ứng sinh học Hình Hình ảnh lị phản ứng sinh học vòng đảo ngược Sau mật độ tế bào nước thải đạt đến giá trị trạng thái ổn định, trình lên men chuyển sang giai đoạn sản xuất glucoamylase cách cho lị phản ứng sinh học với mơi trường giàu YEPG khơng chọn lọc tỷ lệ pha lỗng chọn Trừ có quy định khác, lị phản ứng sinh học trì 30 o C sục khí tốc độ dịng khí thể tích l / phút (tức 0,028 m / s, vvm) thông qua hệ thống cột sợi thủy tinh đóng gói nối tiếp với 0,2- lm lọc lỗ chân lơng Độ căng oxy hịa tan lị phản ứng sinh học trì 60% theo dõi thông qua điện cực oxy hòa tan Độ pH lò phản ứng sinh học theo dõi điện cực pH Ingold kiểm soát 5,0 ± 0,05 cách thêm axit NaOH 2,0 M axit HCl 2,0 M Kiểm soát bọt đạt nhờ chất chống tạo bọt Silicone [0,3% (w / v)] Tất thí nghiệm tiến hành trùng lặp Để nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ pha loãng, mẫu cấy liên tục vận hành bốn tốc độ pha loãng khác nhau, 0,05, 0,10, 0,20 0,37 / h Các mẫu nước thải từ lò phản ứng sinh học lấy khoảng thời gian đặn xét nghiệm để biết tổng nồng độ tế bào, nồng độ D-glucose, ethanol glucoamylase, chất ổn định plasmid Phương pháp phân tích Nồng độ tế bào tự đo phương pháp trọng lượng khô mật độ quang học Trọng lượng khô xác định cách ly tâm 20 ml mẫu ống ly tâm 25 ml tốc độ 5.000 vòng / phút (1.5009g) để tách tế bào khỏi môi trường lên men qua sử dụng Phần phía lưu trữ để sử dụng giai đoạn phân tích Các tế bào rửa nước khử ion hai lần sau làm khơ qua đêm 90–108 o C Mật độ quang học (OD) môi trường lên men đo 600 nm (OD600) cuvet thạch anh ml máy quang phổ UV / VIS (752S, Micro Photonics Inc., Allentown, PA) Các mẫu pha loãng OD600 0,3 Mối tương quan trọng lượng tế bào khô (N) mật độ quang (OD) xác định N = 1,6835 OD (R = 0,9986, R2 = 0,9971) Nồng độ glucose môi trường lên men xác định cách sử dụng xét nghiệm glucose GAGO20-kiT (Sigma số 027K8600) Các mẫu từ dung dịch tinh bột phân tích theo phương pháp mơ tả Kilonzo et al [17] Zhang cộng [29] Nồng độ ethanol xác định enzyme alcohol dehydrogenase theo phương trình sau [17]: Và phương pháp mô tả [17, 18] Mỗi hỗn hợp phản ứng (5 ml) chứa 75 mM natri PPi, 21 mM glycine, 75 mM Semarbazide HCl, 1,35 mM β-NAD, etanol [0,005– 0,03% (v / v)] 0,12 mg cồn đông khô dehydrogenase (Sigma, số A7011) PH hỗn hợp sau phản ứng 8,7 nhiệt độ phản ứng 30 o C Hình Sơ đồ thiết lập lị phản ứng sinh học vịng đảo ngược để ni cấy nấm men tái tổ hợp liên tục Ký hiệu: S nồng độ chất ban đầu S, E, P chất, etanol nồng độ sản phẩm Nồng độ tế bào mang plasmid X + (hoặc N + ), X - (hoặc N - ) tương ứng Phản ứng bắt đầu cách thêm 0,1 ml mẫu chứa etanol pha lỗng thích hợp vào ống phản ứng Sau ủ 12 phút, NADH giảm tạo xác định cách đo độ hấp thụ bước sóng 340 nm Hoạt tính glucoamylase xác định theo sửa đổi xét nghiệm mô tả Zhang [29, 30] Để 0,3 ml dung dịch enzym, 0,5 ml dung dịch tinh bột hòa tan 1,5% 0,7 ml dung dịch đệm axetat 0,2 M (pH 5,0) thêm vào ủ 37C 30 phút Người ta ngừng phản ứng cách thêm 2,0 ml H2SO4 M vào ống phản ứng Lượng đường khử (glucose) tạo phản ứng xét nghiệm với dụng cụ glucose (trừ có quy định khác) Một đơn vị hoạt độ glucoamylase định nghĩa lượng enzyme