Đang tải... (xem toàn văn)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP SEMINAR KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM – NNP614 Học viên thực hiện Giảng viên hướng dẫn PHAN VĂN ĐÔNG – M2221003 PGs Ts NGUYỄN CÔNG HÀ.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP SEMINAR KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM – NNP614 Học viên thực hướng dẫn Giảng PHAN VĂN ĐƠNG – M2221003 CƠNG HÀ PGs Lớp: Cơng Nghệ Thực Phẩm –K28 Ts viên NGUYỄN Cần Thơ 2022 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH VÀ MỞ RỘNG QUY MÔ SẢN XUẤT NẤM ARYL ALCOHOL OXIDASE TỪ ASPERGILLUS NIDULANS BIẾN ĐỔI GEN TRONG BỂ PHẢN ỨNG SINH HỌC CÓ CÁNH KHUẤY Mục lục TÓM TẮT TỪ KHÓA: Giới thiệu Vật liệu phương pháp 2.1 Phương tiện nuôi cấy căng thẳng 2.2 Tối ưu hóa thơng số quy trình .7 2.3 Lên men bể phản ứng sinh học có khuấy 2.4 Ảnh hưởng việc kiểm soát độ pH sản xuất AAO .9 2.5 Ảnh hưởng oxy hòa tan (DO) đến sản xuất AAO .10 2.6 Cô đặc, lọc phần xác minh AAO 10 2.7 Xác định hoạt tính AAO, nồng độ protein maltose nồng độ 12 Kết thảo luận 13 3.1 Tối ưu hóa thơng số quy trình sản xuất AAO 13 3.2 Quy mô sản xuất AAO bể phản ứng sinh học có cánh khuấy 15 3.3 Ảnh hưởng việc kiểm soát độ pH sản xuất AAO quy mơ lị phản ứng sinh học 17 3.4 Tác động oxy hịa tan (DO) q trình sản xuất AAO quy mơ lị phản ứng sinh học 19 3.5 Cô đặc, lọc phần xác minh AAO 20 Kết luận .23 Tài liệu tham khảo 23 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH VÀ MỞ RỘNG QUY MƠ SẢN XUẤT NẤM ARYL ALCOHOL OXIDASE TỪ ASPERGILLUS NIDULANS BIẾN ĐỔI GEN TRONG BỂ PHẢN ỨNG SINH HỌC CÓ CÁNH KHUẤY tác giả: Enshi Liua, Mark R Wilkins a a,b,c,* Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE 68583, USA b Industrial Agricultural Products Center, University of Nebraska- Lincoln, Lincoln, NE 68583, USA c Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE 68588, USA TÓM TẮT Vi sinh vật sản xuất aryl alcohol oxidase (AAO) ngày thu hút ý vai trò trung tâm AAO trình khử phân giải lignin enzym Tuy nhiên, sản xuất quy mô lớn AAO chưa đạt được-nguyên nhân dẫn đến suất thấp trình lên men hiệu Nghiên cứu nhằm mục đích tối ưu hóa thơng số q trình mở rộng quy mơ sản xuất AAO cách sử dụng Aspergillus nidulans bể phản ứng sinh học có khuấy Ảnh hưởng pH hịa tan đặc biệt nghiên cứu đặc biệt nghiên cứu ôxy sản xuất AAO quy mô lò phản ứng sinh học Kết cho thấy kiểm soát độ pH ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất protein tăng mức oxy hịa tan kích thích sản xuất AAO Các hoạt động AAO lớn (1906 U / L) nồng độ protein (1,19 g / L) đạt 48 60% hòa tan oxy với độ pH kiểm soát mức 6,0 Năng suất sản lượng (trong 48 giờ) 31,2 U / g maltose 39,7 U / L / h, tương ứng Ngồi ra, AAO thơ đặc tinh chế phần siêu lọc xác minh nhận dạng protein TỪ KHÓA: Các enzym phân giải lignin Lên men chìm Tăng quy mơ lên men kiểm sốt độ pH Kiểm sốt oxy hịa tan Giới thiệu Aryl alcohol oxidase (AAO, EC 1.1.3.7) flavoenzyme từ nấm mà xúc tác q trình oxy hóa nhiều loại rượu thơm béo rượu no đa chức thành anđehit tương ứng khử oxy thành hydro peroxit (H2O2) đồng thời (Ferreira cộng sự, Năm 2005; Hernández-Ortega cộng sự, 2011) Hoạt động AAO lần tìm thấy Polystictus versicolor (Farmer cộng sự, 1960) phát loại nấm thối trắng khác (ví dụ: Pleurotis eryngii Bjerkandera adusta), sinh vật chịu trách nhiệm tạo chất lignin sinh học phân cấp (Guillén cộng sự, 1994; Muheim cộng sự, 1990b; Varela cộng sự, 2000) Là enzym quan trọng tham gia vào trình phân hủy lignin, AAO nhận quan tâm sâu sắc khả cung cấp H2O2 tế bào cho peroxidase ligninolytic, chẳng hạn lignin peroxidase mangan peroxidase (Alcalde, 2015; Hernández-Ortega cộng sự, 2012) Nó hứa hẹn sử dụng AAO, kết hợp với ligninolytic peroxidase, trình khử phân tử lignin, trình trung tâm cho chuyển đổi sinh khối lignocellulosic thành nhiên liệu, hóa chất vật liệu ngành cơng nghiệp lọc sinh học tương lai (Carro cộng sự, 2016; Liu cộng sự, 2018; Ragauskas cộng sự, 