ml để tạo lmol glucose tương đương phút từ tinh bột hòa tan dung dịch đệm citrate 0,2 M pH 5,0 37 o C [17] Tỷ lệ tế bào chứa plasmid đo cách so sánh số lượng khuẩn lạc phát triển đĩa môi trường không chọn lọc không chọn lọc Các mẫu từ môi trường lên men mẫu cấy phát triển tích cực pha lỗng (1 x 10 -5 - x 10 -6 ) đến khoảng 1.000 tế bào / ml kỹ thuật vô trùng Khoảng 100 ll mẫu pha loãng (1 x 10 -5 - x 10 -6 ) trải lên hai đĩa thạch chọn lọc YNBG không chọn lọc YEPG (mỗi đĩa năm đĩa) [29, 30], sau ủ 30 o C ngày Tất tế bào sống sót nhân lên đĩa thạch không chọn lọc YEPG, tế bào mang plasmid phát triển đĩa thạch chọn lọc YNB-D Người ta tìm thấy phần nhỏ tế bào mang plasmid cách đếm đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) hai loại đĩa (100–300 khuẩn lạc đĩa) Tất số lượng đĩa lấy từ mức trung bình năm lần lặp lại Kết thảo luận Động học bể nuôi cấy Sự phát triển môi trường chọn lọc YNBG Động học sản xuất glucoamylase từ S cerevisiae tái tổ hợp nuôi cấy môi trường chọn lọc YNBG thể Hình Glucose tiêu thụ hoàn toàn để tăng trưởng tế bào sản xuất etanol Trong giai đoạn này, glucoamylase tạo promoter ENOL bị kìm hãm glucose Sau cạn kiệt glucose, ethanol sử dụng để tiếp tục phát triển tế bào sản xuất glucoamylase Như dự đoán, tỷ lệ tế bào mang plasmid trình lên men dao động khoảng 93% Do đó, việc sản xuất glucoamylase tăng cường đáng kể Điều rõ ràng môi trường chọn lọc quan trọng để trì ổn định plasmid sản xuất glucoamylase Năng suất tế bào tăng trưởng glucose 0,21 ± 0,02 0,02 ± 0,00 g / g tế bào mang plasmid khơng có plasmid, tương ứng Cần lưu ý sản xuất glucoamylase nấm men tái tổ hợp có liên quan đến tăng trưởng [4] Glucoamylase tạo protein nội bào giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân Tuy nhiên, số protease phát giải phóng vào mơi trường pha tĩnh [3] Đây lý nồng độ glucoamylase giảm điều kiện chọn lọc (Hình 3) Tốc độ tăng trưởng, sản lượng suất cụ thể môi trường nuôi cấy đường glucose tóm tắt Bảng Tăng trưởng mơi trường khơng chọn lọc YEPG Động học q trình sản xuất glucoamylase từ S cerevisiae C468 / pGAC9 tái tổ hợp nuôi cấy môi trường không chọn lọc YEPG thể Hình Glucose lần tiêu thụ để tăng trưởng tế bào sản xuất ethanol Trong giai đoạn này, khơng có glucoamylase sản xuất nêu Sau glucose tiêu thụ, ethanol sử dụng làm nguồn carbon để tế bào tiếp tục phát triển, lượng lớn glucoamylase sản xuất thời kỳ Sản xuất glucoamylase nuôi cấy lô liên quan đến tăng trưởng; hoạt động GA tăng lên giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân, gần không thay đổi giai đoạn tĩnh Tỷ lệ tế bào tạo plasmid liên tục giảm xuống khoảng 72% Sản lượng tế bào thu từ phát triển glucose 0,52 ± 0,13 0,08 ± 0,01 g / g tế bào mang plasmid tế bào khơng có plasmid Lơ ni cấy đạt hoạt độ glucoamylase tối đa 181 U / l Hình Động học sản xuất GA (glucoamylase) theo lơ trồng mơi trường chọn lọc YNBG có chứa glucose làm nguồn carbon Phần nhỏ, phần nhỏ tế bào mang plasmid tổng số quần thể; EtOH, nồng độ etanol; N + , tế bào mang plasmit; N , tế bào không chứa plasmid Bảng Động học sản xuất glucoamylase ni cấy lơ Hình Động học sản xuất GA (glucoamylase) theo lô