2014) Hơn nữa, AAO áp dụng để toxi hóa 5-hydroxymethylfurfural, khử màu thuốc nhuộm anthraquinon, tăng cường sản xuất polyhydroxybutyrate từ tiền xử lý kiềm rượu (Feldman cộng sự, 2015; Galperin cộng sự, 2016; Li cộng sự, 2019) Mặc dù ứng dụng rộng rãi AAO, enzyme khơng thương mại hóa có sẵn phần suất sản xuất AAO thấp Do đó, quan trọng để phát triển cơng nghệ lên men hiệu chi phí cho quy mô sản xuất AAO với suất sản lượng cao Nhiều nghiên cứu tập trung vào việc lọc AAO từ nấm thối trắng sản xuất AAO từ sinh vật tái tổ hợp (ví dụ: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae Aspergillus nidulans) thơng qua biểu protein dị hợp (Muheim cộng sự, 1990a; Pardo-Planas cộng sự, 2017b; Ruiz-Dueñas cộng sự, 2006; Varela cộng sự, 2001; Viña-Gonzalez cộng sự, 2015) Trong số nỗ lực khác nhau, sản xuất AAO từ nấm sợi biến đổi gen nhận suy giảm ngày tăng-vì khả tiết protein cao đặc biệt hệ thống sửa đổi sau phiên dịch (Nevalainen & Peterson, 2014) Tuy nhiên, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc xây dựng chủng tái tổ hợp đặc tính enzym (Couturier cộng sự, 2016; Kumar & Goswami, 2006; Varela cộng sự, 2001) Một số nghiên cứu sản xuất AAO thực quy mô nhỏ tạo sản lượng enzyme thấp (Liu cộng sự, 2020; Pardo-Planas cộng sự, Năm 2018; Pardo-Planas cộng sự, 2017b) Tối ưu hóa quy trình quy mô lớn sản xuất AAO nghiên cứu Mở rộng quy mơ q trình lên men tối ưu hóa quy trình chìa khóa chiến lược công nghệ sinh học để tăng suất sản xuất lớn lượng sản phẩm trì chất lượng sản phẩm quán(Schmidt, 2005) Để tăng suất sản phẩm (hoặc trì suất tương tự quan sát quy mơ nhỏ), điều quan trọng phải hiểu kiểm sốt q trình mở rộng quy mơ hệ thống lên men (Hewitt & Nienow, 2007) Một số yếu tố, bao gồm nhiệt độ, pH, sục khí, oculum có tác động đến phát triển lên men vi sinh vật (Hellmuth & van den Brink, 2013) Đặc biệt, kiểm sốt pH q trình vi sinh sản xuất enzym từ nấm sợi có tác dụng quan trọng phát triển sợi nấm, bào tử sản xuất enzyme (Abubakar et al., 2013; Niaz cộng sự, 2014; Sohail cộng sự, 2009) Ngoài ra, oxy cung cấp trình lên men chìm quan trọng cho phát triển vi khuẩn trì sản xuất chất chuyển hóa (Garcia-Ochoa & Gomez, 2009) Ví dụ, oxy hịa tan (DO) tác động trực tiếp đến trình truyền oxy suất enzyme / sản phẩm cuối trình nấm sợi lên men cố vấn (Abdella cộng sự, 2020; Meneghel cộng sự, 2014; Zhang cộng sự, 2012) Do đó, điều quan trọng phải hiểu tối ưu hóa độ pH DO kiểm sốt quy mô lên men nấm sợi Trong nghiên cứu trước chúng tôi, phương tiện hiệu chi phí để có suất cao phụ hợp sản xuất AAO cách sử dụng Aspergillus nidulans tái tổ hợp phát triển (Liu cộng sự, 2020) Gen AAO từ Myceliophthora thermophila, chứa nhiều loại enzym thủy phân sinh khối chứng minh nguồn gen tốt mã hóa điều hịa nhiệt độ zymes (Visser cộng sự, 2011) Nghiên cứu nhằm mục đích tối ưu hóa quy trình lên men mở rộng quy mô sản xuất AAO cách sử dụng chủng biến đổi gen (A nidulans) bể phản ứng sinh học có cánh khuấy Các thơng số quy trình (cụ thể phương pháp cấy, nhiệt độ, in- pH phần kích thước chất cấy) trình sản xuất AAO tối ưu hóa bình lắc Ngồi ra, ảnh hưởng kiểm soát pH DO AAO sản xuất bể phản ứng sinh học có khuấy nồng độ AAO khác phương pháp làm phần nghiên cứu Nghiên cứu cung cấp dịch tiềm nghiên cứu AAO sang công nghiệp hành nghề thương mại Vật liệu phương pháp 2.1 Phương tiện nuôi cấy căng thẳng A nidulans biến đổi gen sử dụng làm vật chủ sản xuất cho biểu AAO dị hình Sự căng thẳng lắng đọng Fungal nuôi cấy Di truyền (FGSC, Manhattan, Kansas, U.S.) với iden- số hiệu A773 Chủng A nidulans mang genti- thao tác cally cách biến đổi plasmid pEXPYR có chứa Gen AAO từ Myceliophthora thermophila (còn gọi Thermothelomyces thermophilus) vào hệ gen nấm, mô tả nơi khác (Pardo-Planas cộng sự, 2017a; Segato cộng sự, 2012) Ở đó- chủng tái tổ hợp hờn dỗi chủng gây maltose, tiết tích lũy AAO phương tiện truyền thông Sản xuất AAO thực môi trường phức hợp chứa 61,0 g / L maltose, 26,4 g / L CSL (rượu ngô), 13,8 g / L NaNO3 mô tả nghiên cứu trước (Liu cộng sự, 2020) Tất hóa chất thuốc thử thuộc loại phân tích 2.2 Tối ưu hóa thơng số quy trình Việc tối ưu hóa thơng số quy trình cho sản xuất AAO dẫn cách sử dụng 50 ml mơi trường bình lắc 250 ml khuấy 250 RPM 72 lồng ấp (Máy lắc nhiệt MaxQ Thermo Fisher Scientific, HOA KỲ) Môi trường hấp tiệt trùng 121 ° C 20 phút (Hirayama HV- 50 Autoclave, Japan) trước cấy.Ảnh hưởng phương pháp tiêm chủng sản xuất AAO:không áp dụng phương pháp cấy cách sử dụng phương pháp cấy hạt khác nhau, bao gồm Bảo quản −80 ° C, bào tử phát triển đĩa PDA (Potato Dextrose Agar), viên tế bào, so sánh đánh giá Nhiệt độ -80 ° C dung dịch chứa bào tử A nidulans 20% glixerol 10% lactose bảo quản -80 ° C Các bào tử phát triển đĩa PDA chuẩn bị cách thêm 50 μl dung dịch bào tử vào môi trường PDA rắn lan truyền đồng Các đĩa ủ 37 ° C 48 trước thu hoạch bào tử lơ lửng NaCl 0,9% khử trùng dung dịch Hỗn dịch bào tử giữ ° C trước sử dụng Viên tế bào điều chế cách phát triển bào tử A nidulans 50 ml khoai tây dextrose canh 37 ° C 40–44 h Viên tế bào thu hoạch cách ly tâm 4000 RPM (3360 g) 10 phút rửa NaCl 0,9% khử trùng dung dịch Để so sánh hiệu việc sử dụng phương pháp cấy hạt khác sản xuất AAO, nồng độ bào tử khơng đổi (~ × 108 bào tử / ml) sử dụng cho tất thí nghiệm phần Sản xuất AAO thực 37 ° C với pH môi trường ban đầu 6,5 1% (v / v) chất cấy (0,5 ml bào tử viên tế bào 50 ml môi trường lên men) Ảnh hưởng nhiệt độ đến sản xuất AAO: Ảnh hưởng dif- nhiệt độ ferent sản xuất AAO xác định cách so sánh Hoạt động AAO 30, 32, 34, 36, 37, 38 40 ° C PH môi trường ban đầu điều chỉnh thành 6,5 1% mẫu cấy sử dụng Ảnh hưởng pH ban đầu đến sản xuất AAO: Ảnh hưởng pH trung bình sản xuất AAO nghiên cứu cách điều chỉnh pH trung bình đến 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 7,5 trước hấp tiệt trùng NaOH M dung dịch Sản xuất AAO thực 37 ° C với viên 1% tế bào chất cấy Ảnh hưởng chất cấy (%, v / v) đến sản xuất AAO: Ảnh hưởng kích thước chất cấy trình sản xuất AAO tiến hành cách sử dụng tế bào viên 1, 2, 4, 6, 10% (v / v) thể tích q trình lên men vừa phải Sản xuất AAO thực 37 ° C với môi trường ban đầu pH = 6,0 2.3 Lên men bể phản ứng sinh học có khuấy 10 (Budak cộng sự, 2014) Nghiên cứu sâu cần tiến hành để xác định protease ảnh hưởng đến sản xuất AAO để loại bỏ phân hủy protein AAO Hoạt động AAO lớn quan sát q trình mở rộng quy mơ 1520 U / L (hoạt động trung bình hai lần lặp lại) với nồng độ protein 1,08 g / L, lớn đáng kể bình lắc (1021 U / L với 0,75 g / L protein) Hơn nữa, sản lượng suất (trong 72 giờ) AAO lò phản ứng sinh học 24,9 U / g maltose 21,1 U / L / h, tương ứng, lớn so với quan sát bình lắc (16,8 U / g maltose 14,2 U / L / h) Kết chứng minh AAO sản xuất cải thiện đáng kể bể phản ứng sinh học có khuấy so sánh với bình lắc khả thi mặt kỹ thuật đạt quy mô lớn 3.3 Ảnh hưởng việc kiểm soát độ pH sản xuất AAO quy mơ lị phản ứng sinh học Người ta chứng minh biểu thức số ví dụ enzyme tracellular A nidulans kiểm soát pH trung bình (Caddick cộng sự, 1986; Luque cộng sự, 2004) Kết từ việc tối ưu hóa thơng số quy trình pH môi trường ban đầu ảnh hưởng đến hoạt động AAO cuối Hơn nữa, độ pH trung bình trình sản xuất AAO trong- bị nhăn theo thời gian (như Hình 4) khơng kiểm sốt độ pH.Do đó, điều quan trọng phải hiểu tác động việc kiểm soát độ pH AAO sản xuất bể phản ứng sinh học có cánh khuấy Hình 3A minh họa so sánh hoạt động AAO nồng độ protein trình sản xuất 21 AAO lị phản ứng sinh học có kiểm sốt pH khơng kiểm sốt pH (pH tự nhiên) AC- dựa vào liệu thử nghiệm, thay đổi hoạt động AAO theo thời gian độ pH tự nhiên độ pH kiểm soát gần giống hệt nhau, có nghĩa khơng có khác biệt đáng kể hoạt động AAO quan sát thấy Vĩ đại Hoạt động AAO (60 giờ) pH tự nhiên pH kiểm soát 1527 U / L 1523 U / L, tương ứng Tuy nhiên, nồng độ protein (ở 60 giờ) pH tự nhiên pH kiểm soát 1,33 g / L 1,06 g / L, tương ứng Nồng độ protein pH tự nhiên đáng kể lớn độ pH kiểm soát, khác biệt