ni mơi trường khơng chọn lọc YEPG có chứa glucose làm nguồn carbon Phần nhỏ, phần nhỏ tế bào mang plasmid tổng số quần thể; EtOH, nồng độ etanol; N + , tế bào tạo plasmidcarrying; N - , tế bào không chứa plasmid So sánh tốc độ tăng trưởng cụ thể (µ), suất tế bào (Y N / S ), suất sản phẩm (Y P / S ), suất GALase cụ thể (Y P / N ), suất thể tích (P) suất cụ thể (P / N + ) cho Bảng Năng suất cụ thể xác định từ suất thể tích chia cho nồng độ tế bào mang plasmid, N + Như thể Hình 4, phần tế bào tạo plasmid giảm xuống mức thấp vào cuối giai đoạn hàm mũ, sau gần mức cũ cạn kiệt glucose Điều kết khác biệt tốc độ chết chậm tế bào mang plasmid tế bào khơng có plasmid (dữ liệu khơng hiển thị) Nồng độ tế bào mang plasmid tế bào khơng có plasmid mơi trường ni cấy ước tính từ tổng mật độ tế bào phần nhỏ tế bào mang plasmid môi trường ni cấy Như Hình 4, nồng độ tế bào mang plasmid liên quan đến tổng nồng độ tế bào nuôi cấy theo lô tăng lên theo thời gian nuôi cấy so với tế bào không mang plasmid (dữ liệu không hiển thị) Như thấy Bảng 1, tăng trưởng nhanh sản xuất glucoamylase cao thu với YEPG không chọn lọc so với môi trường chọn lọc YNBG Do đó, nghiên cứu ni cấy liên tục sau đó, mơi trường YNBG sử dụng để khởi động lò phản ứng sinh học YEPG để sản xuất glucoamylase Động học trình ni cấy liên tục Dữ liệu thời gian ni cấy liên tục bốn tốc độ pha lỗng khác (0,05, 0,10, 0,20 0,37 giờ) thể Hình 5, 6, 8, tương ứng Như thể Hình 5, 8, lò phản ứng sinh học hoạt động tốc độ pha loãng 0,1 / h (xem Hình 8) Đúng dự đoán, phần tế bào mang plasmid liên tục giảm xuống 10% suốt thời gian nuôi cấy 120 h Để phản ứng với thay đổi từ môi trường chọn lọc sang môi trường không chọn lọc, sản xuất glucoamylase (GA) ban đầu tăng lên mức cao Sau giảm dần, sau xảy tượng plasmid môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, giảm sản xuất GA lò phản ứng sinh học nói chung chậm tốc độ plasmid Ngồi ra, tỷ lệ pha lỗng 0,2 / h Hình Sản xuất GA lị phản ứng sinh học khơng vận liên tục tốc độ pha lỗng 0,05 / h (lị phản ứng sinh học số 1) Hình Sản xuất GA lị phản ứng sinh học khơng vận liên tục tốc độ pha lỗng 0,10 / h (lị phản ứng sinh học số 3) Hình Sản xuất GA lị phản ứng sinh học khơng vận liên tục tốc độ pha loãng 0,20 / h (lị phản ứng sinh học số 4) Hình Sản xuất GA lị phản ứng sinh học khơng vận liên tục tốc độ pha loãng 0,37 / h (lò phản ứng sinh học số 6) Như hiển thị Hình 5, 6, 8, suất cụ thể giảm tốc độ pha loãng thấp 0,10 / h 86 h cuối giai đoạn nuôi cấy Nấm men tái tổ hợp sử dụng nghiên cứu có số lượng thấp báo cáo [29] Vì suất cụ thể thường tỷ lệ thuận với số lượng sao, việc sản xuất glucoamylase khơng ổn định gia tăng số lượng plasmid thấp Ai biết số lượng plasmid thay đổi theo điều kiện nuôi cấy thường tăng tế bào nuôi cấy tốc độ tăng trưởng thấp (pha lỗng) [29] Điều giải thích hoạt động glucoamylase giảm với tốc độ chậm so với phần tế bào mang plasmid Sự gia tăng số lượng plasmid số lượng hệ cao trình ni cấy liên tục, tế bào mang plasmid có số lượng plasmid tốc độ tăng trưởng cao (pha loãng)> 0,1 / h nên plasmid với tốc độ nhanh tế bào có số lượng cao tốc độ phát triển (pha loãng) thấp