hàm lượng protein trung tâm (1,66 g / L 1,22 g / L cho pH tự nhiên pH kiểm sốt, tương ứng) chí lớn 72 Các protein từ pH tự nhiên trình lên men pH kiểm sốt SDS-PAGE phân tích thành điều tra lý nồng độ protein khác hoạt động AAO tương tự pH tự nhiên pH kiểm sốt AC- mã hóa kết SDS-PAGE mơ tả Hình 3B, dải AAO, có khối lượng phân tử ~ 87 kDa, phân đoạn rõ ràng gel Ngoài ra, đường pH kiểm soát trực quan so với tự nhiên pH gel Protein peptit ~ 65 kDa rõ ràng không rõ ràng pH tự nhiên, khơng có protein peptit quan sát thấy pH kiểm soát Những kết chứng minh protein khơng đích tạo từ A nidulans cách kiểm sốt- pH ling Do đó, pH mức 6,0 kiểm sốt q trình sản xuất AAO bể phản ứng sinh học có khuấy 22 Ngồi việc khảo sát yếu tố kiểm soát pH trình sản xuất AAO, ổn định hoạt động kiểm sốt pH hóa chất khác (tức M H2SO4 + M NaOH M H2SO4 + M NH 4OH) nghiên cứu Sự thay đổi pH tự nhiên trình sản xuất AAO bể phản ứng sinh học có khuấy minh họa Hình Độ pH ban đầu thấp chút 6,0 Sau đó, độ pH bắt đầu tăng vào khoảng 36 giờ, AAO bắt đầu để tích lũy Độ pH tăng lên ~ 7,5 khoảng 48 trì ~ 7,5 kết thúc trình lên men Độ pH trình sản xuất AAO đặt mức 6,0 ± 0,2 điều khiển quy định để thực axit tự động bổ sung sở Ban đầu, M H2SO4 + M NH4OH sử dụng để điều chỉnh độ pH, amoni sử dụng nguồn nitơ Độ pH trì thành công mức ~ 6,0 36 sau thay đổi thường xuyên pH quan sát từ 36 đến 72 Độ pH dao động gây việc thêm nhiều H2SO4 NH4OH vấn đề tạo bọt, khiến trình lên men khó kiểm sốt Ngồi ra, H2SO4 M NaOH M sử dụng để kiểm soát độ pH (như Hình 4) Theo ghi pH, độ pH trình AAO sản xuất trì tốt mức khoảng 6,0 mà khơng có q nhiều thất bại điều chỉnh Do đó, H2SO4 NaOH chọn làm chất kiểm sốt pH q trình sản xuất AAO bể phản ứng sinh học có khuấy 3.4 Tác động oxy hòa tan (DO) q trình sản xuất AAO quy mơ lị phản ứng sinh học 23 A nidulans loại nấm sợi cần sục khí đáng kể (Abdella cộng sự, 2020; Panagiotou cộng sự, 2009), DO đóng vai trị vai trị quan trọng sản xuất AAO Hình minh họa thay đổi DO kích động (thay đổi thủ cơng) q trình sản xuất AAO bể phản ứng sinh học Lưu lượng khơng khí đặt VVM, tương đối tốc độ dịng khí cao so sánh với nghiên cứu khác với A Nidulans (Abdella cộng sự, 2020) Như thể Hình 5, DO giảm xuống gần 0% 20 với tốc độ kích động 300 RPM Sau đó, muốn trì DO mức 40% cách tăng kích động theo cách thủ công tốc độ, vận tốc DO tăng lên khoảng 40% đạt đến tốc độ kích động 500 vòng / phút; nhiên, DO giảm xuống 10% từ 20 đến 30 trình sản xuất AAO DO trì mức ~ 40% từ 30 đến 48 tốc độ kích động tăng lên 800 RPM Sau 48 giờ, khó trì DO 25%, tốc độ kích động trong- tăng lên 1000 RPM tốc độ dịng khí VVM Một giới hạn tiềm nănga- Điểm mấu chốt nghiên cứu thu thập sinh khối nấm liệu (sẽ hữu ích để hiểu rõ phát triển nấm quy trình sản xuất) chất rắn khơng hòa tan CSL ảnh hưởng đến xác định sinh khối Kết mặt di truyền chủng A nidulans sửa đổi để sản xuất AAO yêu cầu lượng đáng kể lượng oxy để sản xuất enzyme tổng thể AAO pro- trình khử q trình hạn chế oxy Do đó, điều quan trọng phải- xác định ảnh hưởng DO sản xuất AAO bể sinh học có cánh khuấy eactor 24 Hình cho thấy tác động mức DO khác hoạt động AAO nồng độ protein trình sản xuất AAO bể khuấy trộn bior- eactor Các mức DO khác kiểm soát chức thác nước lò phản ứng sinh học với dải lưu lượng khơng khí từ 0,75 đến VVM kích động dao động từ 300 đến 1000 RPM Hoạt động AAO protein trung tâm đạt đến cực đại, 1491 U / L 1,10 g / L, 72 DO kiểm soát mức 20% Khi DO tăng lên 40%, hoạt động AAO lớn (1676 U / L) nồng độ protein (1,07 g / L) phát lúc 60 Khi DO kiểm soát mức 60%, AAO ac- trọng lượng nồng độ protein tăng đáng kể 48 giờ, bắt đầu giảm sau 48 phân hủy protein (như phân đề cập Phần 3.2) Hoạt động AAO lớn protein nồng độ 60% DO 1906 U / L 1,19 g / L Các suất suất (trong 48 giờ) 31,2 U / g maltose 39,7 U / L / h, tương ứng Theo kết quả, hoạt động AAO (hoạt động trung bình trùng lặp) 60% lớn đáng kể so với 40% 20% LÀM Hơn nữa, hoạt động 40% DO lớn đáng kể so với mức DO 20% Kết chứng minh DO% tăng lên, AAO hoạt động tăng lên Theo cài đặt tầng với mức tối đa tốc độ dịng khí VVM bể phản ứng sinh học có khuấy, trì DO 40% trình sản xuất AAO Tuy nhiên, 60% DO khơng đạt khơng tăng phần trăm oxi khí dịng chảy, có nghĩa oxy tinh khiết yêu cầu để trì DO 60% Mặc dù hoạt động AAO 60% DO cao 230 U / L so với 40% DO thời gian lên men ngắn hơn, chi phí oxy tinh khiết khơng khơng đáng kể 25 Kết là, hoạt động AAO 1906 U / L (60% DO, với nguồn cung oxy) 1676 U / L (40% DO khơng có oxy) đánh bóng Mặc dù hoạt động AAO 60% DO lớn 40% NÊN, giới thiệu oxy tinh khiết để sản xuất AAO tốn cơng việc Do đó, khuyến nghị kiểm sốt DO q trình AAO pro- Đấu giá cho hoạt động công nghiệp thực khơng có thêm cơng nghệ phân tích kinh tế 3.5 Cơ đặc, lọc phần xác minh AAO Sau mở rộng quy mô sản xuất AAO, enzyme thô sản xuất tập trung tinh chế phần thông qua phương pháp khác Bảng tóm tắt ba phương pháp khác nhau, bao gồm (NH4) 2SO4 muối ra(kết tủa protein), siêu lọc với PES (polyethersulfone) màng, siêu lọc với RC (cellulose tái sinh) mem- brane, để cô đặc tinh chế phần AAO thô Theo bàn tinh chế, AAO thô tập trung thành hoạt động > 6000 U / L siêu lọc (cả màng PES RC 10 kDa) Mặc dù gần 5000 U / L hoạt động AAO thu cách tập trung làm phần cách sử dụng (NH4) 2SO4 muối ra, mức thấp tỷ lệ phục hồi thời gian xử lý lâu (qua đêm) hạn chế ứng dụng tion nồng độ AAO lọc Ngược lại, hai cực phương pháp lọc có tỷ lệ thu hồi lớn 96% hoàn thành 45 phút 50 ml AAO thô Trang bị siêu lọc với màng PES chọn cho nồng độ AAO phần lọc, tốc độ thu hồi lọc cao chút nếp gấp Quá trình lọc gấp lại cách sử dụng nồng độ khác phần tất phương pháp tinh chế gần 26 1, độ tinh khiết AAO sản xuất từ A nidulans cao Điều chứng minh gel SDS-PAGE Trong nghiên cứu tương tự, AAO từ Pleurotus eryngii thể A nidulans, nhựa Sephacryl S-200 ion Mono-Q cột trao đổi yêu cầu để loại bỏ protein khơng đích tạp chất nhỏ (Varela cộng sự, 2001) Ngoài ra, AAO thể E coli cô đặc tinh chế phương pháp sắc ký, bao gồm đặc, thẩm tách ly tâm 20 để loại bỏ tạp chất protein khơng mở (Ruiz-Duas cộng sự, 2006) Quá trình tổng thể tốn nhiều thời gian suất đạt khoảng 70%, thấp 96% nghiên cứu Con AAO thô- kết tập trung tinh chế phần tiết lộ độ tinh khiết AAO từ A nidulans cao khơng có phương pháp lọc tiên tiến u cầu để tinh chế enzym thô Hơn nữa, AAO xác định xác minh LC-MS / MS sau tinh chế phần MS / Hồ sơ MS tìm kiếm chống lại M thermophila (nguồn gen AAO), chứa nhiều loại sinh khối-thủy phân-enzyme-en- mã hóa gen (Visser cộng sự, 2011) Kết chứng minh protein protein giống enzyme oxy hóa GMC (Glucose-Methanol-Choline) với độ phủ trình tự 42% (Bảng 1) Vì AAO thuộc GMC siêu họ oxidoreductase (Hernández-Ortega cộng sự, 2012), AAO sản xuất từ A nidulans biến đổi gen xác minh Sản xuất AAO thực nghiên cứu sâu rộng, nghiên cứu tập trung vào việc mở rộng quy mô sản xuất AAO nuôi cấy ngập nước Pardo-Planas cộng (2018) tiến hành sản xuất AAO liên 27 tục từ A nidulans sử dụng lị phản ứng nhỏ giọt với tổng thể tích 1,1 L, hoạt động AAO lớn đạt 65,1 U / L, gần 30 thấp lần so với hoạt động nghiên cứu Ngoài ra, giá trị tối đa suất imum (1,43 U / g maltose) suất (2,2 U / L / h) thấp đáng kể so với nghiên cứu (31,2 U / g maltose 39,7 U / L / h, tương ứng) Hơn nữa, để so sánh cơng AAO sản xuất lị phản ứng liên tục lị phản ứng lơ tại, tổng số hoạt động AAO tạo ngày (24 giờ) tính tốn Pardo- Planas cộng (2018) tạo hoạt động tối đa 58,1 U / ngày lò phản ứng liên tục, thấp 24,6 lần so với lò phản ứng có cánh khuấy (1429,2 U / ngày mức hoạt động tối đa quan sát) Varela cộng (2001) biểu AAO từ Pleurotus eryngii A Nidulans sử dụng glucose làm chất tạo hoạt tính tối đa 400–500 U / L, thấp đáng kể so với 1906 U / L mức nghiên cứu Hoạt động enzym nghiên cứu lớn đáng kể so với AAO tạo vật chủ A nidulans (Galperin cộng sự, 2016; ViñaGonzalez cộng sự, 2018) Ví dụ, Galperin et al (2016) thực sản xuất AAO từ Coprinopsis cinerea tái tổ hợp Bể phản ứng sinh học có khuấy 7,5 L (với thể tích làm việc L) đạt đến Hoạt động AAO lên đến 125 U / L, thấp 15 lần so với Hoạt động AAO đạt nghiên cứu Ngoài ra, sản lượng lợi nhuận độ dẻo AAO cải thiện đáng kể so sánh với sản xuất AAO quy mô nhỏ (50 ml) (với sản lượng suất 16,8 U / g maltose 14,2 U / L / h, tương ứng) nghiên cứu trước 28 (Liu cộng sự, 2020) Theo hiểu biết chúng tôi, hoạt động AAO năm 1906 U / L với Protein 1,19 g / L hoạt tính AAO lớn công bố Nghiên cứu cung cấp sở cho nghiên cứu tương lai sản xuất ngập nước AAO sử dụng nấm sợi quy mô lớn Kết luận Nghiên cứu khảo sát việc tối ưu hóa thơng số q trình quy mơ-sản xuất AAO từ ni cấy chìm A.nidulansin tái tổ hợp bể phản ứng sinh học có khuấy Đặc biệt, tác động pH DO trình sản xuất AAO điều tra đánh giá Các kết chứng minh sản xuất AAO khả thi mặt kỹ thuật để thực quy mô lớn suất suất cải thiện đáng kể bể phản ứng sinh học có cánh khuấy Ngồi ra, kiểm sốt độ pH làm giảm sản xuất protein không mục tiêu mức DO cao có lợi cho việc sản xuất AAO Hoạt động AAO lớn 1906 U / L với 1,19 g / L protein đạt pH 6,0 60% oxy hòa tan Tài liệu tham khảo Abdella, A., Segato, F., Wilkins, M.R., 2019 Optimization of nutrient medium compo- nents for production of a client endo-β-1, 4xylanase from Aspergillus fumigatus var niveus using a recombinant Aspergillus nidulans strain Biocatal Agric Biotechnol 20, 101267 Abdella, A., Segato, F., Wilkins, M.R 2020 Optimization of process parameters and fermentation strategy for xylanase production in a stirred tank reactor using a mutant Aspergillus nidulans strain Biotechnol Rep., e00457 29 Abubakar, A., Suberu, H., Bello, I., Abdulkadir, R., Daudu, O., Lateef, A., 2013 Effect of pH on mycelial growth and sporulation of Aspergillus parasiticus J Plant Sci (4), 64–67 Alcalde, M., 2015 Engineering the ligninolytic enzyme consortium Trends Biotechnol 33 (3), 155–162 Benson, A.M., Hunkeler, M.J., Talalay, P., 1980 Increase of NAD (P) H: quinone re-ductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity Proc Natl Acad Sci U.S.A 77 (9), 5216–5220 Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72 (1–2), 248– 254 Budak, S.O., Zhou, M., Brouwer, C., Wiebenga, A., Benoit, I., Di Falco, M., Tsang, A., de Vries, R.P., 2014 A genomic survey of proteases in Aspergilli BMC Genomics 15 (1), 523 Caddick, M.X., Brownlee, A.G., Arst, H.N., 1986 Regulation of gene expression by pH of the growth medium in Aspergillus nidulans Mol Gen Genet 203 (2), 346–353 Carro, J., Serrano, A., Ferreira, P., Martínez, A.T., 2016 Fungal arylalcohol oxidase in lignocellulose degradation and bioconversion in: Microbial Enzymes in Bioconversions of Biomass, Springer, pp 301-322 Couturier, M., Mathieu, Y., Li, A., Navarro, D., Drula, E., Haon, M., Grisel, S., Ludwig, R., Berrin, J.-G., 2016 Characterization of a new aryl-alcohol oxidase secreted by the phytopathogenic fungus Ustilago maydis Appl Microbiol Biotechnol 100 (2), 697–706 Eibes, G.M., Lú-Chau, T., Ruiz-Duas, F., Feij, G., Martínez, M.J., Martínez, A., Lema, J.M., 2009 Effect of culture temperature on the heterologous expression of Pleurotus eryngii versatile peroxidase in Aspergillus hosts Bioproc Biosyst Eng 32 (1), 129 Farmer, V., Henderson, M.E., Russell, J., 1960 Aromatic-alcoholoxidase activity in the growth medium of Polystictus versicolor Biochem J 74 (2), 257 30 Feldman, D., Kowbel, D.J., Glass, N.L., Yarden, O., Hadar, Y., 2015 Detoxification of 5- hydroxymethylfurfural by the Pleurotus ostreatus lignolytic enzymes aryl alcohol oxidase and dehydrogenase Biotechnol Biofuels (1), 63 Ferreira, P., Medina, M., Guillén, F., Martínez, M.J., Van Berkel, W.J., Martínez, Á.T., 2005 Spectral and catalytic properties of arylalcohol oxidase, a fungal flavoenzyme acting on polyunsaturated alcohols Biochem J 389 (3), 731–738 Galperin, I., Javeed, A., Luig, H., Lochnit, G., Rühl, M., 2016 An arylalcohol oxidase of Pleurotus sapidus: heterologous expression, characterization, and application in a 2- enzyme system Appl Microbiol Biotechnol 100 (18), 8021–8030 Garcia-Ochoa, F., Gomez, E., 2009 Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in mi-crobial processes: an overview Biotechnol Adv 27 (2), 153–176 Gouka, R., Punt, P., Van Den Hondel, C., 1997 Efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects Appl Microbiol Biotechnol 47 (1), 1–11 Guillén, F., Martínez, A., Martínez, M., Evans, C., 1994 Hydrogenperoxide-producing system of Pleurotus eryngii involving the extracellular enzyme aryl-alcohol oxidase Appl Microbiol Biotechnol 41 (4), 465–470 Hellmuth, K., van den Brink, J., 2013 Microbial production of enzymes used in food applications in: Microbial Production of Food Ingredients, Enzymes and Nutraceuticals, Elsevier, pp 262287 Hernández-Ortega, A., Borrelli, K., Ferreira, P., Medina, M., Martinez, A.T., Guallar, V., 2011 Substrate diffusion and oxidation in GMC oxidoreductases: an experimental and computational study on fungal aryl-alcohol oxidase Biochem J 436 (2), 341–350 Hernández-Ortega, A., Ferreira, P., Martínez, A.T., 2012 Fungal arylalcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation Appl Microbiol Biotechnol 93 (4), 1395– 1410 Hewitt, C.J., Nienow, A.W., 2007 The scale-up of microbial batch and fed-batch fer- mentation processes Adv Appl Microbiol 62, 105–135 31 Kumar, A.K., Goswami, P., 2006 Functional characterization of alcohol oxidases from Aspergillus terreus MTCC 6324 Appl Microbiol Biotechnol 72 (5), 906–911 Li, M., Eskridge, K., Liu, E., Wilkins, M., 2019 Enhancement of polyhydroxybutyrate (PHB) production by 10-fold from alkaline pretreatment liquor with an oxidative enzyme-mediatorsurfactant system under Plackett-Burman and central composite designs Bioresour Technol 281, 99–106 Liu, E., Li, M., Abdella, A., Wilkins, M.R., 2020 Development of a cost-effective medium for submerged production of fungal aryl alcohol oxidase using a genetically modified Aspergillus nidulans strain Bioresour Technol 305, 123038 Liu, E., Li, M., Das, L., Pu, Y., Frazier, T., Zhao, B., Crocker, M., Ragauskas, A.J., Shi, J., 2018 Understanding lignin fractionation and characterization from engineered switchgrass treated by an aqueous ionic liquid ACS Sustain Chem Eng (5), 6612–6623 E Liu and M.R Wilkins Bioresource Technology 315 (2020) 123792 Luque, R., Orejas, M., Perotti, N.I., Ramon, D., Lucca, M.E., 2004 pH control of the production of recombinant glucose oxidase in Aspergillus nidulans J Appl Microbiol 97 (2), 332–337 Meneghel, L., Reis, G.P., Reginatto, C., Malvessi, E., da Silveira, M.M., 2014 Assessment of pectinase production by Aspergillus oryzae in growthlimiting liquid medium under limited and non-limited oxygen supply Process Biochem 49 (11), 1800–1807 Muheim, A., Leisola, M.S., Schoemaker, H.E., 1990a Aryl-alcohol oxidase and lignin peroxidase from the white-rot fungus Bjerkandera adusta J Biotechnol 13 (2–3), 159–167 Muheim, A., Waldner, R., Leisola, M.S., Fiechter, A., 1990b An extracellular aryl- lcohol oxidase from the white-rot fungus Bjerkandera adusta Enzyme Microb Technol 12 (3), 204–209 Nevalainen, H., Peterson, R., 2014 Making recombinant proteins in filamentous fungi- re we expecting too much? Front Microbiol 5, 75 Niaz, M., Iftikhar, T., Qureshi, F.F., Niaz, M., 2014 Extracellular Lipase Production by Aspergillus nidulans (MBL-S-6) under Submerged Fermentation Int J Agric Biol 16 (3), 536–542 32 Panagiotou, G., Grotkjær, T., Hofmann, G., Bapat, P.M., Olsson, L., 2009 Overexpression of a novel endogenous NADH kinase in Aspergillus nidulans enhances growth Metab Eng 11 (1), 31–39 Pardo-Planas, O., Atiyeh, H.K., Prade, R.A., Müller, M., Wilkins, M.R., 2018 Continuous aryl alcohol oxidase production under growthlimited conditions using a trickle bed reactor Bioresour Technol 255, 149–155 Pardo-Planas, O., Prade, R.A., Müller, M., Atiyeh, H.K., Wilkins, M.R., 2017a Prevention of melanin formation during aryl alcohol oxidase production under growth-limited conditions using an Aspergillus nidulans cell factory Bioresour Technol 243, 874– 882 Pardo-Planas, O., Prade, R.A., Wilkins, M.R., 2017b High-yield production of aryl alcohol oxidase under limited growth conditions in small-scale systems using a mutant Aspergillus nidulans strain J Ind Microbiol Biotechnol 44 (2), 247–257 Ragauskas, A.J., Beckham, G.T., Biddy, M.J., Chandra, R., Chen, F., Davis, M.F., Davison, B.H., Dixon, R.A., Gilna, P., Keller, M., 2014 Lignin valorization: improving lignin processing in the biorefinery Science 344 (6185), 1246843 Ruiz-Duas, F.J., Ferreira, P., Martínez, M.J., Martínez, A.T., 2006 In vitro activation, purification, and characterization of Escherichia coli expressed aryl-alcohol oxidase, a unique H2O2-producing enzyme Protein Expr Purif 45 (1), 191–199 Schmidt, F., 2005 Optimization and scale up of industrial fermentation processes Appl Microbiol Biotechnol 68 (4), 425– 435 Segato, F., Damỏsio, A.R., Gonỗalves, T.A., de Lucas, R.C., Squina, F.M., Decker, S.R., Prade, R.A., 2012 High-yield secretion of multiple client proteins in Aspergillus Enzyme Microb Technol 51 (2), 100–106 Sohail, M., Siddiqi, R., Ahmad, A., Khan, S.A., 2009 Cellulase production from Aspergillus niger MS82: effect of temperature and pH New Biotechnol 25 (6), 437–441 Talabardon, M., Yang, S.T., 2005 Production of GFP and glucoamylase by recombinant Aspergillusniger: effects of fermentation conditions on fungal morphology and pro- tein secretion Biotechnol Prog 21 (5), 1389–1400 33 Varela, E., Guillén, F., Martınez, Á.T., Mart ́ ınez, M.a.J 2001 Expression of Pleurotus eryngii aryl-alcohol oxidase in Aspergillus nidulans: purification and characterization of the recombinant enzyme Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol., 1546(1), 107-113 Varela, E., Martinez, A., Martinez, M., 2000 Southern blot screening for lignin peroxidase and aryl-alcohol oxidase genes in 30 fungal species J Biotechnol 83 (3), 245–251 Vasina, J.A., Baneyx, F., 1997 Expression of aggregation-prone recombinant proteins at low temperatures: a comparative study of the Escherichia coli cspA and tac promoter Systems Protein Expr Purif (2), 211–218 Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A.T., Alcalde, M., 2015 Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in Saccharomyces cerevisiae by using chimeric signal peptides Appl Environ Microbiol 81 (18), 6451–6462 Viña-Gonzalez, J., Elbl, K., Ponte, X., Valero, F., Alcalde, M., 2018 Functional expression of aryl-alcohol oxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris by directed evolution Biotechnol Bioeng 115 (7), 1666–1674 Visser, H., Joosten, V., Punt, P.J., Gusakov, A.V., Olson, P.T., Joosten, R., Bartels, J., Visser, J., Sinitsyn, A.P., Emalfarb, M.A., 2011 Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1 Ind Biotechnol (3), 214–223 Yoon, J., Maruyama, J.-I., Kitamoto, K., 2011 Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins Appl Microbiol Biotechnol 89 (3), 747–759 Zhang, J., Liu, L., Li, J., Du, G., Chen, J., 2012 Enhanced glucosamine production by Aspergillus sp BCRC 31742 based on the timevariant kinetics analysis of dissolved oxygen level Bioresour Technol 111, 507–511 34 35 ... 2022 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH VÀ MỞ RỘNG QUY MÔ SẢN XUẤT NẤM ARYL ALCOHOL OXIDASE TỪ ASPERGILLUS NIDULANS BIẾN ĐỔI GEN TRONG BỂ PHẢN ỨNG SINH HỌC CÓ CÁNH KHUẤY Mục lục TÓM TẮT TỪ KHÓA:... khảo 23 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH VÀ MỞ RỘNG QUY MƠ SẢN XUẤT NẤM ARYL ALCOHOL OXIDASE TỪ ASPERGILLUS NIDULANS BIẾN ĐỔI GEN TRONG BỂ PHẢN ỨNG SINH HỌC CÓ CÁNH KHUẤY tác giả: Enshi Liua,... 3.1 Tối ưu hóa thơng số quy trình sản xuất AAO 13 3.2 Quy mô sản xuất AAO bể phản ứng sinh học có cánh khuấy 15 3.3 Ảnh hưởng việc kiểm soát độ pH sản xuất AAO quy mô lò phản